CN110373378A - 一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型及其构建方法和应用，以静电纺纳米纤维膜为肠道细胞的载体材料，将分离的肠道细胞接种到该载体材料表面，培养直至形成完整的肠道细胞层并分化出小肠绒毛，获得具备完善生物活性和生理功能的体外肠道模型。本发明基于静电纺纳米纤维膜与天然细胞外基质相似的三维结构，实现对天然细胞外基质结构的仿生模拟，大幅提升原代肠道细胞在载体材料表面黏附和生长的性能。所构建的模型具有模仿真实肠道的能力，可以广泛用于营养物质和药物组分的吸收和转运分析，快捷、准确地评估营养物质和药物的吸收能力和生物利用度，也可用于评估肠道微生物定殖或相互作用，有可用于组织工程的使用。

Description

一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型及其构建方法和应用。
背景技术
体外肠道吸收模型被广泛用于药物和营养物质吸收的评估，其吸收性数据被用于早期药物开发和营养物质开发的体外快速分析和筛选。近十余年来，国内外已普遍采用细胞模型作为药物和营养物质等成分的肠道吸收模型。其中Caco-2 肠道细胞模型来源于人的结肠癌细胞，是著名的小肠吸收模型，已被发达国家的药物研究机构或开发公司广泛采用，是目前最为经典的一种体外肠道模型。作为一种附着依赖型细胞，Caco-2细胞最常见的培养模型是单层贴壁培养模型。 Caco-2细胞一般培养在具有渗透性的多孔高分子膜上，并制作成插入式滤膜 (permeable insert)的形式，如商业化的Transwell@、Millicell@等产品。其高分子膜材料通常使用半透明的聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)，或透明的聚酯(Polyester， PET)和聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)等膜材料。在这类膜材料上， Caco-2肠道细胞至少需要培养21天，才能充分分化并表达出较为接近人体小肠上皮的功能。因此这种培养模型仍需投入大量的人力、物力与时间，同时也增加了细胞在培养过程中受到污染的危险，而且其实验通量仍不够高，导致其应用仍存在一定的限制。
而众所周知，Caco-2细胞是来源于人的结肠癌细胞，癌细胞系在培养的过程中，会出现基因突变的加速积累、正常生理反应的丧失以及对组织培养生长的适应能力，使得它们与原代细胞的培养存在显著差异。因此，基于Caco-2细胞建立的体外肠道模型仅具有肠道的小部分生理功能，并不能再现正常的小肠细胞谱系和功能。鉴于此，麻省理工学院的研究者(CN105358677A)将Lgr5+肠道上皮干细胞从肠道中分离并在体外培养形成含有隐窝-绒毛结构的类器官，所述的类器官重现天然小肠上皮(Sato等，2009)。但是，干细胞的分离难度大，分离成本高。更为重要的是，Lgr5+肠道上皮干细胞体外培养获得的是球形的类器官，肠道上皮层分布在所形成的封闭球形类器官的内腔，给后续评估药物和营养物质等在肠道界面吸收、转运、代谢的能力及生物利用度等工作带来了极大的不便，其吸收实验操作需在显微镜下通过微针注射完成，该干细胞形成的类器官并不能很好地模拟肠道界面的吸收。时至今日，以原代细胞或干细胞在体外构建大面积的肠道界面仍然是一个世界难题。因此，急需发展一种培养周期短、且成本低的原代肠道细胞体外模型构建方法，可更真实地模拟肠道界面，在面向医药、营养和组织工程的非临床和临床系统中具有重要作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型及其构建方法和应用，以静电纺纤维膜为原代肠道细胞培养的载体材料，通过表面图案化和化学改性，为肠道细胞提供理想的黏附、铺展和生长的仿生微环境，促进肠道细胞在载体材料表面快速贴壁生长，并形成完整细胞单层，分化出小肠上皮的生理功能，从而具备模拟真实肠道的能力。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
本发明的目的之一在于提供一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，以静电纺纳米纤维膜为原代肠道细胞的载体材料，将原代肠道细胞接种到该材料表面，培养直至形成完整的肠道细胞层并分化出小肠绒毛，获得具备完善的生物活性和生理功能的体外肠道模型。
作为本发明优选的方案，将静电纺纳米纤维膜材料固定到含培养基的腔室中间作为隔层材料，然后将原代肠道细胞接种到该材料表面培养，直至形成完整的肠道细胞层，并获得具备完善生物活性和生理功能的体外肠道模型。
作为本发明优选的方案，所述的分离的肠道细胞包括从肠道组织中分离的单细胞、细胞团和隐窝。
作为本发明优选的方案，所述的分离的肠道细胞包括从从小肠和大肠中分离的肠道细胞。
作为本发明优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜的材料包括天然聚合物或合成聚合物及其衍生物中的一种或几种，天然聚合物或合成聚合物及其衍生物具体为胶原蛋白、成纤蛋白、角蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、纤维素、壳聚糖、海藻酸、结冷胶、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚酯、聚酰胺、聚丙烯、聚乙烯、聚乳酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚苹果酸、聚羟基脂肪酸酯等及其衍生物类，生物相容性较好的材料，做成静电纺纳米纤维膜作为本发明载体材料应用时具有较好的效果。更优选的，本发明采用静电纺丝所使用的纺丝溶液包括熔融型溶液和溶剂型溶液。
作为本发明优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜中的纤维尺寸为静电纺技术可制备的所有尺寸，一般在50nm-5000nm范围内，但不局限于此。
作为本发明优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜的厚度，一般在1μm-200μm 范围内，但不局限于此。
作为本发明优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜材料可经过表面改性处理，也可不经过表面改性处理。
作为本发明优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜材料采用蛋白、肽、氨基酸、糖、糖肽、糖脂、磷脂、脂肪酸、生长因子等天然或合成的单一组分或复合组分对其表面进行化学组分改性处理。其中化学组分改性的方法有共混、浸涂、化学键固定等。
作为本发明优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜材料采用压印法、模板法等方法对其表面进行改性处理，得到图案化的静电纺纳米纤维膜材料。
作为本发明优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜材料采用压印法、模板法等方法制备得到图案化的静电纺纳米纤维膜材料，其图案为直径为50-500μm左右的凸起或凹坑，与肠道上皮的绒毛和隐窝结构类似。
作为本发明优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜使用时可单独使用，也可复合到多孔材料表面，所述多孔材料包括有机和无机的多孔材料。
作为本发明优选的方案，所述多孔材料为多孔膜、无纺布或金属网中的一种。
作为本发明优选的方案，所述原代肠道细胞体外肠道模型使用的培养基为Advanced DMEM/F12培养基，在此基础上添加1％HEPES(1M)、1％Anti-Anti (100X)和1％GlutaMAX，并在每mL培养基中添加50μL R-spondin、5μL EGF、10μL Y2763210、10μL N-acetyl cysteine、10μL N-2、20μL B27、1μL LDN-193189等细胞因子。
本发明的目的之二在于提供由所述方法构建的基于原代肠道细胞的体外肠道模型。
本发明的目的之三在于提供所述基于原代肠道细胞的体外肠道模型在评估药物、营养物质吸收能力或生物利用度中的应用。
本发明的目的之四在于提供所述基于原代肠道细胞的体外肠道模型在评估肠道微生物定殖或相互作用中的应用。
本发明的目的之五在于提供所述基于原代肠道细胞的体外肠道模型在评估肠道其他生物或生理现象的应用。
本发明的目的之六在于提供所述基于原代肠道细胞的体外肠道模型在组织工程中的应用，修复受损肠道上皮组织。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，本发明主要利用静电纺纳米纤维膜作为原代肠道细胞的载体材料，基于静电纺纳米纤维膜与天然细胞外基质相似的三维结构，实现对天然细胞外基质结构的仿生模拟，大幅提升原代肠道细胞在载体材料表面黏附和生长的性能。本发明所构建的模型具有模仿真实肠道的能力，可以广泛用于营养物质和药物组分的吸收和转运分析，快捷、准确地评估营养物质和药物的吸收能力和生物利用度，也可用于评估肠道微生物定殖或相互作用，有可用于组织工程的使用。该模型具有理想的稳定性和可重复性，为食品、医药及临床医学等领域提供了一种快捷方便可靠的工具。
本发明同目前大量采用的Caco-2细胞模型相比，具有如下优点：
本发明构建的体外肠道模型具有正常肠道上皮的细胞谱系组成，可模拟正常肠道的生理功能；Caco-2细胞模型由癌细胞组成，生理功能等指标与正常肠道上皮组成存在较大差异。
本发明构建的体外肠道模型具有快速形成细胞单层的能力，肠道组织中分离出的单细胞、细胞团或隐窝中含有干细胞，增殖分化能力强，2-4天即可形成完整的原代细胞单层；相比之下，Caco-2细胞模型是依赖癌细胞自身的增殖形成细胞单层。
本发明构建的体外肠道模型中原代肠道细胞单层形成微绒毛的速度快，在形成细胞单层的同时在表面分化出大量小肠微绒毛。
本发明构建的体外肠道模型中的采用的静电纺纳米纤维膜，其三维结构与天然细胞外基质相似，能很好地仿生细胞外基质的结构，具有隔离组织、支撑细胞及提供细胞锚定位点的功能，是细胞固定的适宜载体，静电纺纳米纤维膜的微纳米尺度拓扑结构为原代肠道细胞提供了理想的黏附和生长微环境；传统Caco-2 细胞模型采用聚合物微孔膜为细胞培养的载体材料，载体材料的物理结构存在显著差异。
本发明构建的体外肠道模型可用于营养物质和药物组分的吸收转运分析。
本发明构建的体外肠道模型可用于评估肠道微生物定殖或相互作用。
本发明构建的静电纺纳米纤维膜可用于修复受损肠道界面。
本发明同国外发明的肠道类器官模型相比，具有如下优点：
本发明构建的体外肠道模型以分离的肠道原代细胞为细胞源，与分离的干细胞相比，操作简单，成本低廉，细胞量来源充足。
本发明构建的体外肠道模型形成的是大面积的肠道上层细胞界面层，不是密闭的类器官形态，更容易开展吸收转化及相互作用等研究。
附图说明
图1为本发明构建的体外肠道模型结构示意图(1为外容器，2为外容器溶液，3为内容器，4为内容器溶液，5为静电纺丝纳米纤维膜材料，6为原代肠道细胞层)。
图2为本发明构建的体外肠道动态模型结构示意图(1为上腔室，2为下腔室，3为静电纺丝纳米纤维膜复合材料，4为Caco-2细胞单层，5为上盖，6为上腔室溶液进口，7为上腔室溶液出口，8为下盖，9为下腔室溶液进口，10为下腔室溶液出口)。
图3为(a)静电纺纳米纤维膜和(b)图案化的静电纺纳米纤维膜。
图4为静电纺纳米纤维膜培养小肠隐窝的扫描电镜照片。
图5为静电纺纳米纤维膜培养小肠隐窝后表层细胞分化的小肠绒毛的扫描电镜照片。
图6为静电纺纳米纤维膜培养原代肠道细胞后的激光共聚焦照片，蓝色为细胞核。
图7为静电纺纳米纤维膜培养原代肠道细胞后的激光共聚焦照片，蓝色为细胞核，红色为杯状细胞，绿色为紧密连接。
图8为本发明构建的体外肠道动态模型黏附的微生物。
具体实施方式
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述，但又不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或与本发明所述的领域相关的普通技术人员和科研人员通常所理解的条件进行。
实施例1、以静电纺醋酸纤维素纳米纤维膜作为原代肠道细胞的载体材料构建体外肠道模型
体外肠道模型如图1所示，包括外容器1，内容器3，将纤维平均直径为180 nm的静电纺醋酸纤维素纳米纤维膜材料5固定到外容器1和内容器3形成的上下腔室中间作为上下腔室的隔层材料。静电纺醋酸纤维素纳米纤维膜材料的无图案化形貌如图3(a)所示，具有直径为250μm左右的图案化凹坑结构如图3(b) 所示。
小肠隐窝细胞的分离如下：取原代肠段，清洗干净后，剪成1mm左右的碎片，移入15ml离心管，加入10mL的EDTA(5mM)解离液，置于摇床上解离50min(其间换两次新鲜的解离液)；用PBS洗涤3次，开始边摇边收集隐窝 (先用100μm滤膜收集，再用70μm滤膜过滤)。收集完后放离心机1450r/min 离心5min，换空白培养基再次离心，去上清，根据细胞量加入适量细胞完全培养基重悬，得到隐窝悬液。
接种细胞前，先用1mg/mL基质胶溶液处理静电纺纳米纤维膜2h，吸掉多余的液体。将0.1mL隐窝悬液以1000个隐窝/mL的密度接种到图1所示的模型上腔中，该模型的下腔中加入0.6mL培养基。原代肠道细胞体外肠道模型使用的培养基为Advanced DMEM/F12培养基，在此基础上添加1％HEPES(1M)、 1％Anti-Anti(100X)和1％GlutaMAX，并在每mL培养基中添加50μL R-spondin、 5μL EGF、10μL Y2763210、10μL N-acetyl cysteine、10μL N-2、20μL B27、1 μL LDN-193189等细胞因子。在37℃下5％CO2的气氛中恒温培养。未形成完整细胞单层前每2天更换一次培养基，形成完整细胞单层后每天更换一次培养基。原代肠道细胞在静电纺醋酸纤维素纳米纤维膜表面黏附、铺展并生长。
培养3天后，原代肠道细胞即可在图案化的静电纺醋酸纤维素纳米纤维膜表面形成细胞层(图4)；静电纺醋酸纤维素纳米纤维膜表面的原代肠道细胞在形成完整的细胞层的同时，细胞快速分化出肠绒毛(图5)。基于静电纺醋酸纤维素纳米纤维膜构建了小肠原代肠道细胞的体外肠道模型。
实施例2、以静电纺壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维膜作为原代肠道细胞的载体材料构建体外肠道模型
体外肠道模型如图1所示，包括外容器1，内容器3，将纤维平均直径为700 nm静电纺壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维膜材料5固定到外容器1和内容器3形成的上下腔室中间作为上下腔室的隔层材料，静电纺壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维膜材料具有50μm左右的凹坑。
大肠隐窝细胞的分离如下：取原代肠段，清洗干净后，剪成1mm左右的碎片，移入15ml离心管，加入10mL的EDTA(5mM)解离液，置于摇床上解离20min(其间换两次新鲜的解离液)，再在37℃下酶解30min；用PBS洗涤 3次，开始边摇边收集隐窝(先用100μm滤膜收集，再用70μm滤膜过滤)。收集完后放离心机1450r/min离心5min，换空白培养基再次离心，去上清，根据细胞量加入适量细胞完全培养基重悬，得到隐窝悬液。
接种细胞前，先用1mg/mL基质胶溶液处理静电纺纳米纤维膜2h，吸掉多余的液体。原代肠道细胞体外肠道模型使用的培养基为Advanced DMEM/F12培养基，在此基础上添加1％HEPES(1M)、1％Anti-Anti(100X)和1％GlutaMAX，并在每mL培养基中添加50μL R-spondin、5μL EGF、10μL Y2763210、10μL N-acetyl cysteine、10μL N-2、20μL B27、1μLLDN-193189等细胞因子。将0.1 mL隐窝悬液以1000个隐窝/mL的密度接种到图1所示的模型上腔中，该模型的下腔中加入0.6mL培养基，在37℃下5％CO2的气氛中恒温培养。未形成完整细胞单层前每2天更换一次培养基，形成完整细胞单层后每天更换一次培养基。原代肠道细胞在静电纺壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维膜表面黏附、铺展并生长。
培养3-4天后，原代肠道细胞即可在静电纺壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维膜表面形成的细胞层；静电纺壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维膜表面的原代肠道细胞在形成完整的细胞层的同时，细胞快速分化出小肠绒毛。基于静电纺壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维膜构建了大肠原代肠道细胞的体外肠道模型。
实施例3、以静电纺聚乳酸/玉米蛋白纳米纤维膜作为原代肠道细胞载体材料构建体外肠道模型
体外肠道模型如图1所示，包括外容器1，内容器3，将纤维平均直径为1200 nm静电纺聚乳酸/玉米蛋白纳米纤维膜材料5固定到外容器1和内容器3形成的上下腔室中间作为上下腔室的隔层材料。
小肠隐窝细胞的分离如下：取原代肠段，清洗干净后，剪成1mm左右的碎片，移入15ml离心管，加入10mL的EDTA(5mM)解离液，置于摇床上解离50min(其间换两次新鲜的解离液)；用PBS洗涤3次，开始边摇边收集隐窝 (先用100μm滤膜收集，再用70μm滤膜过滤)。收集完后放离心机1450r/min 离心5min，换空白培养基再次离心，去上清，根据细胞量加入适量细胞完全培养基重悬，得到隐窝悬液。
接种细胞前，先用1mg/mL基质胶溶液处理静电纺纳米纤维膜2h，吸掉多余的液体。原代肠道细胞体外肠道模型使用的培养基为Advanced DMEM/F12培养基，在此基础上添加1％HEPES(1M)、1％Anti-Anti(100X)和1％GlutaMAX，并在每mL培养基中添加50μL R-spondin、5μL EGF、10μL Y2763210、10μL N-acetyl cysteine、10μL N-2、20μL B27、1μLLDN-193189等细胞因子。将0.1 mL隐窝悬液以1000个隐窝/mL的密度接种到图1所示的模型上腔中，该模型的下腔中加入0.6mL培养基，在37℃下5％CO2的气氛中恒温培养。未形成完整细胞单层前每2天更换一次培养基，形成完整细胞单层后每天更换一次培养基。原代肠道细胞在静电纺聚乳酸/玉米蛋白纳米纤维膜表面黏附、铺展并生长。
培养3-4天后，小肠原代肠道细胞即可在静电纺聚乳酸/玉米蛋白纳米纤维膜表面形成的细胞层；静电纺聚乳酸/玉米蛋白纳米纤维膜表面的小肠原代肠道细胞在形成完整的细胞层的同时，细胞快速分化出小肠绒毛。激光共聚焦显微镜照片显示细胞层中细胞的细胞核，表明大量肠道活细胞存在于纳米纤维膜表面 (图6)；同时，所形成的的细胞层中包含了多种肠道细胞(图7)。基于静电纺聚乳酸/玉米蛋白纳米纤维膜构建了小肠原代肠道细胞的体外肠道模型。
实施例4、以静电纺聚酰胺/糖脂纳米纤维膜作为原代肠道细胞载体材料构建体外肠道动态模型
体外肠道动态模型如图2所示，包括上腔室1，下腔室2，上盖5和下盖8，上腔室1与下腔室2之间固定静电纺丝纳米纤维膜3，上腔室1上还设置有上腔室溶液进口6和上腔室溶液出口7，下腔室2上还设置有下腔室溶液进口9和下腔室溶液出口10，静电纺丝纳米纤维膜膜上生长的原代肠道细胞层4。将纤维平均直径为350nm静电纺聚酰胺/大豆蛋白纳米纤维膜材料3固定到上腔室1和上腔室2之间作为上下腔室的隔层材料，静电纺聚酰胺/大豆蛋白纳米纤维膜材料具有直径250μm左右的凸起图案化结构。
小肠隐窝细胞的分离如下：取原代肠段，清洗干净后，剪成1mm左右的碎片，移入15ml离心管，加入10mL的EDTA(5mM)解离液，置于摇床上解离50min(其间换两次新鲜的解离液)；用PBS洗涤3次，开始边摇边收集隐窝 (先用100μm滤膜收集，再用70μm滤膜过滤)。收集完后放离心机1450r/min 离心5min，换空白培养基再次离心，去上清，根据细胞量加入适量细胞完全培养基重悬，得到隐窝悬液。
接种细胞前，先用1mg/mL基质胶溶液处理静电纺纳米纤维膜2h，吸掉多余的液体。原代肠道细胞体外肠道模型使用的培养基为Advanced DMEM/F12培养基，在此基础上添加1％HEPES(1M)、1％Anti-Anti(100X)和1％GlutaMAX，并在每mL培养基中添加50μL R-spondin、5μL EGF、10μL Y2763210、10μL N-acetyl cysteine、10μL N-2、20μL B27、1μLLDN-193189等细胞因子。将0.1 mL隐窝悬液以1000个隐窝/mL的密度接种到图2所示的模型上腔中，该模型的下腔中加入0.6mL培养基，在37℃下5％CO2的气氛中恒温培养。未形成完整细胞单层前每2天更换一次上下腔室的培养基，形成完整细胞单层后每天更换一次上下腔室的培养基。原代肠道细胞在静电纺聚酰胺/大豆蛋白纳米纤维膜表面黏附、铺展并生长。
培养3-4天后，小肠原代肠道细胞即可在静电纺聚酰胺/大豆蛋白纳米纤维膜表面形成的细胞层；静电纺聚酰胺/大豆蛋白纳米纤维膜表面的小肠原代肠道细胞在形成完整的细胞层的同时，细胞快速分化出小肠绒毛。基于静电纺聚酰胺 /大豆蛋白纳米纤维膜构建了小肠原代肠道细胞的体外肠道模型。
实施例5、以静电纺聚乳酸/胶原蛋白/磷脂纳米纤维膜作为原代肠道细胞载体材料构建体外肠道动态模型
体外肠道模型如图1所示，包括外容器1，内容器3，将纤维平均直径为800 nm静电纺聚乳酸/胶原蛋白/磷脂纳米纤维膜材料5固定到外容器1和内容器3 形成的上下腔室中间作为上下腔室的隔层材料，静电纺聚乳酸/胶原蛋白/磷脂纳米纤维膜材料以直径为150μm的圆柱体图案化模具压印而得图案化表面。
大肠隐窝细胞的分离如下：取原代肠段，清洗干净后，剪成1mm左右的碎片，移入15ml离心管，加入10mL的EDTA(5mM)解离液，置于摇床上解离20min(其间换两次新鲜的解离液)，再在37℃下酶解30min；用PBS洗涤 3次，开始边摇边收集隐窝(先用100μm滤膜收集，再用70μm滤膜过滤)。收集完后放离心机1450r/min离心5min，换空白培养基再次离心，去上清，根据细胞量加入适量细胞完全培养基重悬，得到隐窝悬液。
接种细胞前，先用1mg/mL基质胶溶液处理静电纺纳米纤维膜2h，吸掉多余的液体。原代肠道细胞体外肠道模型使用的培养基为Advanced DMEM/F12培养基，在此基础上添加1％HEPES(1M)、1％Anti-Anti(100X)和1％GlutaMAX，并在每mL培养基中添加50μL R-spondin、5μL EGF、10μL Y2763210、10μL N-acetyl cysteine、10μL N-2、20μL B27、1μLLDN-193189等细胞因子。将0.1 mL隐窝悬液以1000个隐窝/mL的密度接种到图1所示的模型上腔中，该模型的下腔中加入0.6mL培养基，在37℃下5％CO2的气氛中恒温培养。未形成完整细胞单层前每2天更换一次培养基，形成完整细胞单层后每天更换一次培养基。大肠原代肠道细胞在静电纺聚乳酸/胶原蛋白/磷脂纳米纤维膜表面黏附、铺展并生长。
培养3-4天后，原代肠道细胞即可在静电纺聚乳酸/胶原蛋白/磷脂纳米纤维膜表面形成的细胞层；静电纺聚乳酸/胶原蛋白/磷脂纳米纤维膜表面的大肠原代肠道细胞在形成完整的细胞层的同时，细胞快速分化出小肠绒毛。基于静电纺聚乳酸/胶原蛋白/磷脂纳米纤维膜构建了大肠原代肠道细胞的体外肠道模型。
实施例6、以静电纺聚丙烯/海藻酸纳米纤维膜作为原代肠道细胞载体材料构建体外肠道动态模型
体外肠道模型如图1所示，包括外容器1，内容器3，将纤维平均直径为1500 nm静电纺聚丙烯/海藻酸纳米纤维膜材料5固定到外容器1和内容器3形成的上下腔室中间作为上下腔室的隔层材料。
小肠隐窝细胞的分离如下：取原代肠段，清洗干净后，剪成1mm左右的碎片，移入15ml离心管，加入10mL的EDTA(5mM)解离液，置于摇床上解离50min(其间换两次新鲜的解离液)；用PBS洗涤3次，开始边摇边收集隐窝 (先用100μm滤膜收集，再用70μm滤膜过滤)。收集完后放离心机1450r/min 离心5min，换空白培养基再次离心，去上清，根据细胞量加入适量细胞完全培养基重悬，得到隐窝悬液。
接种细胞前，先用1mg/mL基质胶溶液处理静电纺纳米纤维膜2h，吸掉多余的液体。原代肠道细胞体外肠道模型使用的培养基为Advanced DMEM/F12培养基，在此基础上添加1％HEPES(1M)、1％Anti-Anti(100X)和1％GlutaMAX，并在每mL培养基中添加50μL R-spondin、5μL EGF、10μL Y2763210、10μL N-acetyl cysteine、10μL N-2、20μL B27、1μLLDN-193189等细胞因子。将0.1 mL隐窝悬液以1000个隐窝/mL的密度接种到图1所示的模型上腔中，该模型的下腔中加入0.6mL培养基，在37℃下5％CO2的气氛中恒温培养。未形成完整细胞单层前每2天更换一次培养基，形成完整细胞单层后每天更换一次培养基。原代肠道细胞在静电纺聚丙烯/海藻酸纳米纤维膜表面黏附、铺展并生长。
培养3-4天后，原代肠道细胞即可在静电纺聚丙烯/海藻酸纳米纤维膜表面形成的细胞层；静电纺聚丙烯/海藻酸纳米纤维膜表面的原代肠道细胞在形成完整的细胞层的同时，细胞快速分化出小肠绒毛。基于静电纺聚丙烯/海藻酸纳米纤维膜构建了小肠原代肠道细胞的体外肠道模型。
实施例7、体外肠道模型用于益生菌定殖的评估
按照前述方法以静电纺聚乳酸/胶原蛋白/磷脂纳米纤维膜材料构建的体外肠道模型用于益生菌定殖的评估。该模型上腔室4中分别加入含有益生菌(嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、双歧杆菌和植物乳杆菌)的Hank’s平衡盐溶液，下腔室2 中加入不含益生菌的Hank’s平衡盐溶液，该模型在37℃下培养。经过预定时间的培养后，将该模型中上腔室和下腔室的溶液取出作为样品，同时将模型中静电纺纳米纤维膜复合的细胞层整体移出。检测上下腔室溶液中的微生物数量，并采用扫描电镜对细胞层上面定殖的微生物进行分析，用于评估益生菌的定殖效果，结果如图8所示。扫描电镜图表明，构建的体外肠道模型中肠道细胞层表面定殖了部分益生菌。说明本方法构建的体外肠道模型可用于评估益生菌的定殖。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：以静电纺纳米纤维膜为肠道细胞的载体材料，将分离的肠道细胞接种到该载体材料表面，培养直至形成完整的肠道细胞层并分化出小肠绒毛，获得具备完善生物活性和生理功能的体外肠道模型。
2.根据权利要求1所述的一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：所述的分离的肠道细胞为单细胞、细胞团或隐窝中的一种或多种；所述分离的肠道细胞为从小肠或大肠中分离的肠道细胞。
3.根据权利要求1所述的一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：所述静电纺纳米纤维膜中的纤维尺寸为50nm-5000nm。
4.根据权利要求1所述的一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：所述静电纺纳米纤维膜表面采用蛋白、肽、氨基酸、糖、糖肽、糖脂、磷脂、脂肪酸、生长因子中的单一组分或复合组分进行化学组分改性处理。
5.根据权利要求1所述的一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：所述静电纺纳米纤维膜表面采用压印法、模板法进行改性处理，得到图案化的静电纺纳米纤维膜材料，所述的图案为直径为50-500μm的凸起或凹坑。
6.根据权利要求1所述的一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：
将静电纺纳米纤维膜固定到腔室中间作为隔层材料，分离的肠道细胞接种到该隔层材料表面。
7.根据权利要求1所述的一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：所述培养过程采用的培养基为Advanced DMEM/F12培养基，在此基础上添加1％HEPES(1M)、1％Anti-Anti(100X)和1％GlutaMAX，并在每mL培养基中添加50μL R-spondin、5μLEGF、10μL Y2763210、10μL N-acetyl cysteine、10μL N-2、20μL B27、1μL LDN-193189。
8.由权利要求1～7任一项所述方法构建的原代肠道细胞体外肠道模型。
9.权利要求8所述原代肠道细胞体外肠道模型在评估药物、营养物质吸收能力或生物利用度中的应用。
10.权利要求8所述原代肠道细胞体外肠道模型在评估肠道微生物定殖或在组织工程中的应用。
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