CN112410299A - 一种急性分离哺乳动物海马细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种急性分离哺乳动物海马细胞的方法，属于细胞分离领域。本发明的方法包括如下步骤：1)切片：在0～4℃下将海马剪碎；2)消化：用1～3mg/ml木瓜酶消化15～25min，吸出木瓜酶，用1～3mg/ml胶原酶消化15～25min，消化过程持续通入95％O2和5％CO2混合气体；3)终止：终止消化，洗去酶溶液，移入Neurobasal混合液；4)吹打：玻璃管轻柔吹打，静置，吸取上层混悬液加入培养皿；5)贴壁：室温下贴壁30～45min。本发明的方法省时高效，所得细胞质量高，可提高膜片钳实验的成功率。

Description

一种急性分离哺乳动物海马细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞分离领域。
背景技术
海马位于侧脑室下角底部，与人类的学习记忆关系密切，并具有特殊的皮层结构，且纤维联系较明确，因而对海马的研究一直是神经生理学、神经生物学、生理心理学工作研究的热点。
膜片钳技术是研究海马细胞的重要手段。该技术是用微玻管电极(膜片电极或膜片吸管)接触细胞膜，以千兆欧姆以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域(膜片)与其周围在电学上分隔，在此基础上固定点位，对此膜片上的离子通道的离子电流(pA级)进行监测记录的方法。因此，膜片钳技术对细胞质量要求高，不仅要求细胞具有形态学的完整，细胞膜脆性低，更要求各项生理学功能和离子通道的完整。对于不满足前述要求的细胞，膜片钳实验往往无法成功封接吸破，导致实验失败。
急性分离的哺乳动物海马细胞在功能和结构上接近生理状态，相对于细胞培养得到的细胞更加适用于开展膜片钳实验。但现有的急性分离方法仍然存在不利于膜片钳实验展开的问题：1)酶的孵育需要较长时间，不同酶的消化时间、温度难以确定，严重影响细胞质量，例如胰酶会直接损伤NMDA受体通道，链蛋白酶、木瓜酶对通道影响小但细胞膜脆性增大，难以形成适用于膜片钳封接吸破的单细胞；2)细胞成活率低，成活时间短。另外，现有的急性分离方法都在酶孵育前用氧饱和的人工脑脊液孵育50～60min，耗时较长。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种耗时短、细胞质量高、成活率高的急性分离哺乳动物海马的方法。
术语“海马”指大脑中的海马区，与海洋鱼类海马不同。
本发明的技术方案如下：
一种用于急性分离哺乳动物海马细胞的酶解方法，该方法包括：
使用木瓜酶和胶原酶先后消化海马组织碎块；
木瓜酶、胶原酶的工作浓度为1～3mg/ml，各自消化时长15～25min。
进一步地，所述胶原酶为I型胶原酶。
进一步地，木瓜酶浓度为2mg/ml，木瓜酶消化时间20min；
和/或，胶原酶浓度为2mg/ml，胶原酶消化时间20min。
一种急性分离哺乳动物海马细胞的方法，包括如下步骤：
1)切片：取海马组织，在0～4℃下将海马组织剪碎；
2)消化：用1～3mg/ml木瓜酶消化15～25min，吸出木瓜酶，用1～3mg/ml胶原酶消化15～25min，消化过程持续通入95％O2和5％CO2混合气体；
3)终止：终止消化，洗去酶溶液，移入Neurobasal混合液；
4)吹打：玻璃管轻柔吹打，静置，吸取上层混悬液加入培养皿；
5)贴壁：室温下贴壁30～45min。
进一步地，步骤1)的剪碎过程中，海马位于HBSS或DMEM培养基中。
进一步地，步骤1)中剪碎至1mm2的碎块。
进一步地，所述胶原酶为I型胶原酶。
进一步地，步骤2)中木瓜酶浓度为2mg/ml，消化时间20min；
和/或，胶原酶浓度为2mg/ml，消化时间20min。
进一步地，所述动物为小鼠。
进一步地，所述方法还包括：
6)在室温下培养保存。
本发明的有益效果：
1)省时。在用酶消化之前，本发明不需要提前通氧孵育和切脑片操作，可节约50min以上的时间；酶解消化过程耗时比传统方法节约20min。
2)细胞分离效果好。传统方法将一只小鼠的双侧海马的细胞分离后，仅可获得贴壁海马细胞仅50个左右，勉强满足膜片钳实验所需；而本发明的方法仅需一只小鼠的单侧海马，即可获得贴壁海马细胞500个左右。
3)细胞完整性高。通过膜片钳实验验证，封接吸破成功率高达82％，远高于传统方法的23％。
4)细胞分离后便于保存。本发明在分离得到海马细胞后，仅需室温培养(且可以不通氧气)；而传统方法需要在孵育箱内37℃下通氧培养。而且，经对比实验发现，放置在室温条件下，海马细胞的状态要远好于37℃孵育箱，即使不通氧气，室温条件培养的海马细胞状态仍要显著优于放在孵育箱里通氧的。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：传统方法分离得到的海马细胞。
图2：本发明方法分离得到的海马细胞。
图3：本发明方法分离得到的海马细胞的放大(非图2局部放大)图。
具体实施方式
本部分涉及的所有试剂均为市售试剂。
实施例1本发明的急性分离海马细胞的方法
选择2周大小的健康雄性Kun-Ming小鼠(由成都达硕实验动物有限公司提供)，腹腔注射戊巴比妥麻醉。按如下方法进行急性分离：
1)切片：使用使用0℃盐水灌流心脏，减少大脑红细胞，鼠断头分开硬脑膜，用刀片切除皮质，暴露海马组织，用镊子将海马组织与周围脑组织钝性分离后，迅速移入0-4℃HBSS(Hank's平衡盐溶液)或DMEM培养基中，将海马剪碎至1mm2的碎块。
2)消化：将海马组织碎块移入装有2mg/ml木瓜酶(Sigma-Aldrich产品：Papainfrom papaya latex lyophilized powder,≥10units/mg protein)的培养皿中，置于37℃孵育箱中消化20min。吸出木瓜酶，加入2mg/ml I型胶原酶(Sigma-Aldrich旗下VETEC产品：Type I,for general use,VetecTM reagent grade,powder,≥125CDU/mg solid)，继续于孵育箱中消化20min，该过程中孵育箱持续通95％O2/5％CO2。此步骤避免了传统方法中单一酶对细胞的长时间(通常60min)消化，可减少对细胞膜完整性和细胞通道结构的破坏。
3)终止：加入液体10％量的FBS终止酶(1ml酶加100μl血清)，用DMEM清洗3次后，移入盛有Neurobasal混合液的2ml离心管中。
4)吹打：使用玻璃管轻柔吹打2min，过程不应有气泡后，静置2min，吸取上层混悬液加入带有细胞爬片的培养皿(每个培养皿底部放置5个细胞爬片)中。
5)贴壁：将培养皿置于室温下，无菌操作台内进行贴壁，约15min神经元沉降，30-45min完成贴壁，即分离完成，可进行膜片钳实验或置于室温环境(可不通氧)培养保存。
以下用实验例对本发明方法的有益效果做进一步说明。
实验例1本发明与传统急性分离方法效果比较
一、方法
1.急性分离
取健康雄性Kun-Ming小鼠，腹腔注射戊巴比妥麻醉，分成2组。实验组按实施例1的方法进行分离，对照组用传统急性分离方法进行分离，具体的，传统急性分离方法如下：
1)切片：鼠断头取出整个脑组织，迅速移入0-4℃孵育液中，冷却后使用切片机，延海马长轴手工切成400-600um厚的脑片。
2)孵育：在室温下孵育脑片约50min，过程通95％O2/5％CO2 30-50min。
3)消化：孵育后脑片移入含有pronase酶(或胰酶、木瓜酶)的消化液中，浓度为2mg/ml，31℃消化60min，过程中继续通95％O2/5％CO2。
4)终止：使用孵育液洗脑片3次后，移如盛有孵育液的2ml离心管中。
5)吹打贴壁：使用玻璃管吹打后，吸取上层混悬液加入带有细胞爬片的培养皿(每个培养皿底部放置5个细胞爬片)中，用ACSF(人工脑脊液)贴壁至少30min，即分离完成，可进行膜片钳实验或置于37℃通氧(95％O2/5％CO2)环境培养保存。
细胞分离后，在显微镜下观察形态。
2.膜片钳实验
全细胞电生理记录：将室温孵育好的脑细胞爬片放在记录槽中，采用倒置成像显微镜，记录锥体细胞相应通道电流。使用Axopatch 700B放大器，1440Digidata和pClamp10.2软件进行记录。电流以20kHz采样，并以5kHz滤波。串联电阻补偿约70％-75％，并且当串联电阻超过15MΩ时放弃记录该细胞。主要记录的指标有：谷氨酸能：sIPSC、动作电位时间间隔(ISI)GABA能：eEPSC、动作电位时间间隔(ISI)以及输入电阻(input resistance)等。
二、结果
1.细胞分离效果
对照组的细胞碎片较多，残存细胞突触消失，结构不完整(图1)；而实验组的细胞碎片减少(图2)，放大后可见椎体细胞保留形体特性，突触仍然存在(图3)。
对照组需要使用一只小鼠完整的双侧海马，其5个爬片上只有1～2个爬片观察到存活细胞，每个爬片约20～30个；而实验组只需一只小鼠的单侧海马，5个爬片均见到存活细胞，每个爬片80～120个细胞。
贴壁分离7小时后，实验组5个爬片仍有细胞存活，存活率为70％～80％。而贴壁分离2小时后，对照组爬片上细胞存活率只有50％；贴壁分离3～4小时后，对照组爬片上细胞基本死亡。
2.膜片钳实验结果
对两组细胞贴壁分离后2小时后进行膜片钳实验，实验组细胞封接吸破成功率远高于对照组(表1)。
表1 封接吸破成功率
组别 实验细胞总数 封接吸破成功数 成功比例(％)
实验组 79 65 82.28
对照组 314 72 22.93
综上，本发明的海马细胞急性分离方法所分离的细胞活性高，数量大，能显著提高膜片钳实验的成功率。

Claims (10)

1.一种用于急性分离哺乳动物海马细胞的酶解方法，其特征在于，该方法包括：
使用木瓜酶和胶原酶先后消化海马组织碎块；
木瓜酶、胶原酶的工作浓度为1～3mg/ml，各自消化时长15～25min。
2.如权利要求1所述的酶解方法，其特征在于：
所述胶原酶为I型胶原酶。
3.如权利要求1所述的酶解方法，其特征在于：
木瓜酶浓度为2mg/ml，木瓜酶消化时间20min；
和/或，胶原酶浓度为2mg/ml，胶原酶消化时间20min。
4.一种急性分离哺乳动物海马细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)切片：取海马组织，在0～4℃下将海马组织剪碎；
2)消化：用1～3mg/ml木瓜酶消化15～25min，吸出木瓜酶，用1～3mg/ml胶原酶消化15～25min，消化过程持续通入95％O2和5％CO2混合气体；
3)终止：终止消化，洗去酶溶液，移入Neurobasal混合液；
4)吹打：玻璃管轻柔吹打，静置，吸取上层混悬液加入培养皿；
5)贴壁：室温下贴壁30～45min。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)的剪碎过程中，海马位于HBSS或DMEM培养基中。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)中剪碎至1mm2的碎块。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述胶原酶为I型胶原酶。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)中木瓜酶浓度为2mg/ml，消化时间20min；
和/或，胶原酶浓度为2mg/ml，消化时间20min。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述动物为小鼠。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：
6)在室温下培养保存。
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