DE10155130A1

DE10155130A1 - Verfahren zur Isolierung von Neuronen

Info

Publication number: DE10155130A1
Application number: DE10155130A
Authority: DE
Inventors: Frank W Pfrieger; Karl Naegler
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 2001-11-12
Filing date: 2001-11-12
Publication date: 2003-05-22
Also published as: US20050106634A1; WO2003042374A2; EP1448764A2; WO2003042374A3

Abstract

Die Erfindung besteht in einem Verfahren, das es erlaubt, Neurone aus gemischten Zellpopulationen zu isolieren. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, mit hohem Reinheitsgrad Neurone entweder aus postnatalem Hirngewebe oder aus neural differenzierten Stammzellen anzureichern. Auf diese Weise gereinigte Neurone eignen sich zur Untersuchung neuronaler Wachstums- und Differenzierungsbedingungen. Des weiteren bieten sie gegenüber gemischten Zellpopulationen Vorteile bei der Transplantation für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Neuronen aus dem ZNS oder aus differenzierten Stammzellen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Das zentrale Nervensystem (ZNS) besteht aus diversen Zelltypen. Dabei bilden Neurone, Makrogliazellen (Astrozyten und Oligodendrozyten) und Mikrogliazellen die wichtigsten Klassen. Neurone sind für die elektrochemische Informationsübertragung im Nervensystem von Bedeutung, während Mikrogliazellen wichtigste Komponente der zellulären Immunantwort im ZNS darstellen und Makrogliazellen hauptsächlich unterstützende Funktionen wahrnehnen (Jacobson, Developmental Neurobiology, New York: Plenum Press, 1991). Makrogliazellen bilden im ZNS ein Gerüst und versorgen Neurone mit Stoffwechselmetaboliten. Neuere Untersuchungen zeigen, daß es darüberhinaus zu vielfachen molekularen Wechselwirkungen zwischen Makrogliazellen und Neuronen kommt, welche die Entwicklung des ZNS ermöglichen und auch für seine Funktion und Plastizität von Bedeutung sind (Kettenmann & Ransom, Neuroglia, Oxford: Oxford University Press, 1995).
Solche Interaktionen lassen sich am besten unter definierten Bedingungen an kultivierten Zellen untersuchen. Eine wichtige Voraussetzung für solche Untersuchungen besteht darin, Neurone von anderen Zellen abzutrennen, um dann die direkte Wirkung von (glialen) Wachstums- und Differenzierungsfaktoren auf die Neurone identifizieren und testen zu können. Bislang ist es möglich, retinale Ganglienzellen aus der Ratte durch ein sogenanntes Immunopanning-Verfahren zu reinigen (Barres et al., 1998). Dieses Verfahren nutzt die RGC-spezifische Expression des Zelladhäsionsproteins Thy-1 aus. Andere ZNS-Neurone lassen sich bisher nicht mit der erwünschten Reinheit und Ausbeute isolieren.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Neuronen aus verschiedenen Ausgangsmaterialien zu isolieren und damit für verschiedene Anwendungern zur Verfügung zu stellen.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Die wesentliche Basis der Erfindung besteht in der Entdeckung, daß Neurone spezifisch über das Zelladhäsionsprotein L1 selektiert werden können; L1 wird im ZNS spezifisch von Neuronen exprimiert. Zusätzlich ließ sich zeigen, daß sich über L1 nicht nur Neurone aus dem postnatalen ZNS, sondern auch neuronal differenzierte embryonale Stammzellen isolieren lassen: Werden embryonale Stammzellen durch Zugabe geeigneter Faktoren neural differenziert, enthält die resultierende Zellpopulation neben Neuronen immer auch Gliazellen, in einigen Fällen sogar weitere, nicht-neurale Zelltypen. Eine solche Mischpopulation ist für eine Transplantationstherapie ungeeignet, weil nicht-neuronale - sich teilende - Zellen die Gefahr bergen, sich nach der Transplantation zu Tumoren zu entwickeln. Mit Hilfe der neuen Erfindung ist es nun erstmals möglich, aus Stammzellen eine rein neuronale Zellpopulation für Transplantationszwecke zu gewinnen.
Nachfolgend soll die Erfindung näher erläutert werden.
Es wurde ein immunopanning-Verfahren etabliert, das es erlaubt, Neurone aus den Hippokampi postnataler Mäuse über das neuronspezifische Antigen L1 (Rathjen & Schachner, 1984) zu reinigen. Abb. 1 verdeutlicht das Vorgehen zur Herstellung gereinigter Hippokampusneurone. Aus einer Suspension dissoziierter Hippokampi wurden auf zwei Subtraktionsplatten zunächst Mikrogliazellen abgereichert. Dann wurden auf der Selektionsplatte L1-positive Zellen isoliert. Durch das immunopanning über L1 konnten aus den Hippokampi von 10-15 postnatalen Mäusen (Tag 6-7) im Mittel 294,000 ± 37,000 Zellen (n = 11 Aufarbeitungen) isoliert werden.
Durch das immunopanning konnte eine große Anzahl von Zellen isoliert werden. Nun war es wichtig zu klären, ob es sich bei diesen Zellen um Neurone handelte und ob sich in den Kulturen auch nicht-neuronale Zellen befanden. Nach 2 Tagen in Kultur zeigten alle Zellen neuronenähnliche Morphologie und Immunoreaktivität für Antikörper gegen die Neuronenmarker Tau, MAP2, Neurofilament und Synapsin (Abb. 2). Des weiteren besaßen die Zellen axonale Wachstumskegel. Die Differenzierung von Neuriten in Axone läßt sich daraus ableiten, daß sich einige Fortsätze gegen den Axonmarker Tau, aber nicht gegen den Marker für Dendriten MAP2 färben ließen (Abb. 2a). Außerdem hatten einige Wachstumskegel Synapsin-positive Granula, die typisch für Wachstumskegel von Axonen sind (Abb. 2b). Diese Ergebnisse belegen, daß es sich bei den isolierten Zellen um Neurone handelt. Es ließ sich zeigen, daß auf der Selektionsplatte 17 ± 2% (Mittelwert + Standardfehler; n = 4 Aufarbeitungen) aller Neurone, die in der Suspension dissoziierter Hippokampi enthalten waren, isoliert werden konnten.
Als nächstes wurde untersucht, ob die Kulturen außer Neuronen auch andere Zelltypen enthielten. Dazu wurden immunozytochemische Färbungen gegen Marker für eine Reihe nicht-neuronaler Zelltypen durchgeführt (Abb. 3). Der Nachweis von Makrogliazellen erfolgte durch Färbungen gegen die spezifischen Marker 2,3-Zyklo-nucleotid-3- phosphohydrolase (CNPase) und O4 für Oligodendrozyten und deren Vorläuferzellen und gegen glial fibrillary acidic protein (GFAP) für Astrozyten. Da nicht alle Astrozyten des Hippokampus GFAP exprimieren, wurde auch gegen S100 gefärbt, einen weiteren Astrozytenmarker. Fibroblasten wurden über Fibronectin nachgewiesen, Mikrogliazellen über Griffonia Simplicifolia Lectin I Isolectin B4 (GSL I-B4). Kontrollexperimente zeigten, daß sich diese nicht-neuronalen Zelltypen anhand der verwendeten Marker in 1-2 Tage alten Kontrollkulturen, die eine gemischte Zellpopulation aus dissoziierten Maus- Hippokampi enthielten, zuverlässig nachweisen ließen (Abb. 3b). Kulturen aus Neuronen, die über L1-immunopanning isoliert wurden, enthielten keine Astrozyten. Oligodendrozyten ließen sich nur zu einem sehr geringen Anteil von < 0.1% (n = 4 Kulturen; Abb. 3a) nachweisen. Die Kulturen waren auch frei von Fibroblasten oder Mikrogliazellen (n = 3 Kulturen, 1363 Zellen).
Diese Ergebnisse zeigen, daß sich durch das neue immunopanning-Verfahren Zellpopulationen gewinnen lassen, die zu > 99.9% aus Hippokampusneuronen bestehen.
Die Zellisolierung über L1 erwies sich auch als geeignet, um neural differenzierte embryonalen Stammzellen Neurone zu reinigen. Es ließ sich zeigen, daß Fasern, die aus Embryoid Bodies (EBs) nach Differenzierung durch Retinolsäure auswachsen, L1 exprimieren. Durch ein Immunopanning dissoziierter EBs ließ sich eine große Anzahl Zellen isolieren, die nach einwöchiger Kultivierung neuronähnliche Morphologie und Immnunoreaktivität für den Neuronmarker MAP2 zeigten. Nur ein geringer Anteil der Zellen (< 99%) besaß keine Fortsätze und/oder keine MAP2-Expression.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Neurone aus gemischten Zellpopulationen sehr effektiv isoliert werden können. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, mit hohem Reinheitsgrad Neurone entweder aus postnatalem Hirngewebe oder aus neural differenzierten Stammzellen anzureichern. Auf diese Weise gereinigte Neurone eignen sich zur Untersuchung neuronaler Wachstums- und Differenzierungsbedingungen. Des weiteren bieten sie gegenüber gemischten Zellpopulationen Vorteile bei der Transplantation für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen.

Legenden zu den Abbildungen

Abb. 1

Aufreinigung von Hippokampusneuronen

Hippokampi aus 10-15 postnatalen Mäusen (Tag 6-7) wurden mit Papain vorbehandelt und dann mechanisch dissoziiert. Aus der Zellsuspension wurden zunächst Mikrogliazellen abgereichert, indem die Suspension mit anti-Makrophagen Antikörper versetzt und dann nacheinander auf zwei mit Sekundärantikörper beschichtete Schalen gegeben wurde. In diesem Schritt blieben Mikrogliazellen - sie binden an die Fc- Fragmente der Antikörper - an den Schalen haften. Anschließend wurden mittels einer mit Sekundärantikörper und anti-L1 Antikörper beschichteten Schale L1-positive Zellen aus der Zellsuspension isoliert. Durch Behandlung mit Trypsin wurden die Zellen von der Schale gelöst und anschließend auf mit Poly-D-Lysin und Laminin beschichtete Zellkulturschalen plattiert.

Abb. 2

Neuronenähnliche Morphologie und Immunoreaktivität für Antikörper gegen neuronale Marker in isolierten Hippokampuszellen

a Phasenkontrastbild einer 2 Tage alten Kultur. Die Zellen besitzen bereits neuritenähnliche Fortsätze mit Wachstumskegeln. b, c Immunozytochemische Doppelmarkierungen gegen die Neuronenmarker MAP2 und Tau (a) bzw. Neurofilament und Synapsin (b). In gefärbten Kulturen waren sämtliche im Phasenkontrast erkennbaren Zellen positiv für die jeweiligen Neuronenmarker. Die Pfeile kennzeichnen axonale Wachstumskegel. Balken = 110 µm (a), 40 µm (b, c).

Abb. 3

Reinheit der Kulturen isolierter Hippokampusneurone

a Dargestellt ist der Anteil von Makrogliazellen und Neuronen an der Gesamtzahl von Zellen, die über fluoreszenzmarkierte Nuclei identifiziert wurden. Um Makrogliazellen detektieren zu können, wurden zwei Tage alte Kulturen gereinigter Hippokampusneurone gleichzeitig mit Antikörpern gegen GFAP, S100, O4 und CNPase immunozytochemisch gefärbt. Von 2451 Zellen (n = 4 Kulturen) ließen sich 2 als Oligodendrozyten identifizieren. Fehlerbalken repräsentieren Standardabweichungen. b Kontrollfärbungen zeigten, daß die verwendeten Marker die entsprechenden Zelltypen in zwei Tage alten gemischten Kulturen aus dissoziierten Maus-Hippokampi sicher nachweisen. Balken = 20 µm.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung von Neuronen aus verschiedenen Ausgangsmaterialien, dadurch gekennzeichnet, dass die Neuronen über das Zelladhäsionsprotein L1 von anderen Zelltypen abgetrennt werden.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung von Neuronen über ein Protein erfolgt, das durch den Promoter von L1 oder einen ähnlichen Promotor reguliert wird.

3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung von Neuronen über ein Protein erfolgt, das an L1 assoziiert ist.

4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung von Neuronen über ein Protein erfolgt, das sich von L1 ableitet, insbesondere über ein Fusionsprotein.

5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung von Neuronen über mit L1 assoziierte Molekuele, insbesondere Zuckerreste erfolgt.

6. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung mit Hilfe von Antikörpern, Aptameren oder anderen Molekülen erfolgt, die in Ansprüchen 1 bis 4 bezeichneten Proteine binden.

7. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung über Methoden erfolgt, welche die neuronspezifische Expression der in Ansprüchen 1 bis 4 bezeichneten Proteine ausnutzen.

8. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial Suspensionen von Hirngewebe benutzt werden.

9. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial Populationen neural differenzierter embryonaler Stammzellen benutzt werden.

10. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial Populationen neural differenzierter adulter Stammzellen benutzt werden.

11. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial Populationen neuraler oder neuronaler Stammzellen benutzt werden.