EP1448764A2 - Isolierung von neuronen und stammzellen für nervenfasern aus einer probe - Google Patents

Isolierung von neuronen und stammzellen für nervenfasern aus einer probe

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EP1448764A2
EP1448764A2 EP02803013A EP02803013A EP1448764A2 EP 1448764 A2 EP1448764 A2 EP 1448764A2 EP 02803013 A EP02803013 A EP 02803013A EP 02803013 A EP02803013 A EP 02803013A EP 1448764 A2 EP1448764 A2 EP 1448764A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
neurons
neural
sample
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02803013A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Frank W. Pfrieger
Karl NÄGLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Original Assignee
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft filed Critical Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Publication of EP1448764A2 publication Critical patent/EP1448764A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons

Definitions

  • the invention relates to the use of an L1 promoter-regulated protein, an L1-associated molecule, of L1 or of recognition molecules which are directed against the structures mentioned for the isolation of neurons and stem cells for nerve fibers, in particular neural and / or neural stem cells, from a sample; the invention further relates to a method for isolating neurons and stem cells for nerve fibers by means of said recognition molecules.
  • Areas of application of the invention are medicine and the pharmaceutical industry.
  • the central nervous system consists of various cell types. The most important classes are neurons, macroglia cells, such as astrocytes and oligodendrocytes, and microglia cells. Neurons are important for the electrochemical transfer of information in the nervous system, while microglial cells are the most important components of the cellular immune response in the CNS and the macroglial cells mainly perform supporting functions (Jacobson, Developmental Neurobiology, New York: Plenum Press, 1991). Macroglial cells form a scaffold in the CNS and supply neurons with metabolic metabolites. Recent studies show that there are also multiple molecular interactions between macroglial cells and neurons, which enable the development of the CNS and are also important for its function and plasticity (Kettenmann & Ransom, Neuroglia, Oxford: Oxford University Press, 1995).
  • Such interactions can best be investigated under defined conditions on cultivated cells.
  • An important prerequisite for such investigations is to separate neurons from other cells in order to then be able to identify and test the direct effect of, in particular glial, growth and differentiation factors on the neurons. So far, it has only been possible to purify rat retinal ganglion cells using a so-called immunopanning method (Barres et al., 1998). This method takes advantage of the RGC-specific expression of the cell adhesion protein Thy-1.
  • Other neurons, in particular CNS neurons have so far not been able to be isolated with the desired purity and yield.
  • the invention was accordingly based on the object of isolating or enriching neurons and differentiated stem cells, in particular neuronal and / or neural stem cells, from a sample in order to use them e.g. to provide for different applications.
  • the invention solves this technical problem by the use of an L1 promoter-regulated protein, an L1-associated molecule, a cell adhesion protein L1, a recognition molecule against a protein regulated by an Ll promoter, against an L1-associated molecule and / or against a cell adhesion protein L1 for isolating neurons and differentiated stem cells, in particular neural and / or neuronal stem cells, from a sample.
  • the teaching according to the invention is accordingly based on the surprising discovery that neurons and / or differentiated, in particular neural and / or neuronal, stem cells from a sample specifically via the cell adhesion protein L1, via proteins which are regulated or regulated by the L1 promoter can be selected or isolated via an L1-associated molecule or via recognition molecules which are directed against the structures mentioned. Ll and the named Ll equivalents are expressed specifically by neurons, particularly in the CNS.
  • not only neurons from the CNS for example from the postnatal CNS, but also from stem cells, in particular differentiated stem cells, preferably neuronal differentiated adult or embryonic stem cells, can be isolated via L1 and the L1 equivalents mentioned , This is particularly advantageous if, for example, embryonic stem cells differentiate neurally by adding suitable factors.
  • the resulting cell population always contains glial cells, in some cases even other, non-neural cell types.
  • Such a mixed population is particularly unsuitable for transplantation therapy because non-neuronal - dividing - cells run the risk of developing into tumors after the transplantation.
  • a sample in the sense of the invention is the designation for a biological good or a partial amount or a small amount of it, the nature of which can be tested chemically, biologically, clinically or similarly, in particular for neurons or differentiated stem cells from this sample to win; the sample can be, for example, a collection of stem cells or a piece of a brain. Sampling or extraction takes place in such a way that the partial quantity taken corresponds to an average of the total quantity.
  • the features determined by the examination or from the sample can be used to assess - for example before isolating neurons or obtaining stem cells - the amount recorded by the sample, which allows conclusions to be drawn about the total amount.
  • the samples can be pretreated by mixing, dividing, separating, pre-fractionating, crushing, adding enzymes or markers or otherwise.
  • pretreating the samples are known to the person skilled in the art.
  • the sample is taken in such a way that it does not correspond to an average of the total amount.
  • a sample is primarily biological materials that include structures that are suitable for the transmission or storage of information on a biological basis.
  • the sample can comprise numerous other materials, such as blood, Lymph, urine, brain fluid, bioreactor fluids, lipid mixtures, bones, cartilage and many others.
  • Neurons in the sense of the invention are all nerve cells which, as highly differentiated cells, are capable of receiving, processing and transmitting nervous excitation. These cells occur, for example, in the CNS, in the ganglia and in the sensory organs and can be a subset of the sample.
  • the cells themselves can be referred to as perikaryon in the sense of the invention.
  • the nerve cell or the neuron points e.g. neurofibrils, NISSL substance and processes as well as one or more dendrites.
  • the nerve cells can be, for example, nerve cells from animals or humans.
  • nerve cells from animals or humans.
  • Nerve cells that are non-continuous, or bipolar nerve cells, as sensitive or sensory nerve cells, each with a polar dendrite and neurites, such as those that appear as granular cells of the retina, or multipolar nerve cells with multiple dendrites and a long or short neurite, as motor ones Cells of the animal and autonomous system are isolated.
  • poly-neuritic nerve cells with several neurites for example as a CAJAL cell of the cerebral cortex or pseudo-unipolar nerve cells, such as those found in sensitive head and spinal cord ganglia, or unipolar nerve cells, in which two processes originally appear to be fused into one , as they occur, for example, in rod and cone olfactory cells, insofar as they come under the concept of neurons in the sense of the invention are to be subsumed.
  • neurosecretory nerve cells such as can be obtained from the hypothalamus, for example, or neuromelanocytes as neurons in the sense of the invention.
  • the neurons can be isolated as preganglionic or postganglionic neurons and as intermediate neuron cells of the interneuron.
  • Other cells that are defined according to the invention as nerve cells or as neurons include amacrine cells, horizontal cells, bipolar cells, GOLGI cells, PURKINJE cells, motor neurons, hair, pyramid and / or basket cells.
  • Amacrine cells in the sense of the invention are multipolar nerve cells, in particular in the inner granular layer of the retina of the eye, which have short extensions.
  • Horizontal cells are cells that, with their nucleated cell bodies, represent internal neurons of the visual pathway located in the inner granular layer of the retina.
  • the horizontal cells can also include the CAJAL cells, which are isolated in the most superficial layer of the cerebral cortex and are small spindle-shaped nerve cells with long, horizontally oriented processes.
  • the bipolar cells or the bipolar neurons are nerve cells with two separate outgoing processes, as they occur, for example, in the ganglia of the inner ear and the retina.
  • GOLGI cells in the sense of the invention are large granule cells of the cerebellar cortex with short neurites or cells, which are subsumed under the term Cellulae axiramificatae.
  • PURKINJE cells in the sense of the invention are large, pear-shaped nerve cells in the stratum gangliosum of the cerebellar cortex, each with two to three dendrites rising vertically into the molecular layer and branching there in one plane and the neurites descending into the cerebellar medulla.
  • the motor neuron forms a motor unit of the skeletal muscle and consists of an alpha motor neuron with all muscle fibers innervated by this neuron, whereby each muscle fiber has only one motor end plate.
  • CORTI hearing cells are understood as hair cells. These are secondary sensory cells with hearing hairs between the supporting cells of the CORTI organ of the inner ear. They end synaptically at the dendrites of the bipolar ganglion cells of the spiral ganglion.
  • Pyramid cells in the sense of the invention are pyramid-shaped, multipolar nerve cells of the cerebral cortex, the tip dendrites of which rise into the molecular layer, while the shorter ones branch out horizontally from the base corners and the neurites pull from the cell base to the marrow.
  • Basket cells in the sense of the invention are star-shaped nerve cells in the molecular layer of the cerebellum, the plentiful branches of which are formed by their neurites and braided around the PURKINJE cells as basket fibers.
  • nerve cells are, in particular, cells that occur in the CNS; these can be referred to as neurons.
  • these neurons do not have to occur exclusively in the CNS. It is e.g. also possible that e.g. Basket cells can be modified by suitable factors in cells that have particular neuronal properties.
  • differentiated stem cells such as neural and / or neuronal stem cells
  • neural and / or neuronal stem cells can also be isolated, separated or enriched from the sample using the teaching according to the invention.
  • neurons, oligodendrocytes and astrocytes can arise from the central nervous system. In humans, for example, these cells are predominantly found in the ventricular and sub-ventricular zone of the brain and in the sub-granular zone of the .Gyros dentatos in the hippocampus.
  • the embryonic stem cells come, for example, from the early development phase of an embryo before nidation, namely from the so-called inner cell mass, the blastocyst.
  • These cells are pluripotent, which means that they can be differentiated into all tissues of the human organism. But unlike a zygote, they cannot develop into complete embryos. These stem cells are also able to differentiate into neurons in the sense of the invention and are then neurons in the sense of the invention; they can also be understood as such before the differentiation. For the use - for example in the therapy - of the stem cells mentioned, it is important that the cell preparation has a high level of purity. With the help of the teaching according to the invention, it is possible for the first time, for example, to separate the insulin-producing cells or blood cells that develop simultaneously from the embryonic stem cells from the developing neurons. The neurons obtained in this way can then be used for transplantation, for example in Parkinson's and Alzheimer's patients.
  • Neural stem cells in the sense of the invention are also all those cells which are known as stem cells from the nervous system or can be found there. In the stem cell formation zone, approximately one in three hundred cells is a stem cell. It is possible, for example, to use automatic flow cytometry to obtain a cell population with 80% purity from an adult brain, in order to then use the teaching according to the invention to produce an almost completely pure population of neuronal len stem cells, provided that the stem cells have L1, Ll-associated structures or fragments or equivalents of such a structure - for example Ll homologs such as Neuroglian.
  • neuronal stem cells obtained by factors known to the person skilled in the art so that they form astrocytes and neurons or nerve cells; it can never be ruled out that muscle cells or other cells also appear in the culture.
  • the cells obtained in this way can also be separated using methods according to the invention, since it is possible in the course of the individual development of the cells to separate the cells which develop as neurons from those which have, for example, glial cell properties or those which have properties of astrocytes.
  • the neuronal stem cells can be isolated from various regions of the adult CNS, for example in the walls of the ventricles or in the striatum. Furthermore, they can be obtained from the outer germinal zone of the cerebellum of newborn mice. The person skilled in the art is aware of further sources from which he can isolate neuronal stem cells or stem cells which can be differentiated into neuronal stem cells.
  • Stem cells in the sense of the invention are accordingly both embryonic and adult stem cells, which in particular are already differentiated neurally or neuronally or can be differentiated in this sense. It was surprising that not only neurons, but also differentiated embryonic and adult stem cells, especially neuronically differentiated stem cells, can be isolated using Ll or Ll equivalents.
  • Ll equivalents in the sense of the invention are all structures that interact with certain recognition molecules in such a way that they provide isolation of neurons and differentiated stem cells.
  • cell adhesion proteins L1 are understood to mean neuronal cell adhesion molecules which belong to the Ig superfamily in vertebrates and invertebrates.
  • Ll, axonin, Neuroglian, N-CAM, fascilin, DM-GRASP BEN SCI, IRRI C-RST, the poliovirus receptor and others also belong to the neuronal cell adhesion molecules which are closely related to Ll and can accordingly be understood as L1 equivalents in the sense of the invention.
  • the homologues between the cell adhesion molecules of the invertebrates and vertebrates, in particular at the level of the secondary and tertiary structure, are known to the person skilled in the art, for example between Neuroglian and Ll and also between Fascilin and NCAM and between the irreC gene product and DM-GRASP.
  • Ll in the sense of the invention is particularly effective in that it stimulates neurite growth on Schwann cells in particular by homophilic binding mechanisms between Schwann cells and neurons. Ll is mainly expressed in neurons and Schwann cells after a peripheral nerve lesion and can also be associated with axonal regeneration.
  • the L1 equivalents can also include all proteins which are regulated by an Ll promoter. All proteins or lipid or carbohydrate structures which are associated with the L1 protein in such a way that they enable isolation from the stem cells and neurons mentioned are L1-associated molecules in the sense of the invention.
  • L1-associated molecules for example also sugar or lipid structures
  • L1 or with Ll equivalents can be associated with L1 or with Ll equivalents in such a way, for example, that they can be used to Isolate neurons, neural and / or neural stem cells from a sample.
  • L1 and Ll equivalents or L1-associated molecules he can also use molecules which are closely related to Neuroglian or L1, provided that they occur in neurons or the stem cells mentioned. This includes, for example, the vertebrate molecule contactin, which only has one FN-III domain less.
  • L1 equivalents have been preserved over long periods of time during the evolution of the nervous system, a large number of molecules, in particular proteins, but also lipids or carbohydrates associated therewith are available to the person skilled in the art, which are in the sense of the teaching according to the application can be used.
  • Ll can also be part of a fusion protein.
  • Isolating in the sense of the invention means that the neurons or nerve cells or neuronal and / or neural stem cells obtained have a purity of 40%, preferably 50%, particularly preferably 60% and very particularly preferably 70, 80, 90, 95, 97 , 99 and over 99.5% can be obtained.
  • Various methods for isolating cells and for determining the degree of purity are known to the person skilled in the art.
  • recognition structures which act against L1, against L1-associated molecules or proteins which are regulated by the L1 promoter - that is to say in a broader sense of all L1 equivalents. to isolate neurons and / or the named stem cells.
  • the recognition molecules for example an antibody against the cell adhesion protein L1 are immobilized on a culture dish or in a chromatography column which is filled with nylon wool, for example available.
  • the structures to be isolated can interact with the recognition molecules in such a way that it is possible for all cells that have the LI equivalents mentioned do not have to be separated from the neurons or stem cells to be isolated by washing or other methods known to the person skilled in the art.
  • the recognition molecule is an antibody, an aptamer, a lectin, an antisense construct, a selective chelator, their fragments and / or a combination of these.
  • Antibody means a polypeptide which is essentially encoded by an immunoglobulin gene or immunoglobin genes, or fragments thereof, which / which an analyte - Ll, Ll-associated molecules, by an Ll-promoter-regulated proteins, that is Ll equivalents - specifically bind / bind and recognize / recognize.
  • Known immunoglobin genes include the kappa, lambda, alpha, gamma, delta, epsilon and mu genes for the constant region as well as the innumerable genes for the variable immunoglobulin region.
  • Antibodies occur, for example, as intact immunoglobulins or as a series of well-characterized fragments that are generated by cleavage with various peptidases.
  • Antibody also means modified antibodies (eg oligomeric, reduced, oxidized and labeled antibodies).
  • the term “ antibody ” used in the present description also includes antibody fragments that have been generated either by modification of whole antibodies or by means of de novo synthesis using DNA recombination techniques.
  • antibody includes both intact molecules and Fragments thereof, such as Fab, F (ab ') 2 and Fv, that bind the epitope determinant can. With these fragments, the ability of the antibody to selectively bind its antigen or the Ll equivalents has been partially preserved, the fragments being defined as follows:
  • Fab the fragment containing a monovalent antigen binding fragment of an antibody molecule, can be produced by cleaving an entire antibody with the enzyme papain, whereby an intact light chain and part of a heavy chain are obtained;
  • the Fab 'fragment of an antibody molecule can be obtained by treating an entire antibody with pepsin and then reducing it, whereby an intact light chain and part of the heavy chain are obtained; two Fab 'fragments are obtained per antibody molecule;
  • F (ab ') 2 the fragment of the antibody which can be obtained by treating an entire antibody with the enzyme pepsin without subsequent reduction;
  • F (ab ') 2 is a dimer of two Fab' fragments held together by two disulfide bonds;
  • Fv defined as a genetically engineered fragment that contains the light chain variable region and the heavy chain variable region and is expressed in the form of two chains
  • SCA Single Chain Antibody
  • epitope used in the present invention means any antigen determinant on antigens, especially those associated with Ll, Ll-associated molecules such as e.g. Sugar residues, or associated with Ll promoter-regulated proteins, to which the paratope of an antibody binds.
  • Epitope determinants usually consist of chemically active surface groupings of molecules, such as amino acids or sugar side chains, and usually have both specific features of the three-dimensional structure and specific charge features.
  • genes encoding monoclonal antibodies of interest can be isolated from hybridomas using PCR techniques known in the art and cloned and expressed in suitable vectors.
  • monoclonal antibodies are suitable for purifying the individual cell, which comprise proteins - such as Ll equivalents - against which they are directed.
  • the antibodies according to the invention have an additional benefit in that they can be used as reagents in immunoassays, such as RIA, ELISA and the like. They can also be used to isolate L1 equivalents or domains from cells or other biological samples.
  • the antibodies could e.g. B. to establish a test based on a tissue culture to find, isolate or modify novel Ll antigens or novel compounds that modify the interaction of Ll antigens and receptors and / or target sites.
  • the humanized or chimeric antibodies can comprise parts that come from two different types (eg human constant region and mouse binding region).
  • the parts originating from two different types can be chemically combined using conventional methods or can be produced as a single fusion protein using genetic engineering methods.
  • a DNA encoding the proteins of the two parts of the chimeric antibody can be expressed as a single fusion protein.
  • An antibody specifically binds to a protein, e.g. a different biological structure, or shows a specific immunoreactivity if the antibody performs its function in a binding reaction in the presence of a heterogeneous population of proteins and other biological substances, which can be used to decide whether the protein or there is another biological structure and in particular the cells comprising proteins can be isolated.
  • the specified antibodies preferably bind to a specific protein, while there is no significant binding to other proteins present in the sample.
  • Specific binding to a protein under such conditions requires an antibody that has been selected for its specificity for a particular protein, such as L1.
  • Various immunoassay embodiments can be used to select antibodies which show a specific immunoreactivity with a special protein.
  • solid phase ELISA immunoassays are routinely used to select monoclonal antibodies that show specific immunoreactivity with a protein. Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Publications, New York, describe immunoassay embodiments and conditions that can be used to determine a specific immunoreactivity.
  • the antibody is preferably a single chain antibody, a multibody, a Fab fragment, an MHC molecule, an MHC peptide, a fusion peptide, a conformational epitope imitating mimicrypeptide single chain antibody, a polyclonal, a monoclonal, a humanized and / or a labeled antibody.
  • the neurons are afferent, efferent, intercalary, peripheral motor, central motor, preganglionic, postganglionic and / or sensitive neurons.
  • the invention also relates to a method for isolating neurons, neural and / or neuronal stem cells from a sample, wherein a recognition molecule against a protein regulated by an Ll promoter, against an Ll-associated molecule and / or against Ll with the Sample is brought into contact, whereby recognition molecule Ll associates are formed and the associates are separated.
  • a recognition molecule against a protein regulated by an Ll promoter, against an Ll-associated molecule and / or against Ll with the Sample is brought into contact, whereby recognition molecule Ll associates are formed and the associates are separated.
  • the recognition molecules against the protein regulated by an Ll promoter, against the L1-associated molecule and / or against Ll form associates with the structures mentioned.
  • no associations are formed with the structures, in particular cells, which are in the sample and which do not have the mentioned L1 equivalents. Due to the difference in charge, density or size between the cells that do not form associates and those that are part of the associates, it is possible to separate these different cells from one another.
  • Various methods for this are known to the person skilled in the art.
  • Several mechanical, physical, chemical and / or biological steps can be connected upstream or downstream of the method according to the invention; For example, it is possible that the sample is first loosened with enzymes or simply by mechanical comminution or by certain forms of ultrasound treatment in order to dissolve the intact or less intact tissue as a unit, without the individual cells, in particular the neurons to be isolated or the called stem cells to destroy.
  • the associations that can be separated, whereby the isolated cells are obtained.
  • the recognition molecules are immobilized on a support, the isolated cells can be separated from them with an enzyme.
  • the cells are not separated from the recognition molecules, such as, for example, chelators, if they have a particularly favorable influence on the physiology of the cells.
  • the separated associate can be an isolated cell in the sense of the invention, as can the cell that is no longer part of an associate, since it has been separated from the recognition molecule.
  • enzymes perfuse that loosen the cell-cell connection and dissolve the extracellular collagen structure, which can stabilize the tissue.
  • enzymes such as trypsin and collagenase in succession in a solution with a high potassium content. If the sample contains no or only an insignificant collagen structure, this step can be dispensed with; even if it is not desired that the cells to be isolated are treated with enzymes such as trypsin and / or collagenase or if a high proportion of potassium is not desired.
  • an enzyme treatment can also be provided which dispenses with a solution with a high potassium content and instead contains a proportion of other mono-, di- or polyvalent elements, in particular of metal ions.
  • the loosened tissue can be cut up and individual cells can be removed from the tissue structure by mechanical stirring.
  • Further purification can be carried out, for example, in chromatography columns, in cell electrophoresis, in the FACS device or by other methods of cell purification and cell isolation. However, it is also possible to carry out these steps as the method according to the invention - and not as a preliminary procedure.
  • nylon wool can be used, for example, to which the recognition molecules are immobilized so that the cells to be isolated interact with the wool in such a way that isolation is possible.
  • Such a separation is possible, for example, with so-called MACS or mini-MACS or with certain FACS devices.
  • afferent, efferent, intercalary, peripheral motor, central motor praganglionary, postganglionary are isolated as neurons.
  • the neurons are adendritic, apolar, bipolar, multipolar, polyneuritic, pseudounipolar, unipolar and / or neurosecretory.
  • a brain, a striatum, a neocortex, a spinal cord and / or a subset thereof is used as the sample.
  • stem cells in particular differentiated stem cells
  • the sample comprises a neural differentiated embryonic and / or a neural differentiated adult stem cell.
  • molecules selected from the group comprising an antibody, an aptamer, a lectin, an antisense construct, a selective chelator, their fragments or a combination thereof are used as recognition molecules.
  • an antibody fragment a single chain antibody, a multibody, a Fab fragment, an MHC molecule, an MHC peptide, a fusion peptide, a conformation epitope imitating mimicrypeptide single chain anti body, a polyclonal, a monoclonal, a humanized and / or a labeled antibody.
  • the recognition molecules are immobilized.
  • Immobilization in the sense of the invention is understood to mean all methods for restricting the mobility and solubility of recognition molecules or L1 equivalents by chemical, biological and / or physical means.
  • the immobilization can be carried out by various methods, such as the binding of the recognition molecules to one another or to culture dishes or separating surfaces - such as nylon wool -, by holding onto the network of a polymeric separation matrix or by means of membranes.
  • the immobilization not only makes the recognition molecules reusable, but they can also be easily separated again after the process of interaction with the biological sample. They can be used in much higher local concentrations and in continuous flow systems.
  • the bond or the The recognition molecules can be immobilized on a surface by means of a direct carrier connection - in particular mediated by means of a spacer and by crosslinking.
  • the carrier binding or crosslinking takes place according to the invention in particular ionically / adsorptively or by covalent binding.
  • Cross-linking in the sense of the invention is a cross-linking of the recognition molecules with one another or with other polymers.
  • the recognition molecules are enclosed in gel structures or in membranes in such a way that the desired cells can interact and be isolated.
  • the recognition molecules are immobilized physically, chemically and / or biologically by synthesis in situ or by storing previously synthesized recognition molecules.
  • the recognition molecules are immobilized on a surface physically, chemically and / or biologically by in situ synthesis or by depositing previously synthesized recognition molecules. Regardless of the type of immobilized recognition molecule, this can be done in two different ways:
  • Spotting is understood to mean processes in which liquid drops are deposited, whereby essentially round spots are created as a result of surface interaction and drying.
  • Other printing processes enable the substrate to be deposited on the surface in defined areas.
  • the recognition molecules are made by contact tip printing, ring and pin printing and nanopipetting, bubble jet printing, top spot printing, micro contact printing, micro fluidic networks methods, photolithographic activation methods, photoresist lithography, electrochemical focusing and / or immobilized micro wet printing.
  • the surface - for example the culture or washing vessels or other devices or materials which are used for the separation - with poly-L-lysines, aminosilanes, aldehydesilanes, epoxy groups, streptavidin, Polylysines, silanes, reactive groups, polyacrylamide pads, immobilized nitrocellulose, activated aldehydes, agarose-aldehyde groups and / or tresyl groups are coated.
  • substrate surface treatments advantageously make it possible to improve the binding capacity of the surface in such a way that the recognition molecules can remain immobilized very well over a longer period of time.
  • the surface modification can be carried out quite generally, in particular by the action of biological, physical and / or chemical influences. Physical action are, for example, polishing, etching, pickling, sandblasting, but also physical processes that lead to hardening, coating, tempering, covering with protective skins and the like.
  • a biological surface treatment can include, for example, the growth of selected cells.
  • a chemical modification of the surface includes, for example, treatment with acids, bases, metal oxides and others. The surface can be modified in such a way that the detection molecules or the recognition molecules adhere particularly well, or so that their activity is not disadvantageously modified.
  • a surface modification of the separating material or the culture vessels naturally also includes a treatment which leads to increased stability or improved culture conditions. It is of course also possible to make classic surface modifications from histology, such as coating with, for example, protein glycerol, polylysine, activated dextrans and / or chromium gelatin.
  • immune complexes form as associates.
  • the immune complexes arise in particular at an optimal concentration ratio between L1, the L1-associated molecule or the protein regulated by an Ll promoter and the recognition molecules.
  • a distinction can be made between soluble and circulating immune complexes.
  • the immune complexes are antibody-antigen complexes or lectin-antigen complexes.
  • the antigen is the cell adhesion protein L1, the molecule associated with the L1 and / or the protein or the Ll equivalents regulated by an Ll promoter.
  • the lectins can in particular be structures which interact very specifically with molecules which are associated with L1 in such a way that the desired cells can be isolated via them.
  • Lectins of this type can be isolated, for example, from the following organisms: Abrus precatorius, Adenia digitata, Agaricus bisporus, Aleuria aurantia, Amaranthus caudatus, Amphicarpaea biacteata, Anguilla anguilla, Arachis hypogaea, Artocarpus integrifolia, Bauhinia purpurea scalia, Ariformisodorpus, Rotaticyporpus, Rotaticyporpus, Braticypodia, Braticypodia canda, Cicer arietinum, Codium fragile, Crotalaria juncea, Cytisus sessilifolius, Datura stramonium, Dioclea grandiflora, Dolichos biflorus, Erythrina coralldendron, Ery
  • Hippeastrum hybrid Hordeum vulgare, Hura crepitaus, Latyrus odoratus, Latyrus sativus, Latyrus tingitanus, Lens culinaris, Limax glavus, Limulus polyphemus, Lotus tetra-gonolobus, Lycopersicon esculentum, Maackia amurensis, Maclura pomiferusantia, paciferia, Macrotura narcissus axomusia, pomifera, Macrotura narcissus axomusia piaiferia, Macrotura narcissus axomusia piaiferia, Macrotura narcissus axomusia piaiferia, Macrotura pomifera, Macrotura narcissus axomusia pia Oryza sativa, Phas eolus coccineus, Phaseolus limensis, Phaseolus vulgaris, Phytolacca
  • the antibodies can be obtained from any organism that is capable of producing antibodies against them due to the conflict with antigenic immunological recognition substances.
  • the associates are antisense hybrids.
  • DNA-DNA, RNA-RNA and / or RNA-DNA antisense hybrids are preferred.
  • hybridization is the sequence-dependent pairing of single-stranded RNA or DNA molecules to form an RNA / DNA hybrid.
  • antisense here expresses the complementary structure of a single strand compared to another single strand. Numerous antisense techniques are known to the person skilled in the art, in particular from the field of the electrochemical detection of oligonucleotides. He is therefore also aware of how the antisense constructs must be used, for example in immobilized form, in order to use them for isolation from the desired cells.
  • the antisense constructs would serve as so-called catcher sequences, which are bound, for example, to a surface, for example a culture dish, and are complementary to part of a nucleic acid structure which is responsible for an L1-associated molecule, a protein regulated by an Ll promoter or code from an Ll.
  • catcher sequences which are bound, for example, to a surface, for example a culture dish, and are complementary to part of a nucleic acid structure which is responsible for an L1-associated molecule, a protein regulated by an Ll promoter or code from an Ll.
  • the desired cells are separated by the different density, size and / or charge of the neurons, the neuronal and / or neural stem cells, which are in the form of associates, and components of the samples which are not associates include.
  • no associates refers to constituents of the sample which essentially comprise no L1 cell adhesion proteins, no L1 associated molecules and / or no proteins regulated by an Ll promoter or have a concentration of these structures to such a small extent, that isolation over them is not possible.
  • these associates are separated or isolated from one another by means of affinity chromatography, cytolysis, FACS, density gradient separation, adhesion, agglutination, rosette formation and / or cell electrophoresis.
  • affinity chromatography cytolysis, FACS, density gradient separation, adhesion, agglutination, rosette formation and / or cell electrophoresis.
  • This principle can be illustrated as follows using a non-limiting example: It can be provided, for example, that the recognition molecules are immobilized antibodies on a Petri dish. A cell suspension containing neurons, among other things, can be placed on this Petri dish. These can be isolated, for example, on the Petri dish as so-called Ll-positive cells by forming the associations.
  • the recognition molecules are used as column material, for example in chromatography columns or that these recognition molecules are bound to such column material in order to separate a cell suspension with the aid of this column material, the Ll-positive cells sticking to the column material and all non-Ll-positive cells passing through the column. The bound cells are then separated from the column material by certain elution methods.
  • L1-positive cells are all cells which have L1 or L1-associated molecules or proteins regulated by an L1 promoter in a concentration or in a structure that isolates neurons, neural and / or neural stem cells from a sample is possible.
  • the person skilled in the art is familiar with further methods of cell separation, such as, for example, cell separation by means of magnetobeads or the "panning" method or FACS, adsorption on plastic, nylon-wool fractionation, various forms of centrifugation, which determine the cell size or cell density as a distinguishing feature of the cells that are present as associates or as non-associates.
  • the Ll equivalents serve as surface markers.
  • the then specific recognition molecules can be used as magneto-bead-linked recognition molecules.
  • the sample is first pretreated with an SH proteinase. It is preferred here that the SH proteinase is papain.
  • the microglial cells are first depleted in the sample. This depletion can take place, for example, from one, two or more subtraction plates by subspensioning, for example with anti-macrophage Antibodies are added and successively placed on two dishes layered with secondary antibodies.
  • microglial cells because they bind to the Fc fragments of the antibodies, adhere to the shells.
  • the isolated neurons, neural and / or neuronal stem cells with trypsin are detached from the immobilized recognition molecules or from the surfaces of the culture or separation materials.
  • the Ll-positive cells are detached from the dishes, for example, from anti-Ll antibody-coated culture dishes by treating trypsin.
  • the cells isolated in this way are then plated on cell culture dishes which are coated with poly-D-lysine and / or laminin.
  • the invention also relates to purified neuron, neural and / or neuronal stem cell populations, in particular obtainable by the method according to the invention; accordingly, it also affects cell populations with the corresponding degrees of purity, which can be obtained differently.
  • Cell populations with a purity of over 90% are preferred. This means that the cells are without the material with which they are associated in their natural state or at most with a part of them.
  • the purified cells make up at least 90%.
  • the isolated cells are essentially free of other cells but also of proteins, lipids, carbohydrates or other substances which are associated with the cells in such a way that the person skilled in the art does not regard them as Cells with high purity or as isolated cells.
  • the cells cannot be associated with proteins, lipids, carbohydrates, especially if these are molecules that are themselves synthesized by the neurons, neural and / or neuronal stem cells.
  • Essentially isolated or essentially free means that the cells are at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 97%, and particularly preferably at least 98% and very particularly preferably more than 99% free of other cells with which they are naturally associated.
  • the invention also relates to the named cell populations with a high purity.
  • the cells are present with a purity of 95%. In a further particularly preferred embodiment of the invention, the cells are present with a purity of over 97%. In another very particularly preferred
  • the cells are present with a purity of over 98%. And in another very particularly preferred embodiment of the invention, the cells are present with a purity of over 99%.
  • the invention also relates to a purification kit comprising a recognition molecule against a protein regulated by an L1 promoter, against an L1-associated molecule and / or against the cell adhesion protein L1.
  • a purification kit comprising a recognition molecule against a protein regulated by an L1 promoter, against an L1-associated molecule and / or against the cell adhesion protein L1.
  • Isolate cells to be cleaned The isolation is preferably carried out using the methods described.
  • the person skilled in the art can isolate it by routine tests or by equivalent applications, these routine methods and Equivalents are included in the teaching according to the application.
  • the invention also relates to a microarray comprising a recognition molecule against a protein regulated by an L1 promoter, against an L1-associated molecule and / or against a cell adhesion protein L1.
  • FIG. 1 illustrates the procedure for the production of purified hippocampal neurons.
  • FIG. 3 Macroglial cells were detected by staining against the specific markers 2 ', 3' cyclo-nucleotid-3 'phosphohydrolase (CNPase) and 04 for oligodendrocytes and their progenitor cells and against glial fibrillary acidic protein (GFAP) for astrocytes. Since not all astrocytes of the hippocampus express GFAP, staining was also carried out against SlOOß, another astrocyte marker.
  • CNPase 3' cyclo-nucleotid-3 'phosphohydrolase
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • Ll Cell isolation via Ll also proved to be suitable for cleaning neurally differentiated embryonic stem cells. It was shown that fibers that grow out of embryoid bodies (EBs) after differentiation by retinoic acid express Ll. A large number of cells could be isolated by immunopanning dissociated EBs, which showed neuron-like morphology and immunoreactivity for the neuron marker MAP2 after one week of cultivation. Only a small proportion of the cells ( ⁇ 99%) had no extensions and / or no MAP2 expression.
  • EBs embryoid bodies
  • the method according to the invention can be used to isolate neurons from mixed cell populations very effectively. With the help of this method it is possible to enrich neurons with a high degree of purity either from postnatal brain tissue or from neurally differentiated stem cells. Neurons cleaned in this way are suitable for studying neuronal growth and differentiation conditions. Furthermore, they offer advantages in transplantation over mixed cell populations for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • Fig. 1 purification of hippocampal neurons.
  • Microglial cells were first depleted from the cell suspension by adding anti-macrophage antibody to the suspension and then placing them successively on two dishes coated with secondary antibody. Microglia cells remained in this step - they bind to the Fc fragments of the antibodies - stick to the dishes. Then Ll-positive cells were isolated from the cell suspension using a dish coated with secondary antibody and anti-L1 antibody. The cells were detached from the dish by treatment with trypsin and then plated on cell culture dishes coated with poly-D-lysine and laminin.
  • Fig. 2 Neuron-like morphology and immunoreactivity for antibodies against neuronal markers in isolated hippocampus cells.
  • b, c Immunocytochemical double markings against the neuron markers MAP2 and Tau (a) or neurofilament and synapsin (b). In colored cultures, all the cells that were recognizable in the phase contrast were positive for the respective neuron markers.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von einem L1-Promoter-regulierten Protein, einem L1-assoziierten Molekül, von L1 bzw. von Erkennungsmolekülen, die gegen die genannten Strukturen gerichtet sind zur Isolierung von Neuronen und Stammzellen für Nervenfasern, insbesondere neuralen und/oder neuronalen Stammzellen, aus einer Probe; die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Isolieren von Neuronen und Stammzellen für Nervenfasern mittels der genannten Erkennungsmoleküle. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.

Description

Isolierung von Neuronen und Stammzellen für Nervenfasern aus einer Probe
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von einem Ll-Promo- ter-regulierten Protein, einem Ll-assoziierten Molekül, von Ll bzw. von Erkennungsmolekülen, die gegen die genannten Strukturen gerichtet sind zur Isolierung von Neuronen und Stammzellen für Nervenfasern, insbesondere neuralen und/oder neuronalen Stammzellen, aus einer Probe; die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Isolieren von Neuronen und Stammzellen für Nervenfasern mittels der genannten Erkennungsmoleküle. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Das zentrale Nervensystem (ZNS) besteht aus diversen Zell- typen. Dabei bilden Neuronen, Makrogliazellen, wie zum Bei- spiel Astrozyten und Oligodendrozyten, und Mikrogliazellen die wichtigsten Klassen. Neurone sind für die elektrochemische Informationsübertragung im Nervensystem von Bedeutung, während Mikrogliazellen wichtigste Komponenten der zellulären Immunantwort im ZNS darstellen und die Makrogliazellen hauptsächlich unterstützende Funktionen wahrnehmen (Jacobson, Developmental Neurobiology, New York: Plenum Press, 1991) . Makrogliazellen bilden im ZNS ein Gerüst und versorgen Neurone mit Stoffwechselmetaboliten. Neuere Untersuchungen zeigen, dass es darüber hinaus zu vielfachen molekularen Wechselwirkungen zwischen Makrogliazellen und Neuronen kommt, welche die Entwicklung des ZNS ermöglichen und auch für seine Funktion und Plastizität von Bedeutung sind (Kettenmann & Ransom, Neuroglia, Oxford: Oxford University Press, 1995).
Solche Interaktionen lassen sich am besten unter definierten Bedingungen an kultivierten Zellen untersuchen. Eine wichtige Voraussetzung für solche Untersuchungen besteht darin, Neurone von anderen Zellen abzutrennen, um dann die direkte Wirkung von, insbesondere glialen, Wachstums- und Differenzierungsfaktoren auf die Neurone zu identifizieren und testen zu können. Bisher ist es lediglich möglich, retinale Ganglienzellen aus der Ratte durch ein so genanntes Immunopanning-Verfahren zu reinigen (Barres et al . , 1998) . Dieses Verfahren nutzt die RGC-spezifische Expression des Zeiladhäsionsproteins Thy-1 aus. Andere Neurone, insbesondere ZNS-Neurone, lassen sich bisher nicht mit der erwünschten Reinheit und Ausbeute isolieren.
Der Erfindung lag demgemäß die Aufgabe zugrunde, Neuronen und differenzierte Stammzellen, insbesondere neuronale und/oder neurale Stammzellen aus einer Probe zu isolieren bzw. anzureichern, um sie damit z.B. für verschiedene Anwendungen bereitzustellen.
Die Erfindung löst dieses technische Problem durch die Verwendung von einem Ll-Promoter-regulierten Protein, einem Ll-assoziierten Molekül, einem Zeiladhäsionsprotein Ll, einem Erkennungsmolekül gegen ein von einem Ll-Promoter- regulierten Protein, gegen ein Ll-assoziiertes Molekül und/oder gegen ein Zeiladhäsionsprotein Ll zur Isolierung von Neuronen und differenzierten Stammzellen, insbesondere neuralen und/oder neuronalen Stammzellen, aus einer Probe.
Die erfindungsgemäße Lehre beruht demgemäß auf der überraschenden Entdeckung, dass Neurone und/oder differenzierte, insbesondere neurale und/oder neuronale, Stammzellen aus einer Probe spezifisch über das Zelladhäsions- protein Ll, über Proteine, die von dem Ll-Promoter regu- liert werden bzw. über ein Ll-assoziiertes Molekül oder über Erkennungsmoleküle, die gegen die genannten Strukturen gerichtet sind, selektiert oder isoliert werden können. Ll und die genannten Ll-Äquivalente werden insbesondere im ZNS spezifisch von Neuronen exprimiert . Überraschenderweise konnte zusätzlich gezeigt werden, dass sich über Ll und die genannten Ll-Äquivalente nicht nur Neurone aus dem ZNS, beispielsweise aus dem postnatalen ZNS, sondern auch aus Stammzellen, insbesondere differenzierten Stammzellen, bevorzugt neuronalen differenzierten adulten oder embryona- len Stammzellen, isolieren lassen. Dies ist vor allem deshalb vorteilhaft, wenn z.B. embryonale Stammzellen durch Zugabe geeigneter Faktoren neural differenzieren. Hierbei enthält die resultierende Zellpopulation neben Neuronen immer auch Gliazellen, in einigen Fällen sogar weitere, nicht-neurale Zelltypen. Eine solche Mischpopulation ist vor allem für eine Transplantationstherapie ungeeignet, weil nicht-neuronale - sich teilende - Zellen die Gefahr bergen, sich nach der Transplantation zu Tumoren zu entwickeln. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Lehre ist es erst- mals möglich, aus Stammzellen eine rein neuronale Zellpopulation, insbesondere für Transplantationszwecke, z.B. bei neurodegenerierten Erkrankungen, zu gewinnen. Weiterhin lassen sich die so gewonnenen oder isolierten Neuronen zur Untersuchung von neuronalen Wachstums- und Differenzie- rungsbedingungen verwenden. Eine Probe im Sinne der Erfindung ist die Bezeichnung für ein durch Probenentnahme entnommenes biologisches Gut oder eine Teilmenge bzw. eine kleine Menge eines solchen, dessen Beschaffenheit chemisch, biologisch, klinisch oder ähnlich geprüft werden kann, insbesondere um aus dieser Probe Neuronen bzw. differenzierte Stammzellen zu gewinnen; die Probe kann z.B. eine Ansammlung von Stammzellen sein oder ein Stück eines Hirns. Die Probenentnahme oder -gewinnung erfolgt insbesondere so, dass die entnommene Teilmenge einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Die durch die Untersuchung bzw. aus der Probe ermittelten Merkmale können der Beurteilung - z.B. vor einer Isolierung von Neuronen oder der Gewinnung von Stammzellen - der durch die Probe erfassten Menge, die Rückschlüsse auf die Gesamtmenge zulässt, verwendet werden. Für die Untersuchung können die Proben durch Mischen, Zerteilen, Separieren, Vorfraktionieren, Zerkleinern, Zugabe von Enzymen oder Markern bzw. anders vorbehandelt werden. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten der Vorbehandlung der Proben bekannt. Selbstverständlich kann es auch vorgesehen sein, dass die Probe so entnommen wird, dass sie keinem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Eine Probe sind vor allem biologische Materialien, die Strukturen umfassen, die mit der Weiter- leitung bzw. Speicherung von Informationen auf biologischer Grundlage geeignet sind. Hierzu gehören beispielsweise das ZNS bzw. Teile davon, das Rückenmark, ein Neokortex, ein Striatum u.a. Es kann sich weiterhin um Flüssigkeiten, Zellansammlung bzw. Gewebe handeln, die Stäbchen-, Zapfen- und Riechzellen umfassen; aber auch um Strukturen, die amakrine Zellen, Horizontalzellen, bipolare Zellen, GOLGI- Zellen, PURKINJE-Zellen, Motoneurone, Haar-, Pyramiden- und/oder Korbzellen umfassen. Die Probe kann demgemäß zahlreiche andere Materialien umfassen, wie zum Beispiel Blut, Lymphe, Urin, Gehirnflüssigkeit, Bioreaktorenflüssigkeiten, Lipid-Mischungen, Knochen, Knorpel und viele andere mehr.
Neuronen im Sinne der Erfindung sind alle Nervenzellen, die als hoch differenzierte Zellen zum Empfang, zur Bearbeitung und zur Weiterleitung nervöser Erregung befähigt sind. Diese Zellen kommen beispielsweise im ZNS, in den Ganglien und in den Sinnesorganen vor und können eine Teilmenge der Probe sein. Die Neuronen bzw. Nervenzellen im Sinne der Erfindung bestehen aus einem Zellkörper (= Corpus neuroni) und einem Zellkern, der von einem Zytoplasma umgeben sein kann. Die Zellen selbst können im Sinne der Erfindung als Perikaryon bezeichnet werden. Die Nervenzelle bzw. das Neuron weist im Sinne der Erfindung z.B. auch Neuro- fibrillen, NISSL-Substanz und Fortsätze sowie ein oder mehrere Dendriten auf .
Bei den Nervenzellen kann es sich beispielsweise um Nervenzellen aus Tieren oder Menschen handeln. Beispielsweise ist es möglich, dass adentritische Nervenzellen oder apolare
Nervenzellen, die fortsatzlos sind, bzw. bipolare Nervenzellen, als sensible bzw. sensorische Nervenzellen mit je einem polaren Dendriten und Neuriten, wie sie zum Beispiel als Körnerzellen der Retina auftreten, oder multipolare Nervenzellen mit mehreren Dendriten und einem langen oder kurzen Neuriten, als motorische Zellen des animalen und autonomen Systems, isoliert werden. Weiterhin können poly- neuritische Nervenzellen mit mehreren Neuriten, beispielsweise als CAJAL-Zelle der Großhirnrinde oder pseudo-uni- polare Nervenzellen, wie sie in sensiblen Kopf- und Rückenmarksganglien vorkommen, oder auch unipolare Nervenzellen, bei denen ursprünglich zwei Fortsätze scheinbar zu einem verschmolzen werden, wie sie beispielsweise in Stäbchen- und Zapfen-Riechzellen vorkommen, isoliert werden, sofern sie unter dem Begriff der Neuronen im Sinne der Erfindung zu subsumieren sind. Ferner ist es selbstverständlich auch möglich, neuro-sekretorische Nervenzellen, wie sie beispielsweise aus dem Hypothalamus gewonnen werden können, oder Neuromelanozyten als Neuronen im Sinne der Erfindung aufzufassen. Weiterhin können die Neuronen, je nachdem an welchem Ort sie sich im Nervensystem befinden, als präganglionäre oder postganglionäre Neuronen sowie als Zwischenneuronenzellen des Interneurons isoliert werden. Weitere Zellen, die erfindungsgemäß als Nervenzellen bzw. als Neuronen definiert werden, sind unter anderem amakrine Zellen, Horizontalzellen, Bipolare, GOLGI-Zellen, PURKINJE- Zellen, Motoneurons, Haar-, Pyramiden- und/oder Korbzellen.
Amakrine Zellen im Sinne der Erfindung sind multipolare Nervenzellen, insbesondere in der inneren Körnerschicht der Netzhaut des Auges, die kurze Fortsätze besitzen. Horizontalzellen sind Zellen, die mit ihren kernhaltigen Zellkörpern in der inneren Körnerschicht der Netzhaut gelegene Interneuronen der Sehbahn darstellen. Zu den Horizontalzel- len können auch die CAJAL-Zellen gehören, die vereinzelt in der oberflächlichsten Großhirnrindenschicht vorkommen und kleine spindelförmige Nervenzellen mit langen horizontal ausgerichteten Fortsätzen sind. Bei den Bipolarzellen oder den bipolaren Neuronen handelt es sich um Nervenzellen mit zwei getrennt abgehenden Fortsätzen, wie sie beispielsweise in den Ganglien des Innenohrs und der Netzhaut vorkommen. GOLGI-Zellen im Sinne der Erfindung sind große Körnerzellen der Kleinhirnrinde mit kurzen Neuriten bzw. Zellen, die unter dem Begriff Cellulae axiramificatae zu subsumieren sind. PURKINJE-Zellen im Sinne der Erfindung sind große, birnenförmige Nervenzellen im Stratum gangliosum der Kleinhirnrinde mit je zwei bis drei senkrecht in die Molekularschicht aufsteigenden und sich dort in einer Ebene verzweigenden Dendriten und den ins Kleinhirnmark absteigenden Neuriten. Als Motoneuron wird das letzte Neuron in der efferenten Innervation der Skelettmuskulatur verstanden, wobei diese aus einer im Vorderhirn des Rückenmarks gelegenen Ganglienzelle und dem Neuriten, der die Nervenzellen innerviert, bestehen. Das Motoneuron bildet eine motorische Einheit des Skelettmuskels und besteht aus einem Alpha- Motoneuron mit allen von diesem Neuron innervierten Muskelfasern, wobei jede Muskelfaser nur eine motorische Endplatte besitzt. Als Haarzellen werden Hörzellen des CORTI verstanden. Es handelt sich hierbei um mit Hörhaaren verse- hene sekundäre Sinnenzellen zwischen den Stützzellen des CORTI-Organes des Innenohres. Sie enden synaptisch an den Dendriten der bipolaren Ganglienzellen des Ganglion spirale. Pyramidenzellen im Sinne der Erfindung sind pyramidenförmige, multipolare Nervenzellen der Großhirnrinde, deren Spitzendendriten in die Molekularschicht aufsteigen, während sich die kürzeren von den Basisecken horizontal verästeln und deren Neuriten von der Zellbasis markwärts ziehen. Korbzellen im Sinne der Erfindung sind sternförmige Nervenzellen in der Molekularschicht des Kleinhirns, deren reichliche von ihren Neuriten gebildete Verzweigungen als Korbfasern die PURKINJE-Zellen umflechten.
Im Sinne der Erfindung sind Nervenzellen insbesondere Zellen, die im ZNS vorkommen, diese können als Neurone bezeichnet werden. Diese Neuronen müssen jedoch im Sinne der Erfindung nicht ausschließlich im ZNS vorkommen. Es ist z.B. auch möglich, dass z.B. Korbzellen durch geeignete Faktoren in Zellen modifiziert werden, die insbesondere Neuroneneigenschaften aufweisen.
Neben den Neuronen bzw. Nervenzellen bzw. Neurozyten können durch die erfindungsgemäße Lehre auch differenzierte Stammzellen, wie beispielsweise neurale und/oder neuronale Stammzellen, aus der Probe isoliert bzw. separiert oder angereichert werden. Aus den adulten neuralen Stammzellen, insbesondere aus dem zentralen Nervensystem, können unter anderem Neurone, Oligodendrozyten und Astrozyten hervorgehen. Diese Zellen finden sich beispielsweise beim Menschen überwiegend in der ventrikulären und sub-ventrikulären Zone des Gehirns und in der sub-granulären Zone des .Gyros dentatos im Hippokampus . Die embryonalen Stammzellen stammen beispielsweise aus der frühen Entwicklungsphase eines Embryos vor der Nidation, und zwar aus der so genannten inneren Zellmasse, der Blastozyste. Diese Zellen sind pluripotent, das heißt, sie sind in sämtliche Gewebe des menschlichen Organismus differenzierbar. Aber anders als eine Zygote können sie sich nicht in komplette Embryos entwickeln. Auch diese Stammzellen sind in der Lage zu Neuronen im Sinne der Erfindung zu differenzieren und sind dann Neuronen im Sinne der Erfindung; auch vor der Differenzierung können sie als solche aufgefasst werden. Für die Verwendung - z.B. in der Therapie - der genannten Stammzellen ist es wichtig, dass die Zellpräparation eine hohe Reinheit aufweist. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Lehre ist es erstmals möglich, beispielsweise die sich gleichzeitig aus den embryonalen Stammzellen entwickelnden insulinproduzierenden Zellen bzw. Blutzellen von den sich entwickelnden Neuronen abzutrennen. Diese so gewonnenen Neuronen können dann zur Transplantation verwendet werden, beispielsweise bei Parkinson- und Alzheimer-Patienten.
Neuronale Stammzellen im Sinne der Erfindung sind auch alle solche Zellen, die als Stammzellen aus dem Nervensystem bekannt sind bzw. sich dort auffinden lassen. In der Bildungszone der Stammzelle ist ungefähr eine von dreihundert Zellen eine Stammzelle. Es ist zum Beispiel möglich, mit Hilfe einer automatischen Flow-Zytometrie aus einem adulten Gehirn eine Zellpopulation mit 80%iger Reinheit zu gewinnen, um dann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Lehre eine nahezu vollständig reine Population an neurona- len Stammzellen bereitzustellen, sofern die Stammzellen Ll, Ll-assoziierte Strukturen bzw. Fragmente oder Äquivalente einer solchen Struktur - z.B. Ll-Homologe wie Neuroglian - aufweisen.
Weiterhin ist es möglich, gewonnene insbesondere neuronale Stammzellen durch - dem Fachmann bekannte Faktoren - so anzuregen, dass sie Astrozyten und Neuronen bzw. Nervenzellen bilden; wobei nie ausgeschlossen werden kann, dass in der Kultur auch Muskelzellen oder andere Zellen auftreten. Die so gewonnenen Zellen können ebenfalls mit erfindungsgemäßen Verfahren separiert werden, da es im Laufe der Individualentwicklung der Zellen möglich ist, die Zellen, die sich als Neuronen entwickeln, von denen abzutrennen, die beispielsweise Gliazelleigenschaften aufweisen oder solche, die Eigenschaften von Astrozyten zeigen. Die neuronalen Stammzellen können aus verschiedensten Regionen des erwachsenen ZNS isoliert werden, beispielsweise in den Wänden der Ventrikel oder im Striatum. Weiterhin sind sie gewinnbar aus der äußeren Germinalzone des Kleinhirns neugeborener Mäuse. Dem Fachmann sind weitere Quellen bekannt, aus denen er neuronale Stammzellen isolieren kann bzw. Stammzellen, die sich zu neuronalen Stammzellen differenzieren lassen.
Stammzellen im Sinne der Erfindung sind demgemäß sowohl embryonale als auch adulte Stammzellen, die insbesondere bereits neural bzw. neuronal differenziert sind bzw. in diesem Sinne differenziert werden können. Es war über- raschend, dass nicht nur Neurone, sondern auch differenzierte embryonal und adulte Stammzellen, insbesondere neuronal differenzierte Stammzellen, sich über Ll bzw. Ll- Äquivalente isolieren lassen. Ll-Äquivalente im Sinne der Erfindung sind alle Strukturen, die mit bestimmten Erken- nungsmolekulen so wechselwirken, dass sie eine Isolierung von Neuronen und differenzierten Stammzellen erlauben. Zum einen werden unter Zeiladhäsionsproteinen Ll neuronale Zelladhäsionsmoleküle verstanden, die zu der Ig-Super- familie bei Vertebraten und Invertebraten gehören. Dem Fachmann ist bekannt, dass außer Ll weiterhin Axonin, Neuroglian, N-CAM, Fascilin, DM-GRASP BEN SCI, IRRI C-RST, der Poliovirusrezeptor und andere zu den neuronalen Zell- adhäsionsmolekülen gehören, die eine enge Verwandtschaft zu Ll aufweisen und demgemäß als Ll-Äquivalente im Sinne der Erfindung aufgefasst werden können. Dem Fachmann sind die Homologien zwischen den Zeiladhäsionsmolekülen der Invertebraten und Vertebraten, insbesondere auf dem Niveau der Sekundär- und Tertiärstruktur, bekannt, z.B. zwischen Neuroglian und Ll und auch zwischen Fascilin und NCAM und zwischen dem irreC-Genprodukt und DM-GRASP. Neben diesen strukturellen Gemeinsamkeiten der neuronalen Zelladhäsionsmoleküle, das heißt neben den Ll-Äquivalenten im Sinne der Erfindung, können diese Moleküle auch das Neuritenwachstum deutlich fördern. Ll im Sinne der Erfindung ist besonders effektiv, indem es insbesondere das Neuritenwachstum auf Schwannzellen durch homophile Bindungsmechanismen zwischen Schwannzellen und Neuronen anregt. Ll wird vor allem in Neuronen und Schwannzellen nach einer peripheren Nerven- läsion vermehrt exprimiert und kann auch mit der axonalen Regeneration assoziiert sein. Zu den Ll-Äquivalenten im Sinne der Erfindung können auch alle Proteine gehören, die von einem Ll-Promoter reguliert werden. Alle Proteine bzw. Lipid- oder Kohlenhydrat-Strukturen, die so mit dem Ll- Protein assoziiert sind, dass sie eine Isolierung von den genannten Stammzellen und Neuronen ermöglichen, sind Ll- assoziierte Moleküle im Sinne der Erfindung. Dem Fachmann ist bekannt, dass Ll-assoziierte Moleküle, beispielsweise auch Zucker bzw. Lipid-Strukturen sein können, die mit Ll bzw. mit Ll-Äquivalenten so assoziiert, beispielsweise ver- bunden sind, dass sie dazu verwendet werden können, um Neuronen, neurale und/oder neuronale Stammzellen aus einer Probe zu isolieren. Dem Fachmann ist bekannt, dass er neben Ll und Ll-Äquivalenten bzw. Ll-assoziierten Molekülen auch Moleküle verwenden kann, die eine enge Verwandtschaft zu Neuroglian bzw. Ll aufweisen, sofern sie in Neuronen bzw. den genannten Stammzellen auftreten. Hierzu gehört beispielsweise auch das Vertebraten-Molekül Contaktin, das lediglich eine FN-III-Domäne weniger besitzt. Da die genannten Ll-Äquivalente während der Evolution des Nerven- Systems über lange Zeiträume konserviert worden sind, stehen dem Fachmann eine Vielzahl von Molekülen, insbesondere Proteine, aber auch mit diesen assoziierte Lipide bzw. Kohlenhydrate, zur Verfügung, die im Sinne der anmeldüngsgemäßen Lehre verwendet werden können. Selbstverständlich kann Ll auch Bestandteil eines Fusionsproteins sein.
Isolieren im Sinne der Erfindung heißt, dass die gewonnenen Neuronen bzw. Nervenzellen oder neuronalen und/oder neuralen Stammzellen mit einer Reinheit von 40 %, bevorzugt 50 %, besonders bevorzugt 60 % und ganz besonders bevorzugt von 70, 80, 90, 95, 97, 99 und über 99,5 % gewonnen werden können. Dem Fachmann sind verschiedene Methoden zur Isolierung von Zellen und zur Bestimmung des Reinheitsgrades bekannt .
Im Sinne der Erfindung ist es selbstverständlich auch möglich, ErkennungsStrukturen, die gegen Ll, gegen Ll-assozi- ierte Moleküle bzw. Proteine, die von dem Ll-Promoter reguliert werden - das heißt im weiteren Sinne von allen Ll- Äquivalenten - zu verwenden, um Neuronen und/oder die genannten Stammzellen zu isolieren. Beispielsweise kann es vorgesehen sein, dass die Erkennungsmoleküle, beispielsweise ein Antikörper gegen das Zelladhäsionsprotein Ll, auf einer Kulturschale oder in einer Chromatographiesäule, die beispielsweise mit Nylonwolle gefüllt ist, immobilisiert vorliegen. Wird nun eine Zellsuspension oder eine Probe, die Neuronen bzw. die genannten Stammzellen umfasst, mit dieser Kulturschale bzw. der Chromatographiesäule in Kontakt gebracht, so können die zu isolierenden Strukturen mit den Erkennungsmolekülen so wechselwirken, dass es möglich ist, alle Zellen, die die genannten Ll-Äquivalente nicht aufweisen, durch Waschen oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren von den zu isolierenden Neuronen bzw. Stammzellen abzutrennen .
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Erkennungsmolekül ein Antikörper, ein Aptamer, ein Lektin, ein Antisensekonstrukt , ein selektiver Chelator, deren Fragmente und/oder eine Kombination aus diesen. Antikörper bedeutet ein Polypeptid, das im wesentlichen von einem Immunglobulin-Gen oder Immunglobin-Genen codiert wird, oder Fragmente davon, das/die einen Analyten - Ll, Ll-assozi- ierte Moleküle, von einem Ll-Promoter-regulierte Proteine, das heißt Ll-Äquivalente - spezifisch bindet/binden und erkennt/erkennen. Bekannte Immunglobin-Gene umfassen sowohl die kappa- , lambda-, alpha-, gamma-, delta-, epsilon- und mu-Gene für den konstanten Bereich als auch die unzähligen Gene für den variablen Immunglobulin-Bereich. Antikörper kommen beispielsweise als intakte Immunglobuline oder als eine Reihe gut charakterisierter Fragmente vor, die mittels Spaltung mit verschiedenen Peptidasen erzeugt werden. Antikörper bedeutet auch modifizierte Antikörper (z.B. oligo- mere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper) . Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff Anti- körper "umfasst auch Antikörper-Fragmente, die entweder mittels Modifikation ganzer Antikörper oder mittels de novo-Synthese unter Verwendung von DNA-Rekombinations- techniken erzeugt worden sind. Der Begriff Antikörper umfasst sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon, wie Fab, F(ab')2 und Fv, die die Epitop-Determinante binden können. Bei diesen Fragmenten ist die Fähigkeit des Antikörpers zur selektiven Bindung seines Antigens oder der Ll- Äquivalente teilweise erhalten geblieben, wobei die Fragmente wie folgt definiert sind:
(1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes Anti- genbindungsfragment eines Antikörper-Moleküls enthält, lässt sich mittels Spaltung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Papain erzeugen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil einer schweren Kette erhalten werden;
(2) das Fab' -Fragment eines Antikörper-Moleküls lässt sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren Kette erhalten werden; pro Antikörper-Molekül werden zwei Fab' -Fragmente erhalten;
(3) F(ab')2, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten lässt; F(ab')2 ist ein Dimer von zwei Fab' -Fragmenten, die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;
(4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält und in Form von zwei Ketten exprimiert wird; und
(5) Einzelketten-Antikörper („SCA") , definiert als gentechnisch verändertes Molekül, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten Polypep- tid-Linker zu einem genetisch fusionierten Einzelketten-Molekül verbunden sind.
Die Verfahren zur Herstellung dieser Fragmente sind auf dem Fachgebiet bekannt (vgl. beispielsweise Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, New York) .
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff Epitop bedeutet eine beliebige Antigen-Determinante auf Antigenen, insbesondere solchen, die mit Ll, Ll-assoziierten Moleküle, wie z.B. Zuckerreste, oder von Ll-Promoter-regulierten Proteinen assoziiert sind, an die das Paratop eines Antikörpers bindet. Epitop-Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächen-Gruppierungen von Molekülen, wie Aminosäuren oder Zucker-Seitenketten, und besitzen normalerweise sowohl spezifische Merkmale der dreidimensionalen Struktur als auch spezifische Ladungsmerkmale.
Der Fachmann kann leicht monoklonale Antikörper im Sinne der Erfindung gegen die erfindungsgemäßen Proteine und die Fragmente davon bzw. andere biologische Strukturen herstellen. Die allgemeinen Methoden zur Herstellung monoklonaler Antikörper unter Verwendung von Hybridom-Techniken sind wohlbekannt. Immortalisierte, Antikörper produzierende Zelllinien können mittels Zellfusion und auch mittels anderer Verfahren, wie direkter Transformation von B-Lympho- cyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit dem Epstein- Barr-Virus, erzeugt werden. Vgl. beispielsweise M. Schreier et al., „Hybridoma Techniques", (1980); Hammerling et al . , „Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas", (1981) ; Kennet et al . , „Monoclonal Antibodies", (1980); vgl. auch die US-Patente 4,341,761, 4,399,121, 4,427,783, 4,444,887, 4,452,570, 4,466,917, 4,472,500, 4,491,632 und 4,493,890. Gruppen von gegen das interessierende Protein erzeugten j monoklonalen Antikörpern oder Fragmenten davon können im
Hinblick auf verschiedene Eigenschaften, nämlich Isotop, Epitop, Affinität, usw., gescreent werden. In einer anderen Ausführungsform können Gene, die monoklonale Antikörper von Interesse codieren, mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten PCR-Verf hren aus Hybridomen isoliert und in geeigneten Vektoren cloniert und exprimiert werden. Bei Verwendung von Immunaffinitätsverfahren eignen sich monoklonale Antikörper zur Aufreinigung der einzelnen Zelle, die Proteine umfassen - wie Ll-Äquivalente -, gegen die sie gerichtet sind. Ungeachtet, ob es sich um monoklonale oder polyclonale Antikörper handelt, weisen die erfindungsgemäßen Antikörper insofern einen zusätzlichen Nutzen auf, als sie als Reagenzien bei Immuntests, wie RIA, ELISA und ähnlichen, eingesetzt werden können. Außerdem können sie zur Isolierung der Ll-Äquivalente oder Domänen aus Zellen oder anderen biologische Proben verwendet werden. Die Antikörper könnten z. B. zur Etablierung eines auf einer Gewebekultur basierenden Tests verwendet werden, um neuartige Ll-Antigene oder neuartige Verbindungen, die die Wechselwirkung von Ll-Antigenen und Rezeptoren und/oder Zielorten modifizieren, zu finden, zu isolieren oder zu modifizieren.
Die humanisierten oder Chimären Antikörper können Teile umfassen, die von zwei unterschiedlichen Arten stammen (z. B. menschlicher konstanter Bereich und Maus-Bindungs- bereich) . Die von zwei unterschiedlichen Arten stammenden Teile können mittels herkömmlicher Verfahren chemisch verbunden oder unter Verwendung gentechnischer Verfahren als einzelnes Fusionsprotein hergestellt werden. Eine DNA, die die Proteine der beiden Teile des Chimären Antikörpers codiert, kann als einzelnes Fusionsprotein exprimiert werden. Ein Antikörper bindet spezifisch an ein Protein beispielsweise eine andere biologische Struktur oder zeigt damit eine spezifische Immunreaktivität, wenn der Antikörper in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Substanzen in einer Bindungsreaktion seine Funktion ausübt, anhand der sich entscheiden lässt, ob das Protein oder eine andere biologische Struktur vorliegt und sich insbesondere die Proteine umfassenden Zellen isolieren lassen. Unter den festgelegten Bedingungen eines Immuntests binden die angegebenen Antikörper vorzugsweise an ein spezielles Protein, während keine signifikante Bindung an andere in der Probe vorhandene Proteine erfolgt. Eine spezifische Bindung an ein Protein unter solchen Bedingungen erfordert einen Antikörper, der aufgrund seiner Spezifität für ein spezielles Protein, wie z.B. Ll, selektiert worden ist. Zur Selektion von Antikörpern, die mit einem speziellen Protein eine spezifische Immunreaktivität zeigen, können verschiedene Immuntest-Ausführungsformen verwendet werden. Beispielsweise werden Festphasen-ELISA- Immuntests routinemäßig zur Selektion monoklonaler Antikörper verwendet, die eine spezifische Immunreaktivität mit einem Protein zeigen. Bei Harlow und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, (1988) , Cold Spring Harbor Publications, New York, findet man eine Beschreibung von Immuntest-Aus- fuhrungsformen und Bedingungen, die sich zur Bestimmung einer spezifischen Immunreaktivität verwenden lassen.
Bevorzugt ist der Antikörper ein Single chain antibody, ein Multibody, ein Fab-Fragment, ein MHC-Molekül, ein MHC-Pep- tid, ein Fusionspeptid, ein Konformationsepitop imitierender Mimikrypeptidsinglechain-Antikörper, ein polyklonaler, ein monoklonaler, ein humanisierter und/oder ein markierter Antikörper. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung sind die Neuronen afferente, efferente, interkaläre, peripher-moto- rische, zentral-motorische, präganglionäre, postganglionäre und/oder sensible Neuronen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Isolieren von Neuronen, neuralen und/oder neuronalen Stammzellen aus einer Probe, wobei ein Erkennungsmolekül gegen ein von einem Ll-Promoter-regulierten Protein, gegen ein Ll-assozi- iertes Molekül und/oder gegen Ll mit der Probe in Kontakt gebracht wird, wobei Erkennungsmolekül-Ll-Assoziate gebildet und die Assoziate separiert werden. Für das erfindungsgemäße Verfahren gelten - mutatis mutandis - die Definitionen wie bei der obigen Verwendung. Es kann daher auf diese verwiesen werden. Die Erkennungsmoleküle gegen das von einem Ll-Promoter-regulierte Protein, gegen das Ll-assozi- ierte Molekül und/oder gegen Ll bilden mit den genannten Strukturen Assoziate. Im Gegensatz hierzu werden mit den Strukturen, insbesondere Zellen, die in der Probe befind- lieh sind und die genannten Ll-Äquivalente nicht aufweisen, keine Assoziate gebildet. Durch den Unterschied der Ladung, der Dichte bzw. der Größe zwischen den Zellen, die keine Assoziate bilden, und solche, die ein Bestandteil der Assoziate sind, ist es möglich, diese unterschiedlichen Zellen voneinander zu trennen. Dem Fachmann sind hierzu verschiedene Methoden bekannt. Dem erfindungsgemäßen Verfahren können mehrere mechanische, physikalische, chemische und/oder biologische Schritte vor- oder nachgeschaltet sein; es ist beispielsweise möglich, dass die Probe zunächst mit Enzymen oder einfach durch mechanisches Zerkleinern oder durch bestimmte Formen der Ultraschallbehandlung aufgelockert wird, um das intakte oder weniger intakte Gewebe als Einheit aufzulösen, ohne hierbei die einzelnen Zellen, insbesondere die zu isolierenden Neuronen bzw. die genannten Stammzellen zu zerstören. Somit liegen als Ergebnis des Verfahrens die Assoziate vor, die separiert werde können, womit die isolierten Zellen erhalten werden. Es ist insbesondere möglich, die Zellen von den Erkennungsmolekülen in einem weiteren Schritt abzutrennen, wobei die Assoziate aufgelöst werden. Sofern die Erkennungsmoleküle auf einem Träger immobilisiert sind, können die isolierten Zellen mit einem Enzym von diesen abgetrennt werden. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, die Zellen nicht von den Erkennungsmolekülen, wie z.B. Chelatoren, abzutrennen, wenn diese insbesondere einen günstigen Einfluß auf die Physiologie der Zellen haben. Somit kann das separierte Assoziat eine isolierte Zelle im Sinne der Erfindung sein, wie auch die Zelle, die kein Teil eines Assoziates mehr ist, da sie vom Erkennungsmolekül abgetrennt wurde .
Dem Fachmann sind verschiedene Standardwerke der Histologie bzw. Gewebe bzw. Zellkulturtechnik bekannt, aus denen er entnehmen kann, wie die Probe entsprechend der in ihr befindlichen Zellen vorbehandelt werden sollte, um die Einheit der Probe, beispielsweise ein embryonales Mäusegehirn, so aufzulösen, dass Zellen separiert werden können. Es kann beispielsweise vorgesehen sein, zunächst das Calcium aus dem Gewebe auszuwaschen, damit die Zellverbindungen gelockert werden. Es kann jedoch je nach Art der Proben auch sinnvoll sein, zunächst Calcium in das Gewebe einzubringen, um den Effekt der Lockerung der Zellverbindungen zu erreichen.
In einem weiteren Schritt kann es sinnvoll bzw. vorteilhaft sein, die extrazelluläre Lösung in ihrem Ionengehalt an die intrazelluläre anzugleichen, damit die Zellen insbesondere kleine Verletzungen während der Isolationsprozedur besser überstehen. Je nach den zu gewinnenden Zellen ist es selbstverständlich auch möglich, die extrazelluläre Lösung nicht an die intrazelluläre Lösung in ihrem Ionengehalt anzugleichen.
Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass Enzyme perfundieren, die die Zeil-Zeil-Verbindung lockern und das extrazelluläre Kollagengerüst, welches das Gewebe stabilisieren kann, auflösen. Hierzu ist es beispielsweise vorteilhaft, Enzyme, wie Trypsin und Kollagenase, nacheinander in einer Lösung mit einem hohen Kaliumanteil anzuwenden. Sofern die Probe kein oder nur ein unwesentliches Kollagengerüst umfasst, kann auf diesen Schritt verzichtet werden; auch wenn nicht gewünscht wird, dass die zu isolierenden Zellen mit Enzymen, wie Trypsin und/oder Kollagenase, behandelt werden bzw. wenn kein hoher Anteil an Kalium gewünscht wird. Es kann jedoch auch eine Enzymbehandlung vorgesehen sein, die auf eine Lösung mit einem hohen Kaliumanteil verzichtet und statt dessen einen Anteil an anderen ein-, zwei- oder mehrwertigen Elementen, insbesondere an Metall- ionen, enthält.
In einem weiteren Schritt kann das aufgelockerte Gewebe zerschnitten und durch mechanisches Rühren einzelne Zellen aus dem Gewebsverband herausgelöst werden. Zeitgleich kann es beispielsweise möglich sein, die zu isolierenden Zellen wieder in eine Ionenlösung normaler Zusammensetzung zu überführen, wobei normale Zusammensetzung heißt, dass die Lösung sicherstellt, dass die pathologischen gegenüber den physiologischen Zuständen innerhalb der zu isolierenden nicht überwiegen und somit eine weitere Kultivierung bzw. ein Wachstum oder eine Di ferenzierung der Zellen ermöglicht werden kann. Bei einem weiteren Schritt kann es vorteilhaft sein, Zellen über Zentrifugations- , Sedimentations- oder andere Reinigungsschritte vorzutrennen.
Die weitere Reinigung kann beispielsweise in Chromatographie-Säulen, in der Zellelektrophorese, im FACS-Gerät oder durch andere Methoden der Zellreinigung und Zellisolierung erfolgen. Es ist jedoch auch möglich, diese Schritte als das erfindungsgemäße Verfahren - und nicht als Vorabprozedur - durchzuführen.
Bei der Chromatographie, wie bei der Säulen-Chromatographie-Trennung, kann beispielsweise Nylonwolle eingesetzt werden, an die die Erkennungsmoleküle immobilisiert sind, damit die zu isolierenden Zellen so mit der Wolle inter- agieren, dass eine Isolierung möglich ist.
Weiterhin ist es beispielsweise möglich, die Zellen durch Zentrifugation voneinander zu trennen. Insbesondere ist es möglich, die Zellen mit Hilfe einer rotierenden Zentrifuge zu separieren, wobei die Zellen über eine so genannte Glockenfüllung aufgefüllt werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, die Trennung in üblicherweise verwendeten Zentrifugenröhrchen vorzunehmen. Aber auch alle Verfahren zur Zellseparation, beispielsweise zur Herstellung von Konzentraten können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Hierzu kann auch die Zellseparation mittels Magnetobeads gehören. Das heißt, alle Trennverfahren, die auf den Unterschieden in der Zelldichte, wie beispielsweise die isopyknische Zentrifugation, die Zellgröße, wie beispielsweise die Elutriations-Zentrifugation, die Adhärenzeigenschaften, wie beispielsweise die Adsorption an Plastic oder die Nylon- Woll-Fraktionierung, können eingesetzt werden. Neben diesen kann jedoch auch eine Separation, die von magnetischen Partikeln ausgeht, zur Zellseparation bzw. zur Isolierung eingesetzt werden.
Eine solche Auftrennung ist beispielsweise mit so genannten MACS bzw. Mini-MACS oder mit bestimmten FACS-Geräten möglich.
All die genannten Verfahren können selbstverständlich miteinander kombiniert werden, d.h., es lassen sich beispielsweise die Magnetobead-Trennung und die Flow-Cyto- metrie kombinieren. Nacheinander eingesetzte Erkennungs- moleküle müssen hier jedoch nicht dasselbe Epitop erkennen und können dadurch konkurrieren. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten bekannt, diese und andere Probleme zu umgehen.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden als Neuronen afferente, efferente, interkaläre, peripher- motorische, zentral-motorische praganglionäre, postganglio- näre isoliert.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform sind die Neuronen adendritisch, apolar, bipolar, multipolar, polyneuri- tisch, pseudounipolar, unipolar und/oder neurosekretorisch.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird als Probe ein Hirn, ein Striatum, ein Neokortex, ein Rückenmark und/oder eine Teilmenge hiervon eingesetzt.
Weiterhin ist es bevorzugt, als Probe Stammzellen, insbesondere differenzierte Stammzellen einzusetzen, wobei besonders bevorzugt neurale und/oder neuronale Stammzellen eingesetzt werden. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst die Probe eine neuraldifferenzierte embryonale und/oder eine neuraldifferenzierte adulte Stammzelle.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden als Erkennungsmoleküle Moleküle ausgewählt aus der Gruppe umfassend einen Antikörper, ein Aptamer, ein Lektin, ein Antisensekonstrukt, einen selektiven Chelator, deren Fragmente oder eine Kombination derselben, eingesetzt.
Besonders bevorzugt ist es, wenn als Antikörper in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Antikörperfragment, ein Single chain antibody, ein Multibody, ein Fab-Fragment, ein MHC-Molekül, ein MHC-Peptid, ein Fusionspeptid, ein Konfor- mationsepitop imitierender Mimikrypeptidsinglechain-Anti- körper, ein polyklonaler, ein monoklonaler, ein humanisierter und/oder ein markierter Antikörper eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung sind die Erkennungsmoleküle immobilisiert. Unter Immobilisierung im Sinne der Erfindung sind alle Methoden zur Einschränkung der Beweglichkeit und Löslichkeit von Erkennungsmolekülen oder Ll-Äquivalenten auf chemischen, biologischen und/oder physikalischen Wegen zu verstehen. Die Immobilisierung kann durch unterschiedliche Methoden erfolgen, wie der Bindung der Erkennungsmoleküle untereinander oder an Kulturschalen bzw. Trennoberflächen - wie z.B. Nylon-Wolle -, durch Festhalten im Netzwerk einer polymeren Trenn-Matrix oder Umschließen durch Membranen. Durch die Immobilisierung werden die Erkennungsmoleküle nicht nur wiederverwendbar, sondern können nach dem Prozess der Interaktion mit der biologischen Probe leicht wieder abgetrennt werden. Sie lassen sich in sehr viel höheren lokalen Konzentrationen und in kontinuierlichen Durchflusssystemen einsetzen. Die Bindung bzw. die Immobilisierung der Erkennungsmoleküle an eine Oberfläche kann durch direkte Trägerverbindung - insbesondere vermittelt über eine Spacer- und durch QuerVernetzung erfolgen. Die Trägerbindung bzw. Quervernetzung erfolgt gemäß der Erfindung insbesondere ionisch/adsorptiv oder durch kovalente Bindung. Die QuerVernetzung im Sinne der Erfindung ist eine Vernetzung der Erkennungsmoleküle untereinander oder mit anderen Polymeren. Bei der Immobilisierung durch Einschluss werden die Erkennungsmoleküle in Gelstrukturen bzw. in Membranen so eingeschlossen, dass eine Interaktion und eine Isolierung der gewünschten Zellen möglich ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung sind die Erkennungsmoleküle physikalisch, chemisch und/oder biologisch durch In si tu-Synthese oder durch Ablegen zuvor synthetisierter Erkennungsmoleküle immobilisiert.
In einer vorteilhaften Ausfuhrungsform des Bindungsassays werden die Erkennungsmoleküle physikalisch, chemisch und/oder biologisch durch In situ-Synthese oder durch Ablegen zuvor synthetisierter Erkennungsmoleküle auf einer Oberfläche immobilisiert. Unabhängig von der Art der immobilisierten Erkennungsmoleküle kann dies auf zwei prinzipiell verschiedenen Wegen hergestellt werden:
1. Ablegen und Immobilisieren von zuvor synthetisierten oder aus Bibliotheken stammenden Erkennungsmolekülen an definierten Positionen eines insbesondere funktionalisierten Trägermaterials. Hierfür können sowohl Spotting als auch Druckverfahren eingesetzt werden. Unter Spotting versteht man Verfahren, bei denen Flüssigkeitstropfen abgelegt werden, wobei durch Oberflächenwechselwirkung und Trocknen im Wesentlichen runde Spots entstehen. Andere Druckverfahren ermöglichen das Substrat in definierten Flächen auf der Oberfläche abzulegen.
2. In situ-Synthese der Erkennungsmoleküle an definierten Positionen einer Oberfläche - z.B. einem Kulturgefäß oder einem Chromatographieträgermaterials - durch sukzessive Kopplung monomerer Synthesebausteine.
In einer weiteren vorteilhaften Ausfuhrungsform werden die Erkennungsmoleküle durch Contact Tip Printing, Ring and Pin Printing and Nanopipetting, Buble Jet Printing, TopSpot Printing, Micro Contact Printing, Micro Fluidic Networks- Methoden, Photolithographic Activation-Verfahren, Photo- resist Lithography, Electrochemical Focusing und/oder Micro Wet Printing immobilisiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist die Oberfläche - z.B. der Kultur- oder Waschgefäße oder anderer Geräte oder Materialien, die zur Trennung einge- setzt werden - mit Poly-L-Lysinen, Aminosilanen, Aldehyd- silanen, Epoxy-Gruppen, Streptavidin, Polylysinen, Silanen, reaktiven Gruppen, Polyacrylamid-Pads, immobilisierter Nitrocellulose, aktivierten Aldehyden, Agarose-Aldehyd- Gruppen und/oder Tresyl-Gruppen beschichtet. Durch derartige Substratoberflächenbehandlungen ist es vorteilhafterweise möglich, die Bindungskapazität der Oberfläche so zu verbessern, dass die Erkennungsmoleküle sehr gut über einen längeren Zeitraum immobilisiert bleiben können. Weiterhin ist es selbstverständlich möglich, die Oberfläche so zu behandeln, dass die zu isolierenden Zellen gut haften und die anderen Bestandteile der Probe weniger gut bzw. umgekehrt. Selbstverständlich kann die Oberflächenmodifikation ganz allgemein, insbesondere durch Einwirken von biologischen, physikalischen und/oder chemischen Einflüssen erfolgen. Physikalisches Einwirken sind beispielsweise das Polieren, Ätzen, Beizen, Sandstrahlen, aber auch physikalische Verfahren, die zu einem Härten, Beschichten, Vergüten, Überziehen mit Schutzhäuten und ähnlichem führen. Eine Oberflächenbehandlung durch biologische Einwirkung kann beispielsweise das Bewachsen durch ausgewählte Zellen umfassen. Eine chemische Modifikation der Oberfläche beinhaltet beispielsweise die Behandlung mit Säuren, Basen, Metalloxiden und anderen. Die Oberfläche kann so modifiziert werden, dass die Detektions- molekule bzw. die Erkennungsmoleküle besonders gut haften bzw. so haften, dass sie in ihrer Aktivität nicht nachteilig modifiziert werden. Eine Oberflächenmodifizierung des Trennmaterials oder der Kulturgefäße umfasst selbstverständlich auch eine Behandlung, die zu einer erhöhten Stabilität oder zu verbesserten Kulturbedingungen führen. Es können selbstverständlich auch klassische Oberflächenmodifizierungen aus der Histologie vorgenommen werden, wie das Beschichten mit z.B. Eiweißglycerin, Polylysin, aktivierten Dextranen und/oder Chromgelatine.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung bilden sich als Assoziate Immunkomplexe. Die Immunkomplexe entstehen insbesondere bei einem optimalen Konzentrationsverhältnis zwischen Ll, dem Ll-assoziierten Molekül bzw. dem von einem Ll-Promoter-regulierten Protein und den Erkennungsmolekülen. Im Sinne Erfindung kann zwischen löslichen und zirkulierenden Immunkomplexen unterschieden werden.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung sind die Immunkomplexe Antikörper-Antigen-Komplexe oder Lektin- Antigen-Komplexe .
Das Antigen ist im Sinne der Erfindung das Zelladhäsions- protein Ll, das mit dem Ll-assoziierte Molekül und/oder das von einem Ll-Promoter regulierte Protein bzw. die Ll-Äquivalente .
Bei den Lektinen kann es sich insbesondere um Strukturen handeln, die sehr spezifisch mit Molekülen interagieren, die mit Ll so assoziiert sind, dass über diese eine Isolierung der gewünschten Zellen möglich ist. Derartige Lektine können beispielsweise isoliert werden aus folgenden Organismen: Abrus precatorius, Adenia digitata, Agaricus bisporus, Aleuria aurantia, Amaranthus caudatus, Amphicarpaea biacteata, Anguilla anguilla, Arachis hypogaea, Artocarpus integrifolia, Bauhinia purpurea alba, Brachypodium sylvaticum, Canavalia ensiformis, Carcino scorpius rotunda canda, Cicer arietinum, Codium fragile, Crotalaria juncea, Cytisus sessilifolius, Datura stramonium, Dioclea grandiflora, Dolichos biflorus, Erythrina coralldendron, Erythrina cristagalli, Euonymos europaea, Galanthus nivalis, Glycine max, Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia, Helix aspersa, Helix pomatia, Hippeastrum hybrid, Hordeum vulgäre, Hura crepitaus, Latyrus odoratus, Latyrus sativus, Latyrus tingitanus, Lens culinaris, Limax glavus, Limulus polyphemus, Lotus tetra- gonolobus, Lycopersicon esculentum, Maackia amurensis, Maclura pomifera, Macrotyloma axillare, Momordica charantia, Narcissus pseudonarcissus, Oryza sativa, Phaseolus coccineus, Phaseolus limensis, Phaseolus vulgaris, Phytolacca americana, Pisum sativum, Phosphocarpus tetragonolobus , Pseudomonas aeruginosa, Ricinus communis, Sambucus nigra, Seeale cereale, Solanum tuberosum, Sophora japonica, Triticum vulgaris, Tritrichomonas mobilensis (Protozoe) , Ulex europaeus, Vicia cracca, Vicia ervilia, Vicia graminea, Vicia faba, Vicia sativa, Vicia villosa, Viscum album, Wisteria floribunda, weiterhin können folgende humane, insbesondere rekombinant hergestellte, Lektine eingesetzt werden: E-Selecin (human, recombinant) , L-Selectin (human, recombinant) und/oder P- Selectin (human, recombinant) sowie Galectine (human) .
Die Antikörper können aus jedem Organismus gewonnen werden, der in der Lage ist, aufgrund der Auseinandersetzung mit antigenen immunologischen Erkennungssubstanzen, insbesondere Antikörper, gegen diesen zu bilden.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung sind die Assoziate Antisensehybride. Bevorzugt sind hierbei DNA-DNA, RNA-RNA und/oder RNA-DNA Antisensehybride. Die Hybridisierung ist im Sinne der Erfindung die sequenzabhängige Paarung von einzelsträngigen RNA- oder DNA-Molekülen zu einem RNA/DNA-Hybrid. Der Begriff Antisense drückt hierbei die jeweils komplementäre Struktur eines Einzelstranges gegenüber einem anderen Einzelstrang aus. Dem Fachmann sind zahlreiche Antisensetechniken bekannt, insbesondere aus dem Bereich des elektrochemischen Nachweises von Oligonukleotiden. Ihm ist daher auch bekannt, wie die Antisensekonstrukte verwendet werden müssen, beispielsweise in immobilisierter Form, um sie zur Isolierung von den gewünschten Zellen zu verwenden. In diesem Falle würden die Antisensekonstrukte als so genannte Fängersequenzen dienen, die beispielsweise an eine Oberfläche -z.B. einer Kulturschale - gebunden sind und komplementär zu einem Teil einer Nukleinsäurestruktur sind, die für ein Ll-assoziiertes Molekül, einem von einem Ll- Promoter regulierten Protein bzw. von einem Ll codieren. Es kann beispielsweise auch vorgesehen sein, die Antisense- konstrukte zunächst zu verwenden, um die entsprechenden Strukturen zu detektieren, um sie dann auf Proteinebene beispielsweise mit Antikörpern zur Isolierung der gewünschten Zellen zu verwenden. In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung erfolgt die Separierung der gewünschten Zellen durch die unterschiedliche Dichte, Größe und/oder Ladung der Neuronen, der neuronalen und/oder neuralen Stammzellen, die in Form von Assoziaten vorliegen, und von Bestandteilen der Proben, die keine Assoziate umfassen. Der Begriffe keine Assoziate umfassen bezieht sich auf Bestandteile der Probe, die im Wesentlichen keine Ll-Zeiladhäsionsproteine, keine Ll-assoziierten Moleküle und/oder keine von einem Ll- Promoter regulierten Proteine umfassen bzw. eine Konzentration dieser Strukturen in einem solchen geringen Maße aufweisen, dass eine Isolierung über sie nicht möglich ist. Die Bestandteile der Probe jedoch, die diese Strukturen aufweisen, bilden mit den ErkennungsSequenzen die Ll-Erken- nungsmolekul-Assoziate, wobei in der Probe sowohl Assoziate als auch Proteine, Zellen, Gewebestückchen und andere biologische Einheiten ohne diese Assoziate vorliegen. Diese beiden Gruppen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Dichte, Größe und/oder Ladung.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden diese Assoziate mittels Affinitätschromatographie, Zytolyse, FACS, Dichtegradientenseparation, Adhäsion, Agglutination, Rosettenbildung und/oder Zellelektrophorese voneinander separiert bzw. isoliert. Dieses Prinzip kann wie folgt an einem nicht limitierenden Beispiel illustriert werden: Es kann beispielsweise vorgesehen sein, dass die Erkennungsmoleküle immobilisierte Antikörper auf einer Petrischale sind. Auf diese Petrischale kann eine Zellsuspension gegeben werden, die unter anderem auch Neuronen enthält. Diese können beispielsweise auf der Petrischale als so genannte Ll-positive Zellen durch die Ausbildung der Assoziate isoliert werden. Es kann aber auch vorgesehen sein, dass die Erkennungsmoleküle als Säulen- material beispielsweise in Chromatographiesäulen verwendet werden bzw. dass diese Erkennungsmoleküle an solches Säulenmaterial gebunden werden, um mit Hilfe dieses Säulenmaterials eine Zellsuspension zu trennen, wobei die Ll- positiven Zellen an dem Säulenmaterial haften bleiben und alle nicht Ll-positiven Zellen die Säule passieren. Die gebundenen Zellen werden dann durch bestimmte Elutionsverfahren von dem Säulenmaterial getrennt.
Im Sinne der Erfindung sind Ll-positive Zellen alle Zellen, die Ll bzw. Ll-assoziierte Moleküle oder von einem Ll- Promoter regulierte Proteine in einer Konzentration bzw. in einer Struktur aufweisen, dass über sie eine Isolierung von Neuronen, neuralen und/oder neuronalen Stammzellen aus einer Probe möglich ist. Dem Fachmann sind weitere Verfah- ren der Zelltrennung bekannt, wie beispielsweise die Zellseparation mittels Magnetobeads bzw. das "panning"- Verfahren bzw. das FACS, die Adsorption an Plastik, die Nylon-Woll-Fraktionierung, verschiedene Formen der Zentrifugation, die die Zellgröße bzw. Zelldichte als Unterschei- dungsmerkmal der Zellen, die als Assoziate bzw. als Nicht- Assoziate vorliegen, nutzen. Bei der Magnetobead-Zellseparation dienen die Ll-Äquivalente als Oberflächenmarker . Wobei die dann spezifischen Erkennungsmoleküle als Magneto- bead-gekoppelte Erkennungsmoleküle eingesetzt werden können .
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform wird die Probe zunächst mit einer SH-Proteinase vorbehandelt. Bevorzugt ist hierbei, dass die SH-Proteinase Papain ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass in der Probe zunächst die Mikrogliazellen abge- reichert werden. Diese Abreicherung kann beispielsweise aus einem, zwei oder mehreren Substraktionsplatten erfolgen, indem die Subspension beispielsweise mit anti-Makrophagen- Antikörpern versetzt und nacheinander auf zwei mit sekundären Antikörpern geschichtete Schalen gegeben wird. Hierbei bleiben beispielsweise Mikrogliazellen, da sie an die Fc- Fragmente der Antikörper binden, an den Schalen haften.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass die isolierten Neuronen, neuralen und/oder neuronalen Stammzellen mit Trypsin von den immobilisierten Erkennungsmolekülen oder von den Oberflächen der Kultur- oder Trennmaterialien gelöst werden. Die Ll-positiven Zellen werden beispielsweise von anti-Ll Antikörperbeschichteten Kulturschalen durch die Behandlung von Trypsin von den Schalen gelöst.
Bevorzugt ist nach einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung, dass die so isolierten Zellen dann auf Zellkulturschalen plattiert werden, die mit Poly-D-Lysin und/oder Laminin beschichtet sind.
Die Erfindung betrifft auch gereinigte Neuronen-, neurale und/oder neuronale Stammzellenpopulationen insbesondere erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren; sie betrifft demgemäß aber auch Zellpopulationen mit den entsprechenden Reinheitsgraden, die anders gewonnen werden können. Bevorzugt sind hierbei Zellpopulationen, die mit einer Reinheit von über 90 % vorliegen. Das heißt, die Zellen liegen ohne das Material vor, mit dem sie in ihrem natürlichen Zustand assoziiert sind bzw. höchstens mit einem Teil davon. Bezogen auf das Gewicht bzw. das Volumen der Gesamtzellen in einer bestimmten Probe machen die aufgereinigten Zellen mindestens 90 % aus. Am bevorzugtesten sind die isolierten Zellen im Wesentlichen frei von anderen Zellen aber auch von Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Substanzen, die so mit den Zellen assoziiert sind, dass der Fachmann sie nicht als Zellen mit hoher Reinheit bzw. als isolierte Zellen auffassen würde. Das heißt selbstverständlich nicht, dass die Zellen nicht mit Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten assoziiert sein können, insbesondere dann, wenn es sich hierbei um Moleküle handelt, die von den Neuronen, neuralen und/oder neuronalen Stammzellen selbst synthetisiert werden. Im Wesentlichen isoliert bzw. im Wesentlichen frei bedeutet, dass die Zellen mindestens zu 90 %, vorzugsweise zumindest zu 95 %, bevorzugt zumindest zu 97 %, und besonders bevorzugt zu mindestens 98 % und ganz besonders bevorzugt von über 99 % frei von anderen Zellen sind, mit denen sie in natürlicher Weise assoziiert sind. Die Erfindung betrifft auch die genannten Zellpopulationen mit einer hohen Reinheit .
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung liegen die Zellen mit einer Reinheit von 95 % vor. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung liegen die Zellen mit einer Reinheit von über 97 % vor. In einer weiteren ganz besonders bevorzugten
Ausfuhrungsform der Erfindung liegen die Zellen mit einer Reinheit von über 98 % vor. Und in einer weiteren ganz besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung liegen die Zellen mit einer Reinheit von über 99 % vor.
Die Erfindung betrifft auch einen Aufreinigungskit umfassend ein Erkennungsmolekül gegen ein von einem Ll-Promoter regulierten Protein, gegen ein Ll-assoziiertes Molekül und/oder gegen das Zelladhäsionsprotein Ll . Mit Hilfe dieses Kits ist es dem Fachmann möglich, die genannten
Zellen, die aufgereinigt werden sollen, zu isolieren. Die Isolierung erfolgt bevorzugt mit beschriebenen Verfahren. Durch die Bereitstellung der Lehre kann der Fachmann jedoch diese durch Routineversuche bzw. durch äquivalente Anwen- düngen isolieren, wobei diese Routineverfahren und Äquivalente von der anmeldungsgemäßen Lehre miterfasst sind.
Die Erfindung betrifft auch einen Microarray umfassend ein Erkennungsmolekül gegen ein von einem Ll-Promoter regulierten Protein, gegen ein Ll-assoziiertes Molekül und/oder gegen ein Zeiladhäsionsprotein Ll .
Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Es wurde ein immunopanning-Verfahren etabliert, das es erlaubt, Neurone aus den Hippokampi postnataler Mäuse über das neuronspezifische Antigen Ll (Rathjen & Schachner, 1984) zu reinigen. Fig. 1 verdeutlicht das Vorgehen zur Herstellung gereinigter Hippokampusneurone . Aus einer Suspension dissoziierter Hippokampi wurden auf zwei Subtraktionsplatten zunächst Mikrogliazellen abgereichert . Dann wurden auf der Selektionsplatte Ll-positive Zellen isoliert. Durch das immunopanning über Ll konnten aus den Hippokampi von 10-15 postnatalen Mäusen (Tag 6-7) im Mittel 294,000 ± 37,000 Zellen (n = 11 Aufarbeitungen) isoliert werden.
Durch das immunopanning konnte eine große Anzahl von Zellen isoliert werden. Nun war es wichtig zu klären, ob es sich bei diesen Zellen um Neurone handelte und ob sich in den Kulturen auch nicht-neuronale Zellen befanden. Nach 2 Tagen in Kultur zeigten alle Zellen neuronenähnliche Morphologie und Immunoreaktivität für Antikörper gegen die Neuronen- marker Tau, MAP2 , Neurofilament und Synapsin (Fig. 2). Des weiteren besaßen die Zellen axonale Wachstumskegel. Die Differenzierung von Neuriten in Axone lässt sich daraus ableiten, dass sich einige Fortsätze gegen den Axonmarker Tau, aber nicht gegen den Marker für Dendriten MAP2 färben ließen (Fig. 2a). Außerdem hatten einige Wachstumskegel Synapsin-positive Granula, die typisch für Wachstumskegel von Axonen sind (Fig. 2b). Diese Ergebnisse belegen, dass es sich bei den isolierten Zellen um Neurone handelt. Es ließ sich zeigen, dass auf der Selektionsplatte 17 ± 2% (Mittelwert ± Standardfehler; n = 4 Aufarbeitungen) aller Neurone, die in der Suspension dissoznerter Hippokampi enthalten waren, isoliert werden konnten.
Als nächstes wurde untersucht, ob die Kulturen außer Neuronen auch andere Zelltypen enthielten. Dazu wurden lmmuno- zytochemische Färbungen gegen Marker für eine Reihe nichtneuronaler Zelltypen durchgeführt (Fig. 3). Der Nachweis von Makrogliazellen erfolgte durch Färbungen gegen die spezifischen Marker 2 ' , 3 ' -Zyklo-nucleotιd-3 ' -phosphohydro- lase (CNPase) und 04 für Oligodendrozyten und deren Vorlauferzellen und gegen glial fibrillary acidic protein (GFAP) für Astrozyten. Da nicht alle Astrozyten des Hippokampus GFAP exprimieren, wurde auch gegen SlOOß gefärbt, einen weiteren Astrozytenmarker . Fibroblasten wurden über Fibronectin nachgewiesen, Mikrogliazellen über Gπffonia Simplicifolia Lectin I Isolectin B4 (GSL I-B4). Kontroll- expeπmente zeigten, dass sich diese nicht-neuronalen Zell- typen anhand der verwendeten Marker m 1-2 Tage alten Kontrollkulturen, die eine gemischte Zellpopulation aus dissoziierten Maus-Hippokampi enthielten, zuverlässig nachweisen ließen (Fig. 3b) . Kulturen aus Neuronen, die über Ll-im unopanning isoliert wurden, enthielten keine Astro- zyten. Oligodendrozyten ließen sich nur zu einem sehr geringen Anteil von < 0.1 % (n = 4 Kulturen; Fig. 3a) nachweisen. Die Kulturen waren auch frei von Fibroblasten oder Mikrogliazellen (n = 3 Kulturen, 1363 Zellen) . Diese Ergebnisse zeigen, dass sich durch das neue lmmuno- panmng-Verfahren Zellpopulationen gewinnen lassen, die zu > 99.9 % aus Hippokampusneuronen bestehen.
Die Zellisolierung über Ll erwies sich auch als geeignet, um neural differenzierte embryonalen Stammzellen Neurone zu reinigen. Es ließ sich zeigen, dass Fasern, die aus Embryoid Bodies (EBs) nach Differenzierung durch Retinol- saure auswachsen, Ll exprimieren. Durch ein Immunopanning dissoznerter EBs ließ sich eine große Anzahl Zeller isolieren, die nach einwochiger Kultivierung neuronahnliche Morphologie und Immnunoreaktivitat für den Neuronmarker MAP2 zeigten. Nur ein geringer Anteil der Zellen (< 99 %) besaß keine Fortsatze und/oder keine MAP2-Expressιon .
Zusammenfassend lasst sich feststellen, dass mit dem erfin- dungsgemaßen Verfahren Neurone aus gemischten Zellpopulationen sehr effektiv isoliert werden können. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, mit hohem Reinheitsgrad Neurone entweder aus postnatalem Hirngewebe oder aus neural differenzierten Stammzellen anzureichern. Auf diese Weise gereinigte Neurone eignen sich zur Untersuchung neuronaler Wachstums- und Differenzierungsbedingungen. Des Weiteren bieten sie gegenüber gemischten Zellpopulationen Vorteile bei der Transplantation für die Behandlung neurodegenera- tiver Erkrankungen.
Fig. 1 Aufreinigung von Hippokampusneuronen.
Hippokampi aus 10-15 postnatalen Mausen (Tag 6-7) wurden mit Papain vorbehandelt und dann mechanisch dissoziiert. Aus der Zellsuspension wurden zunächst Mikrogliazellen abgereichert , indem die Suspension mit anti-Makrophagen Antikörper versetzt und dann nacheinander auf zwei mit Sekundarantikorper beschichtete Schalen gegeben wurde. In diesem Schritt blieben Mikrogliazellen - sie binden an die Fc-Fragmente der Antikörper - an den Schalen haften. Anschließend wurden mittels einer mit Sekundärantikörper und anti-Ll antikörperbeschichteten Schale Ll-positive Zellen aus der Zellsuspension isoliert. Durch Behandlung mit Trypsin wurden die Zellen von der Schale gelöst und anschließend auf mit Poly-D-Lysin und Laminin beschichtete Zellkulturschalen plattiert.
Fig. 2 Neuronenähnliche Morphologie und Immunoreaktivität für Antikörper gegen neuronale Marker in isolierten Hippo- kampuszellen . a Phasenkontrastbild einer 2 Tage alten Kultur. Die Zellen besitzen bereits neuritenähnliche Fortsätze mit Wachstumskegeln. b,c Immunozytochemische Doppelmarkierungen gegen die Neuronenmarker MAP2 und Tau (a) bzw. Neurofilament und Synapsin (b) . In gefärbten Kulturen waren sämtliche im Phasenkontrast erkennbaren Zellen positiv für die jeweiligen Neuronenmarker. Die Pfeile kennzeichnen axonale Wachstumskegel. Balken = 110 μm (a) , 40 μm (b,c).
Fig. 3 Reinheit der Kulturen isolierter Hippokampusneurone . a Dargestellt ist der Anteil von Makrogliazellen und Neuronen an der Gesamtzahl von Zellen, die über fluoreszenzmarkierte Nuclei identifiziert wurden. Um Makrogliazellen detektieren zu können, wurden zwei Tage alte Kulturen gereinigter Hippokampusneurone gleichzeitig mit Antikörpern gegen GFAP, SlOOß, 04 und CNPase immunozytochemisch gefärbt. Von 2451 Zellen (n = 4 Kulturen) ließen sich 2 als Oligodendrozyten identifizieren. Fehlerbalken repräsentie- ren Standardabweichungen, b Kontrollfärbungen zeigten, dass die verwendeten Marker die entsprechenden Zelltypen in zwei Tage alten gemischten Kulturen aus dissoziierten Maus- Hippokampi sicher nachweisen. Balken = 20 μm.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von einem Ll-Promoter-regulierten Protein, einem Ll-assoznerten Molekül, einem Erkennungsmolekul gegen ein von dem Ll-Promoter-regulierten Protein, gegen das Ll-assoznerte Molekül und/oder gegen das Zelladhasionsprotein Ll zur Isolierung von Neuronen, neuralen und/oder neuronalen Stammzellen aus einer Probe.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungsmolekul ein Antikörper, ein Aptamer, ein Lektm, ein Antisensekonstrukt , ein selektiver
Chelator, deren Fragmente oder eine Kombination aus diesen ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein smgle chain antibody, ein Multi- body, ein Fab-Fragment , ein MHC-Molekul, ein MHC-Pep- tid, ein Fusionspeptid, ein Konformationsepitop imitierender Mimikrypeptidsinglechain-Antikorper, ein polyklonaler, ein monoklonaler, ein humanisierter und/oder ein markierter Antikörper ist.
4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Neuronen afferente, efferente, mterkalare, peri- pher-motoπsche, zentral-motorische, praganglionäre, postganglionare und/oder sensible Neuronen sind.
5. Verfahren zum Isolieren von Neuronen, neuralen und/oder neuronalen Stammzellen aus einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein Erkennungsmolekul gegen ein von einem Ll-Promoter- regulierten Protein, gegen ein Ll-assoznertes Molekül und/oder gegen Ll mit der Probe in Kontakt gebracht wird, wobei Erkennungsmolekul-Ll-Assoziate gebildet und die Assoziate separiert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Neuronen afferente, efferente, interkalare, peπ- pher-motorische, zentral-motorische praganglionäre, postganglionare und/oder sensible Neuronen isoliert werden .
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Neuronen adendritisch, apolar, bipolar, multipolar, polyneuritisch, pseudounipolar, unipolar und/oder neurosekretorisch sind.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als die Probe ein Hirn, ein Striatum, ein Neokortex, ein Ruckenmark und/oder eine Teilmenge hiervon einge- setzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als die Probe Stammzellen eingesetzt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als die Probe neurale und/oder neuronale Stammzellen eingesetzt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als die Probe neural differenzierte embryonale und/oder eine neural differenzierte adulte Stammzellen einge- setzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als die Erkennungsmolekule Molekule ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend einen Antikörper, ein Aptamer, ein Lektin, Antisensekonstrukt , einen selektiven Chela- tor, deren Fragmenten oder einer Kombination aus diesen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als der Antikörper ein Antikorperf agment , ein Single chain antibody, ein Multibody, ein Fab-Fragment, ein MHC-Molekul, ein MHC-Peptid, ein Fusionspeptid, ein Konformationsepitop imitierender Mimikrypeptidsmgle- cham-Antikorper, ein polyklonaler, ein monoklonaler, ein humanisierter und/oder ein markierter Antikörper gesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsmolekule immobilisiert sind.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsmolekule physikalisch, chemisch und/oder biologisch durch in situ-Synthese oder durch Ablegen zuvor synthetisierter Erkennungsmolekule immobilisiert werden .
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsmolekule durch Contact Tip Printing, Ring and Pin Printing, Nanopipettmg, Buble Jet Printing, TopSpot Printing, Micro Contact Printing, Micro Fluidic Networks-Methoden, Photolithographic Activation-Verfahren, Photoresist Lithography, Electrochemical Focusmg und/oder Micro Wet Printing immobilisiert werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Immobilisierungsoberflache mit Poly-L-Lysmen, Ammosilanen, Aldehydsilanen, Epoxy-Gruppen, Strepta- vidin, reaktive Gruppen, Polyacrylamid-Pads, immobilI- sierter Nitrocellulose, aktivierten Aldehyden, Agarose- Aldehyd-Gruppen und/oder Tresyl-Gruppen beschichte wird.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich als die Assoziate Immunkomplexe bilden.
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunkomplexe Antikorper-Antigen-Komplexe oder Lektm-Antigen-Komplexe sind.
20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich als die Assoziate Antisensehybride bilden.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass
Antisensehybride DNA-DNA, RNA-RNA und/oder RNA-DNA sind.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Separierung durch die unterschiedliche Dichte, Große und/oder Ladung Assoziate und der Bestandteile der Probe, die keine Assoziate umfassen, erfolgt.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Separierung mittels Affinitatschromatographie, Zytolyse, FACS, Dichtegradientenseparation, Adhäsion, Agglutination, Rosettenbildung und/oder Zellelektrophorese vorgenommen wird.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einer SH-Proteinase vorbehandelt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die SH-Proteinase Papain ist.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe zunächst Mikrogliazellen abgereichert wird.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten Neuronen, neuralen und/oder neuronalen Stammzellen mit Trypsin von den immobilisierten Erkennungsmolekülen gelost werden.
28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten Neuronen, neuralen und/oder neuronalen Stammzellen auf mit Poly-D-Lysin und/oder Laminin beschichtete Zellkulturschalen plattiert werden.
29. Neuronen-, neurale und/oder neuronale Stammzellenpopulation erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 28.
30. Neuronen, neurale und/oder neuronale Stamm- zellenpopulation, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einer Reinheit von über 90 % vorliegen.
31. Neuronen, neurale und/oder neuronale Stamm- zellenpopulation, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einer Reinheit von über 95 % vorliegen.
32. Neuronen, neurale und/oder neuronale Stam - zellenpopulation, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einer Reinheit von über 97 % vorliegen.
33. Neuronen, neurale und/oder neuronale Stamm- zellenpopulation, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einer Reinheit von über 98 % vorliegen.
34. Neuronen, neurale und/oder neuronale Stamm- zellenpopulation, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einer Reinheit von über 99 % vorliegen.
35. Aufremigungskit umfassend ein Erkennungsmolekul gegen ein von einem Ll-Promoter-regulierten Protein, gegen ein Ll assoziiertes Molekül und/oder gegen Ll.
36. Microarray umfassend ein Erkennungsmolekul gegen ein von einem Ll-Promoter-regulierten Molekül, gegen ein Ll-assoziiertes Molekül und/oder gegen Ll .
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