CN108699526A - 用于通过利用羊膜载玻片支架培养角膜缘干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于在羊膜载玻片支架上培养角膜缘组织，从而能够有效地增加角膜缘组织衍生的上皮细胞片中的角膜缘干细胞的比例，以及能够培养所述角膜缘干细胞的方法。根据本发明，角膜缘组织衍生的上皮细胞片中的角膜缘干细胞的比例可以稳定且迅速地增加，因此当将角膜缘组织衍生的上皮细胞片移植到患有角膜缘干细胞缺陷的患者中时，可以提高成功率。

Description

用于通过利用羊膜载玻片支架培养角膜缘干细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种用于使用羊膜载玻片支架培养角膜缘干细胞的方法。更具体地，本发明涉及一种通过在羊膜固定的载玻片支架上培养角膜缘组织来有效增加/培养角膜缘组织衍生的上皮细胞片中干细胞的比例的方法。
背景技术
据报道，全球大约有450万人双目失明，其中100万人因角膜疾病而失明。角膜是一种位于眼球最前部的结构，占眼球的前表面面积的大约1/6，并且具有大约11mm的尺寸和一般0.55mm的厚度。角膜在中心处最薄并且向周边处变得较厚。此外，角膜是透明的组织，它在光的折射和透射中起主要作用，并且由于神经发育良好而敏感地响应外来物质。角膜由五层组成，即角膜上皮、鲍曼膜、角膜基质、后界膜(Descemet膜)和角膜内皮。正常的角膜中没有血管，通过泪液从空气中提供氧气，并且从前房水和角膜后面的角膜缘提供营养。
角膜上皮占角膜总厚度的大约10％，延伸至角膜缘和结膜上皮，并由5至7个细胞层组成。最下层的底部细胞增殖并从角膜的表面中出来，7至14天后，细胞脱落。鲍曼膜是一种由无细胞、无色和透明原纤维组成的膜。一旦损坏，这个膜便不会再生。角膜基质占角膜厚度的大约90％，主要由胶原纤维组成，具有均匀的尺寸和方向，并且是透明的。另外，后界膜是一种在内皮细胞中分泌的厚基膜，并且当人变老时，这个膜的厚度增加。角膜内皮细胞是扁平立方单层细胞，出生后便不再生。
角膜上皮细胞的存活由存在于角膜缘中的干细胞维持，并且角膜缘干细胞是可以仅分化成角膜上皮的单功能成体干细胞。在角膜缘干细胞缺陷中，基底角膜上皮细胞向表面的迁移减少以及外周角膜上皮细胞向中心的迁移减少，以及角膜上皮细胞非但没有增殖，其脱落反而增加，这都阻碍了角膜上皮的再生。结果，结膜上皮细胞通过角膜缘穿透角膜，这被称为结膜化。尽管有了新的环境，结膜上皮细胞仍保持了独特的表型，并发生了角膜新血管形成，导致角膜混浊和失明。
当由于创伤、严重的炎症或先天性原因而不能保持透明性而导致角膜变得混浊时，虽然包括视神经在内的所有其他眼部功能都是正常的，但是患者具有严重的视力损伤。在难以用药物或激光治疗这种混浊的情况下，角膜需要移除，然后用从捐赠的眼睛中获得的透明角膜代替以促进光进入眼睛，这通过角膜移植来实现。可以预料的是，由角膜本身的这种病变引起的视力恢复是通过角膜移植来实现的，而在因角膜缘干细胞缺陷引起的角膜的结膜化和混浊的情况下，只能通过成功的角膜缘干细胞移植期待视力恢复。因此，在这种情况下，由于除了干细胞移植之外别无选择，由角膜缘干细胞缺陷引起的角膜混浊和失明被归类为难治性疾病。
角膜缘干细胞缺陷疾病是由于遗传因素；或诸如创伤、感染、紫外线损伤、手术损伤、佩戴隐形眼镜引起的并发症和全身性疾病之类的后天因素，继而可以使角膜上皮细胞不断再生的角膜缘干细胞的缺陷而导致的角膜缘广泛性损伤引起的疾病，除上述原因外，由于不合理佩戴隐形眼镜(包括未经批准的美瞳彩色隐形眼镜)，干眼症的患病率和严重程度增加，有毒眼药的使用增加，角膜缘干细胞缺陷患者的数量在不断增加。
自体或异体角膜缘组织移植已被用作治疗角膜缘干细胞缺陷的方法。对于自体角膜缘组织移植，已经使用了移植从另一只眼睛中提取的相同尺寸的角膜缘组织的方法，但是另一只眼睛也可能出现角膜缘干细胞缺陷疾病。然而，在尸体捐献的异体角膜缘组织移植的情况下，患者因持续使用系统性免疫抑制剂而受副作用的折磨，并且即使使用系统性免疫抑制剂时，也存在一个频繁发生的问题，即由于对角膜缘移植物的排斥，相当大比例的干细胞死亡。同样，角膜缘干细胞缺陷疾病在持续增加，对患者来说有效且不太复杂的治疗方法却没有适当开发出来，因此需要开发提高治疗成功率并实现最佳治疗效果的新技术。
具体地，作为角膜和结膜的接触部位的角膜缘中存在的角膜缘干细胞在维持和修复角膜上皮的同时在角膜上皮再生中起关键作用。然而，由于角膜缘干细胞的数量少于1％，并且这些细胞被埋在多层角膜缘上皮的基膜中，所以很难分离这些细胞。为了解决这样的问题，已经报道了从角膜缘中分离多功能干细胞并培养该细胞的方法(韩国专利号10-0931887)，但是没有可用于临床和实际用途的有效方法。
发明内容
为此，本发明人对角膜缘干细胞离体扩张的有效方法进行了研究，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供一种有效地提高角膜缘组织衍生的上皮细胞片中角膜缘干细胞的比例的方法，使得通过将该角膜缘组织衍生的上皮细胞片移植到由于角膜缘干细胞缺陷导致的视力下降和失明的患者来使移植的成功率最大化。
然而，本发明中要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域普通技术人员从下面的描述中将完全理解本文中未描述的其他问题。
为实现本发明的目的，本发明提供了一种用于培养包含角膜缘干细胞的角膜缘组织衍生的上皮细胞片的方法，其包括用去除了上皮细胞的羊膜覆盖载玻片支架用于固定；以及在固定的羊膜上培养角膜缘组织。
在本发明的实施方式中，该羊膜的宽度和长度各自为28至35mm。
在本发明的另一个实施方式中，使用4至6M尿素去除该羊膜的上皮细胞。
在本发明的又一个实施方式中，该载玻片的宽度和长度各自为18至28mm。
在本发明的又一个实施方式中，在补充有人血清、上皮细胞生长因子(EGF)、二甲基亚砜(DMSO)、胰岛素转铁蛋白硒(ITS)和O-磷酸乙醇胺的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)/F12(1:1)中培养该角膜缘组织。
在本发明的又一个实施方式中，该人血清是人白蛋白血清，并且以整个培养基的4至6％(v/v)加入。
在本发明的又一个实施方式中，将该角膜缘组织培养10至14天。
在本发明的又一个实施方式中，该角膜缘组织衍生的上皮细胞片被培育至该支架的面积的85至95％，然后被分类为用于患者的移植物。
当使用根据本发明的羊膜载玻片支架和特定培养条件时，角膜缘组织衍生的上皮细胞片中的角膜缘干细胞的比例可以是稳定的且迅速增加。因此，当将该角膜缘组织衍生的上皮细胞片移植到角膜缘干细胞缺陷患者中时，可以提高移植的成功率。
此外，在本发明中，可以确认对移植中的相容性有效的角膜缘干细胞的比例。
附图说明
图1A至1E示出了实验组[其中使用通过将EGF、DMSO、ITS、O-磷酸乙醇胺、霍乱毒素(CT)和胎牛血清(FBS)添加到DMEM:F-12(1:1)中而制备的补充人上皮细胞培养基(SHEM)，在根据本发明的示例性实施方式制备的羊膜载玻片支架上培养角膜缘组织]和对照组(其中在transwell上培养角膜缘组织)中的细胞形态(图1A)；细胞增殖区域(图1B)；JC-1低群体，其是角膜缘干细胞的比例(图1C)；以及集落形成效率(CFE)(图1D)；以及角膜缘干细胞标志物(p63α(+)和ABCG2(+))的western印迹结果(图1E)。
图2A至2C示出了实验组1至3[其中使用含有人白蛋白血清(5％和10％)但排除了CT和FBS的SHEM，在根据本发明的示例性实施方式制备的羊膜载玻片支架上培养角膜缘组织]中JC-1低群体(其是角膜缘干细胞的比例)的比较(图2A)；CFE(图2B)；以及角膜缘干细胞标志物(p63α(+)和ABCG2(+))的western印迹结果(图2C)(对照组：在本发明的图1中使用的SHEM)。
图3A至3C示出了实验组(有载玻片)[(其中使用本发明的图2中所用的含有5％人白蛋白血清但排除了CT和FBS的SHEM(实验组2)，在根据本发明的示例性实施方式制备的羊膜载玻片支架上培养角膜缘组织]；以及对照组[其中在transwell(TW)、未附着于PVDF膜的羊膜(w/o PVDF)、附着于PVDF膜的羊膜(有PVDF)和用环固定的羊膜(有环)上培养角膜缘组织]中的细胞增殖区域(图3A)和JC-1低群体(图3B)以及角膜缘干细胞标志物(p63α(+))的流式细胞术结果(图3C)。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
本发明涉及一种用于通过在特定培养条件下在固定在羊膜上的载玻片支架上培养角膜缘组织来有效增殖和培养角膜缘组织衍生的上皮细胞片中的角膜缘干细胞的比例的方法。
角膜缘是在角膜和巩膜之间具有大约1mm宽度的圆形区域，包含位于多层上皮细胞下方的基质中的许多血管，并且参与角膜的代谢和整合。特别地，由于角膜缘上皮中的角膜缘干细胞(ABCG2阳性和p63α阳性)是角膜上皮细胞的来源，当将角膜缘组织移植到患有角膜缘干细胞缺陷疾病的患者中时，角膜上皮细胞从分布于角膜缘上皮基底层中的角膜缘干细胞中分化并迁移至角膜中心，由此形成多层角膜上皮。
因此，本发明人研究了一种通过以下提高移植成功率的方法：将角膜移植后留下的供体的圆形角膜缘组织分成12片，以及使用具有羊膜支架的载玻片，培养角膜缘组织衍生的上皮细胞片中的角膜缘干细胞以便以相对于角膜缘组织的预定比例或更高比例包含角膜缘干细胞，从而完成本发明。
首先，通过手术将供体的圆形角膜缘分成12片，以便具有2×3mm(主轴×长度)的尺寸，之后优选地在羊膜支架上培养角膜缘组织。羊膜支架通过用羊膜覆盖可固定支架来制备。可以使用能够固定羊膜的任何板型支架，并且特别地，优选使用载玻片。
这里，羊膜可以具有28至35mm(宽×长)的尺寸，并且特别地，其中宽度和长度各自为20mm或更大的羊膜是最优选的，因为考虑到人角膜的尺寸(大约12×12mm)，可以在其上培养具有最适合移植尺寸的角膜缘组织。
具有20mm×26mm(宽×长)的尺寸的载玻片最适于在覆盖有优选尺寸的羊膜之后稳定地固定到30mm培养皿的中心。
将羊膜载玻片支架置于30mm培养皿的中央，角膜缘组织沉淀于羊膜载玻片支架的中间，于37℃孵育在CO2孵育箱中的含有培养基的培养皿中。这里，在羊膜支架的中间培养时要提高角膜缘组织衍生的上皮细胞片中的角膜缘干细胞的比例，优选的是，将角膜缘组织分成12片，每片具有2至3mm的长轴长度。
优选的培养基是除了生长因子之外，还补充有营养血清[例如提供有效维持细胞的生长和存活的营养物的血清或基于血清的溶液(如剔除血清或热灭活人血清)]的DMEM或DMEM/F-12(1:1)。在此，生长因子是指作为细胞增殖和分化活化的主要结果，与细胞表面受体结合的蛋白质。用于培养角膜缘组织的生长因子优选地选自EGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、胰岛素、亚硒酸钠、人转铁蛋白、人白血病抑制因子(hLIF)及其组合。然而，可以使用本领域普通技术人员已知的任何合适的培养基而没有限制。
除非另外特别说明，否则本发明使用补充有EGF、DMSO、ITS、O-磷酸乙醇胺和人白蛋白血清(5％)的DMEM/F-12(1:1)。
角膜缘组织的培养基优选地每2至3天进行更换，并且角膜缘组织被培育直至通过细胞分裂形成的角膜缘组织衍生的上皮细胞片占羊膜支架的85至95％以达到250mm2到300mm2，考虑到人角膜的尺寸，这是合适的。角膜缘组织衍生的上皮细胞片占羊膜支架的85至95％的时间为大约10至14天，并且通常需要12天的培养时间。
由于存在于角膜缘组织衍生的上皮细胞片中的角膜缘干细胞的比例对于提高移植后的成功率非常重要，作为确认本发明中干细胞的最佳比例的结果，揭示了在待移植的上皮细胞片中存在至少30％(38.7±3.52)的干细胞。此处，角膜缘干细胞的比例可以确认为5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑-羰花青碘化物(JC-1)低群体，可以通过集落形成效率(CFE)和角膜缘干细胞阳性标志物(p63α和ABCG2)的western印迹来鉴定角膜缘干细胞的干性，但本发明不限于此。
此外，当使用特定组成的培养基和根据本发明的羊膜载玻片支架(有载玻片)时，与其他条件(TW，w/o PVDF，有PVDF和有环)相比，可以确认表现出更快的细胞增殖速率和更高比例的角膜缘干细胞(参见图3A至3C)。
在下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性实施例。然而，提供以下实施例是为了更容易理解本发明，而不是限制本发明。
实施例
实施例1：制备羊膜载玻片支架
将人体组织库提供的，然后于-70℃冷冻保存的羊膜组织(30mm×30mm)置于室温下30分钟，然后通过5M尿素处理5分钟去除了羊膜的上皮细胞。用去除了上皮细胞的羊膜覆盖具有20mm×26mm的尺寸的载玻片，然后将载玻片放入35mm培养皿中并紧密固定。
实施例2：使用羊膜载玻片支架培养角膜缘干细胞
为了在角膜移植手术完成后从尸体中提取角膜缘组织，使用手术工具将角膜缘组织分成12片，每片具有大约为2mm×3mm的尺寸，以及切割并移除周边角膜和结膜。之后，将提取的角膜缘置于实施例1中制备的羊膜载玻片支架上，并于37℃在CO2孵育箱中培养大约12天。在孵育中，培养基每2至3天进行更换，当角膜缘组织衍生的上皮细胞片占载玻片区域的85至90％或更多时，将其移植到患者体内。
这里，培养基是常规且一般地用于培养角膜缘组织的补充人上皮细胞培养基(SHEM)，其组成包括含于DMEM:F-12(1:1)的EGF、DMSO、ITS、O-磷酸乙醇胺、CT和FBS。
实施例3：羊膜载玻片支架和transwell上角膜缘干细胞的比例比较分析
为了比较地测量角膜缘组织衍生的上皮细胞片中角膜缘干细胞的比例，于4℃用2mg/ml的分散酶(dispase)Ⅱ溶液将羊膜载玻片支架和transwell(对照组)上培育至90％或更多的细胞处理过夜。角膜缘组织衍生的上皮细胞片用细镊子从羊膜中分离得到，用1ml的trypLE处理5分钟，并以1000rpm离心5分钟，从而获得细胞沉淀物。将细胞沉淀物悬浮于SHEM中，然后将细胞计数以测量JC-1低群体和CFE，并接种于6孔板中。为了测量JC-1低群体，将细胞以1.0×105个细胞/ml接种，在SHEM中培养24小时并用JC-1染料处理1小时，然后使用FACS，测量JC-1低细胞群体，其是侧群细胞。同时，为了确认集落形成，将细胞在CNT50培养基(Cellntec)中培养14天，并对菌落的数目进行计数，从而确认CFE。
因此，如图1A至1E中所确认的，当使用根据本发明制备的羊膜载玻片支架时，与作为对照组的transwell相比，细胞的增殖速率显着增加，并且表示角膜缘组织中包含的干细胞的比例的JC-1低群体、CFE和干细胞标志物(p63α和ABCG2)的表达也显着增加。
实施例4：根据培养基组成的效率比较
常规地，CT和FBS被包含在通常用于培养角膜缘组织的SHEM中。然而，所培养的角膜缘组织用于人类移植，因此为了排除培养物中的动物成分(FBS)和毒性成分(CT)，用表1中所示的培养基组成进行培养实验。
表1
因此，如图2A至2C中所确认的，在去除了CT的实验组1中，角膜缘干细胞的比例略有减少，并且在使用5％人白蛋白血清(AB血清)代替5％动物血清(FBS)的实验组2中，角膜缘干细胞的比例和干细胞标志物的表达显着增加。另一方面，在人白蛋白血清的比例增加到10％的实验组3中，与添加5％的人白蛋白血清的情况相比，角膜缘组织衍生的上皮细胞片中的角膜缘干细胞的比例降低到对照组的水平。因此，可以看出，实验组2中的培养基条件是最优选的。
实施例5：各种支架中角膜缘干细胞比例的比较分析
为了比较角膜缘干细胞在各种支架中的比例，在培养的第5、7、9、12和14天，在transwell(TW)的情况下测量了细胞增殖面积和角膜缘干细胞的比例，未附着于PVDF膜的羊膜(w/o PVDF)、附着于PVDF膜的羊膜(有PVDF)、用环固定的羊膜(有环)作为对照组，并且羊膜附着于本发明的载玻片(有载玻片)。
除了使用了实施例4中所描述的实验组2的培养基条件代替SHEM之外，以与实施例3中所用的方式相同的方式进行这项实验。
因此，如图3A至3C中所确认的，当使用根据本发明制备的羊膜载玻片支架时，与对照组相比，细胞增殖速率显着增加(图3A)，并且作为观察JC-1低群体和角膜缘干细胞标志物(p63α(+))的流式细胞仪检测的结果(图3B和3C)，可以看出羊膜载玻片支架是最优选的。
本领域普通技术人员应该理解，本发明的以上描述是示例性的，并且在不脱离本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本文披露的示例性实施方式修改为其他特定形式。因此，上面描述的示例性实施方式应该被解释为是说明性的，并且在任何方面都没有限制。
工业适用性
用于使用根据本发明的羊膜载玻片支架培养角膜缘干细胞的方法可以允许角膜缘组织衍生的上皮细胞片中的角膜缘干细胞的比例稳定且迅速地增加，因此预期这个方法可用于通过角膜缘干细胞移植治疗患有角膜缘干细胞缺陷的患者。

Claims (8)

1.一种培养角膜缘干细胞的方法，其包括：
用去除了上皮细胞的羊膜覆盖载玻片支架用于固定；以及
在固定的羊膜上培养角膜缘组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该羊膜的宽度和长度各自为28至35mm。
3.根据权利要求1所述的方法，其中使用4至6M尿素去除该羊膜的上皮细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该载玻片的宽度和长度各自为18至28mm。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在补充有人血清、上皮细胞生长因子(EGF)、二甲基亚砜(DMSO)、胰岛素转铁蛋白硒(ITS)和O-磷酸乙醇胺的DMEM/F12(1:1)中培养该角膜缘组织。
6.根据权利要求5所述的方法，其中该人血清是人白蛋白血清，并且以整个培养基的4至6％(v/v)加入。
7.根据权利要求1所述的方法，其中将该角膜缘组织培养10至14天。
8.根据权利要求7所述的方法，其中当该角膜缘组织被培育至该支架的面积的85至95％时，该角膜缘组织被分类为用于患者的移植物。
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