JP2022097730A - ラミニンによる角膜の新規治療 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含む、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防剤。
(2)前記ラミニンは、RGD配列を含む、項目1に記載の治療または予防剤。
(3)前記ラミニンは、α5鎖および/またはγ1鎖を含む、項目1または2に記載の治療または予防剤。
(4)前記ラミニンは、ラミニン511(α5β1γ1)およびラミニン521(α5β2γ1)を含む、項目1~3のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(5)前記フラグメントは、角膜内皮細胞の細胞接着能を有する、項目1~4のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(6)前記因子は、ラミニン511、ラミニン521またはラミニン511-E8フラグメントである、項目1~5のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(7)前記角膜内皮は霊長類のものである、項目1~6のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(8)前記角膜内皮疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜内皮炎、外傷、ならびに眼科手術の障害および状態からなる群より選択される、項目1~7のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(9)前記角膜内皮疾患、障害または状態は、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫、水疱性角膜症、および角膜混濁からなる群より選択される、項目1~8のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(10)前記角膜内皮は、角膜内皮層、デスメ膜、またはその両方を含む、項目1~9のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(11)前記角膜内皮は、デスメ膜が剥離した状態である、項目1~10のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(12)さらに、角膜内皮細胞を含む、項目1~11のいずれか1項に記載の治療または
予防剤。
(13)さらに、ROCK阻害剤を含む、項目1~11のいずれか1項に記載の治療また
は予防剤。
(14)さらに、角膜内皮細胞およびROCK阻害剤を含む、項目1~11のいずれか1
項に記載の治療または予防剤。
(15)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)-(+)-トランス-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)、およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目13または14に記載の治療または予防剤。
(16)前記因子は、眼内に注入され眼内の組織と接触されることを特徴とする、項目1~15のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(17)前記因子は、約21nM以上で存在する、項目1~16のいずれか一項に記載の
治療または予防剤。
(18)さらに角膜内皮細胞が投与されることを特徴とする、項目1~17のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(19)前記因子は、角膜内皮細胞と混合されて提供され、さらに、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子が眼内に注入され眼内の組織と接触されることを特徴とする、項目1~18のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(20)さらに、ROCK阻害剤を含む、項目1~19のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(21)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)-(+)-トランス-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)、およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目1~20のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
(22)角膜内皮細胞と混合される前記因子は、約2.1nM以上であり、注入される前記因子は約21nM以上である、項目1~21のいずれか一項に記載の治療または予防剤
。
(23)角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防のために使用するための、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子。
(24)項目2~22のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、
項目23に記載の因子。
(25)角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防するための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
(26)項目2~11のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、
項目25に記載の方法。
(27)さらに、角膜内皮細胞を前記被験体に投与する工程を含む、項目26または26に記載の方法。
(28)さらに、ROCK阻害剤を前記被験体に投与する工程を含む、項目25~27のいずれか1項に記載の方法。
(29)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)-(+)-トランス-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)、およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目28に記載の方法。
(30)さらに、角膜内皮細胞およびROCK阻害剤を前記被験体に投与する工程を含む、項目25~29のいずれか1項に記載の方法。
(31)前記因子は前記被験体の眼内に注入され、眼内の組織と接触されることを特徴とする、項目25~30のいずれか1項に記載の方法。
(32)前記因子は、約21nM以上で存在する、項目25~31のいずれか1項に記載の方法。
(33)角膜内皮細胞を前記因子とは別に投与する工程をさらに包含する、項目25~32のいずれか1項に記載の方法。
(34)前記因子は、角膜内皮細胞と混合されて提供され、さらに、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子が眼内に注入され眼内の組織と接触されることを特徴とする、項目25~33のいずれか1項に記載の方法。
(35)ROCK阻害剤を前記因子とは別に投与する工程をさらに包含する、項目25~34のいずれか1項に記載の方法。
(36)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)-(+)-トランス-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)、およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目25~35のいずれか1項
に記載の方法。
(37)角膜内皮細胞と混合される前記因子は、約2.1nM以上であり、注入される前記因子は約21nM以上である、項目25~32のいずれか1項に記載の方法。
(38)ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防のための医薬の製造における使用。
(39)項目2~22のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、
項目38に記載の使用。
(40)ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防のための使用。
(41)項目2~22のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、
項目40に記載の使用。
本明細書において「角膜内皮細胞」とは当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり、透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側(体表面)から順に5層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜、固有層、デスメ膜(角膜内皮基底膜)、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。本明細書において「HCEC」(human corneal endothelial cells)とは、ヒト角膜内皮細胞の略称であり、ウサギのものは「RCEC」、サルのものは「MCEC」とも略称する。本発明で使用される角膜内皮細胞は、天然に存在する細胞のほか、幹細胞から分化した細胞、例えばiPS等からの誘導分化細胞を用いることができることが理解される。
本明細書において「ラミニン」とは細胞外マトリックスの基底膜を構成するタンパク質であり、多細胞体制・組織構築とその維持、細胞接着、細胞移動、細胞増殖を促進し、がん細胞と関係が深い。胚発生の初期(2細胞期)に発現するとされる。α鎖、β鎖およびγ鎖のそれぞれ1本ずつからなるヘテロ三量体である。ラミニンの命名は、発見順の名称(ラミニン-1、ラミニン-2等)が知られていたが、サブユニットとの対応は考慮されていないため本明細書では、より新たな命名法である、α、β、γのサブクラスの名称(3桁の番号、百の位はα、十の位はβ、一の位はγを示す。)を併記する方法を採用し、α1、β1およびγ1の場合、ラミニン111などと称する。ラミニンはα鎖が5種、β鎖が3種,γ鎖が3種、見出だされている。従って、理論的な組み合わせの最大数は、5×3×3=45で、45種類のラミニン分子が可能であるが、天然にすべての組み合わせが存在しているわけではないとされている。各サブユニットは、例えばα鎖についてはLAMA1、LAMA2、LAMA3、LAMA4、LAMA5等と称し、β鎖についてはLAMB1、LAMB2、LAMB3と称し、γ鎖についてはLAMC1、LAMC2、LAMC3と称される。本発明で使用されるラミニンタンパク質は天然型であっても、あるいはその生物学的活性、特に細胞接着促進活性を保持したまま1またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。また、本発明におけるラミニンタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。したがって、本発明で使用されるラミニンタンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えDNAから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。本発明で使用されるラミニンタンパク質の由来は特に、限定されないが、好ましくは、ヒト由来のものである。医療材料を得る目的などでヒト細胞を培養する場合には、他の動物に由来する材料の使用を避けるために、ヒト由来のラミニンを用いることが好ましいがこれに限定されない。
(a)配列番号1に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号1に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)~(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)~(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα5鎖の有する活性をいう。α5鎖については、Doi M et al.,J.Biol.Chem. 277(15),12741-12748,2002;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)~(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα5鎖の有する活性をいう。α5鎖については、Doi M et al.,J.Biol.Chem. 277(15),12741-12748,2002;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号3に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)~(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)~(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ1鎖の有する活性をいう。β1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.262(22),10454-10462,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)~(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ1鎖の有する活性をいう。β1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.262(22),10454-10462,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号5に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)~(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)~(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ2鎖の有する活性をいう。β2鎖については、Wewer UM et al.,Genomics. 1994 Nov 15;24(2):243-52.,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号6に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号5に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号6に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)~(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ2鎖の有する活性をいう。β2鎖については、Wewer UM et al.,Genomics. 1994
Nov 15;24(2):243-52.,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号7に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)~(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)~(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンγ1鎖の有する活性をいう。γ1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.263(14),6751-6758,1988;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号8に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号7に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号8に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)~(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
、であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンγ1鎖の有する活性をいう。γ1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.263(14),6751-6758,1988;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F. M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F. M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. et al.(1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. et al.(1999).PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F.(1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al.(1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al.(1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G. T. (I996). Bioconjugate Techniques, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy Joyceらの報告{Joyce, 2004 #161} {Joyce, 2003 #7}がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じるため、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。また、任意の実施形態が組み合わせ得ることも理解されるべきである。
1つの局面において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含む、角膜内皮等の角膜の疾患、障害または状態の治療または予防剤を提供する。この局面において、本発明はまた、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防のために使用するための、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を提供する。あるいは、この局面において、本発明は、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防するための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。この局面において、角膜についていえば、角膜内皮のほか、上皮等でも、同様に治療または予防効果が奏され得ることが理解される。
な作製方法としては、特願2011-78370を参照することができる。同様のフラグメントは、ヒトラミニン521を用いても作製することができる。これは、ラミニン521-E8フラグメントと称され、ラミニン511-E8と同様に作製することができ、ラミニン511-E8と同様の活性を保持することが理解される。本発明では、同様に、α5鎖および/またはγ1鎖を含む任意のラミニンについて、同様に、E8フラグメントを製造することができることが理解され、そのようなE8フラグメントは、本発明において全長のものと同様に使用することができることが理解される。
別の局面において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子と、角膜内皮細胞とを用いる、角膜内皮の疾患、障害または状態の治療または予防剤を提供する。ここで、本発明の因子と角膜内皮細胞とは、混合物として用いてもよく、別々に投与されてもよい。したがって、この局面において、本発明は、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防するための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程、ならびに角膜内皮細胞および/またはROCK阻害剤を前記被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。この局面の本発明の方法において用いられる因子(ラミニン、そのフラグメント等)、角膜内皮細胞、ROCK阻害剤等は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。
初代培養および継代培養時には接着促進作用をもつROCK阻害剤であるY-27632(例えば、WAKO、カタログ番号:253-00513から入手可能)を最終濃度10μmol/lとして48時間添加する。
ROCK阻害剤であるY-27632を最終濃度10μmol/lとして培養中は常に添加する。
Y-27632を添加しないで基本培地としてSB431542(例えば、Merck Millipore,Billerica,MAから入手可能)(1μmol/l)およびSB203580(1μmol/l)を添加したもので培養する。
角膜内皮細胞はレシピエント自身または適切なドナーの角膜から常法で採取される。本発明における移植条件を考慮すれば、同種由来の角膜内皮細胞を準備すればよい。例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質から剥離した後、培養皿に移し、ディスパーゼなどで処理する。これによって角膜内皮細胞はデスメ膜より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱落させることができる。デスメ膜を除去した後、適切な培養液(例えば、WO2013/100208に記載される)中で角膜内皮細胞を培養する。培地または培養液としては例えば市販のDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(例えば、INVITROGEN、カタログ番号:12320等を)にFBS(ウシ胎仔血清)(例えば、BIOWEST、カタログ番号:S1820-500)、b-FGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)(例えば、INVITROGEN、カタログ番号:13256-029)、およびペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加し、さらにWO2013/100208に例示される培養正常化剤の成分を添加したものを使用することができる。本発明の因子をコーティングして培養を行うことで角膜内皮細胞の培養容器表面への接着が促され、良好な増殖が行われる。また、培養液にラミニンを添加して培養する場合は、培養皿の表面にI型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたはウシ等の角膜内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。あるいは、通常の培養容器をFNC coating mix(登録商標)(50ml(AES-0407)、ATHENA、カタログ番号:0407)等の市販のコーティング剤で処理したものを用いてもよい。角膜内皮細胞を培養する際の温度条件は、角膜内皮細胞が生育する限りにおいて特に限定されないが、例えば約25℃~約45℃、増殖効率を考慮すれば好ましくは約30℃~約40℃、さらに好ましくは約37℃である。培養方法は、通常の細胞培養用インキュベーター内で、加湿下、約5~10%のCO2濃度の環境下で行われる。
培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。継代培養は次のように行うことができる。まずトリプシン-EDTA等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。回収した細胞に本発明の培養正常化剤または培地を加えて細胞浮遊液とする。細胞を回収する際、あるいは回収後に遠心処理を行うことが好ましい。かかる遠心分離処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。好ましい細胞密度は、約1~2×106個/mLである。尚、ここでの遠心分離処理の条件としては、例えば、500rpm(30g)~1000rpm(70g)、1~10分を挙げることができるがこれらに限定されない。
1つの実施形態では、細胞として、密度勾配遠心分離を用いた高密度角膜内皮細胞の純化して本発明に用いることができる。その方法は代表的に以下のとおりである。低密度細胞と高密度細胞が入り混じった培養ヒト角膜内皮細胞を適宜の手段(例えば、OptiPrepTM)を用いて800×gで15分間密度勾配遠心分離を行うことができる。ペレットおよび上清に含まれる細胞を回収してペレット群および上清群としてそれぞれ適宜の個数(例えば、420個/mm2)ずつ播種し培養することができる。30日後に位相差顕微鏡による形態を観察し、免疫染色による角膜内皮機能関連マーカーの発現の解析および細胞密度・細胞面積を測定する。遠心分離後培養した細胞はペレット群、上清群共単層で多角形の細胞形態を示し、Na+/K+-ATPaseおよびZO-1発現がみられる細胞が得られる。そしてペレット群が一般に細胞密度が有意に高い。細胞面積の中央値(四分位範囲)は、一般にペレット群で低値であり、散らばりが小さい。したがって、これにより、密度勾配遠心分離により高密度の細胞を純化することができ、本発明において使用され得るものであることが理解される。
1つの局面において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の治療または予防剤であって、該因子は、眼内に注入され眼内の組織と接触されることを特徴とする治療または予防剤を提供する。したがって、この局面において、本発明はまた、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防するための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法であって、ここで前記因子は前記被験体の眼内に注入され、眼内の組織と接触されるものであることを特徴とする方法を提供する。この局面の本発明の方法において用いられる因子(ラミニン、そのフラグメント等)は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。ここでは、因子は、眼内に注入され眼内の組織と接触される結果、眼内で、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子のコーティング(本明細書においてラミニンコーティングともいう)が形成されることにより、角膜の治癒が促進されるものと理解される。
(使用)
(手法)・(培養)ウサギ角膜内皮細胞(RCEC、入手先および培養方法):以下の実験に使用したウサギ角膜内皮細胞は、角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し,DMEM(Gibco-Invitrogen)に溶解した1.2U/ml Dispase I[(三光純薬) カタログ番号:GD81060]に入れて、37℃でインキュベートした。1時間後,ピペッティングでデスメ膜から角膜内皮細胞を剥離して回収し、1000rpm 5分間遠心分離して上清を除去した.沈殿している角膜内皮細胞に培養培地を加えて混和し、FNC Coating Mixをコートした6ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はDMEM(カタログ番号:12320;Gibco-Invitrogen)に10% FBS、50μg/ml ゲンタマイシン(カタログ番号:15710-064;Invitrogen) 、10μg/ml Y-27632(カタログ番号:6880005;Calbiochem, La Jolla,CA) 、2ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor;カタログ番号:13256-029;bFGF; Invitrogen)を加えたものを使用した。ウサギの角膜内皮細胞(CEC)の培養には、サルと同様、以前に報告した系[Koizumi Nら、Exp Eye Res.,2012;95:60-67;Koizumi Nら、Invest Ophthalmol Vis Sci..2007;48:4519-4526;Okumura Nら、Am J Pathol. 2012;181:268-277]を使用した。
2サンプルの比較の平均値における統計的有意差(P値)は、スチューデントのt検定を用いて決定した。複数のサンプルセットの比較における統計的有意差は、ダネットの多重比較検定を用いて解析した。グラフに示す値は平均±SEを表す。
本実施例では、ラミニンとして、ラミニン511-E8フラグメントを用い、病態モデルとして、ウサギ水疱性角膜症モデルを用いて、培養角膜内皮移植を行った。
(使用した試薬等)
本実施例では、以下の試薬等を使用した。
・培養ウサギ角膜内皮細胞(RCECとも略称する。上記のとおり調製したもの)
・ラミニン511 E8フラグメント(株式会社ニッピ、382-02413)
・ウサギ水疱性角膜症モデル(以下の(移植方法)に記載されるように作製)
・このほか、実験手法中において言及したもの
(移植方法)
図1に示す実験は以下のように行った。
図2に示す測定実験は以下のように行った。
図3の組織学的検討は、以下のように行った。この検討は、正常機能の確認のためのものであり、Na+/K+-ATPaseおよびZO-1による免疫染色で確認したものである。角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能を確認するためである。Na+/K+-ATPaseおよびZO-1はそれぞれ、角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能の正常性を示す。手法は以下のとおりである。
細胞観察は位相差顕微鏡にて行った。また、細胞を固定した後に機能関連マーカーとしてZO-1、Na+/K+-ATPaseを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。組織染色検査のために、ウサギから摘出した角膜組織を4%ホルムアルデヒドで10分間室温(RT)で固定し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)とともに30分間インキュベートした。再生された角膜内皮組織の表現型を調べるために、密着結合関連タンパク質であるZO-1、ポンプ機能に関連するタンパク質であるNa+/K+-ATPaseの免疫組織化学分析を行った。細胞の機能に関連するマーカーとしてZO-1およびNa+/K+-ATPaseを使用した。ZO-1、Na+/K+-ATPaseの染色は、それぞれ、ZO-1ポリクローナル抗体(Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA)、Na+/K+-ATPaseモノクローナル抗体(Upstate Biotec, Inc., Lake Placid, NY)の1:200希釈を用いて実施した。二次抗体には、Alexa Fluor(登録商標)488標識(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA))の1:2000希釈を使用した。次いで、細胞の核をDAPI(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)で染色した。また、細胞の形態を1:400希釈のAlexa Fluor(登録商標)488-conjugated phalloidin (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)により染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡(TCS SP2 AOBS;Leica Microsystems, Welzlar, Germany)で観察した。
結果を図1~3に示す。図1は、ラミニン511 E8フラグメントを用いたウサギ水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植後の前眼部写真である。左からControl:コントロールとしてウサギの角膜内皮細胞を機械的に掻爬したもの、RCEC:作製したモデルに培養したウサギ角膜内皮細胞を前房内に注入してうつむき姿勢を3時間取らせたもの、RCEC+E8:作製したモデルに培養したウサギ角膜内皮細胞を、濃度2.1nMに調整したラミニン511 E8フラグメントを含有するDMEMととともに前房内に注入してうつむき姿勢を3時間取らせたものの前眼部写真を示す。上段は1週間後であり、下段は2週間後の写真を示す。コントロール群およびRCEC群では角膜が混濁したが、RCEC+E8群では角膜が透明治癒したことから、細胞をラミニンとともに注入した場合には角膜が透明治癒することが示された。
以前、培養した角膜内皮細胞をROCK阻害剤とともに前房内に注入することで、細胞の基質への接着を促進することを報告した。そこでラミニンとROCK阻害剤との併用効果を検討した。
(使用した試薬等)
本実施例では、以下の試薬等を使用した。
・培養ウサギ角膜内皮細胞(RCEC、上記のとおり調製したもの)
・ラミニン511 E8フラグメント(実施例1と同じ;株式会社ニッピ、382-02413)
・Y-27632((R)-(+)-トランス-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)(カタログ番号:6880005;Calbiochem, La Jolla,CA)
・ウサギ水疱性角膜症モデル(実施例1と同じ;作製法は(移植方法)に記載)
・このほか、実験手法中において言及したもの
(移植方法)
図4に示す実験は以下のように行った。
デスメ膜剥離を行わず角膜内皮細胞を剥離しY-27632(+)(100μM)とともに培養角膜内皮細胞を注入、デスメ膜剥離を行わず角膜内皮細胞を剥離しラミニン511-E8(2.1nM)とY-27632(+)(100μM)とともに注入、デスメ膜剥離を行った水疱性角膜症モデルにY-27632(+)(100μM)とともに注入、デスメ膜剥離を行った水疱性角膜症モデルにラミニン511-E8(2.1nM)とY-27632(+)(100μM)とともに注入の4群で各4匹ずつで試験を行った。
超音波パキメーター(Ultrasound pachymeter)(SP-2000; Tomey, Nagoya, Japan)により角膜厚を測定した。測定不可の場合は測定可能上限値である1200μmとした。また眼圧はトノベット(MEテクニカ、東京)により測定した。
図8に示す組織学的検討は、実施例1と同様の様式で行った。
図4に、ラミニンとROCK阻害剤を併用したウサギ水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植の24時間後の細胞の基質への接着についての結果を示す。ファロイディン染色により細胞とラミニン511-E8(2.1nM)とY-27632(+)(100μM)とともに注入した個体においてより多くの細胞が接着していることが示された。また接着した細胞密度は有意に細胞とラミニン511-E8(2.1nM)とY-27632(+)(100μM)とともに注入した個体において高い値であった(ラミニン不存在下で平均717.3個/mm2であり、ラミニン存在下で平均1662.8個/mm2にまで増加した。)。このことはROCK阻害剤にラミニンを併用することでも、ラミニンはさらに細胞接着を生体内で促進するものと理解される。
次に、霊長類の例としてサル水疱性角膜症モデルを用いて、同様のラミニンとROCK阻害剤と角膜内皮細胞の移植併用の効果を確認した。
(使用した試薬等)
本実施例では、以下の試薬等を使用した。
・培養サル角膜内皮細胞(ウサギの培養方法と同様に調製したものであるが、以下に再度説明する。)
・ラミニン511 E8フラグメント(実施例1と同じ;株式会社ニッピ、382-02413)
・Y-27632((R)-(+)-トランス-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)(実施例2と同じ;カタログ番号:6880005; Calbiochem, La Jolla, CA)
・サル水疱性角膜症モデル(以下の(移植方法)に記載されるように作製した。)
(培養方法)
サル角膜内皮細胞(MCEC)は以下のように入手および培養することができる。具体的には、角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し,DMEM(Gibco-Invitrogen)に溶解した1.2U/ml Dispase I[(三光純薬) カタログ番号:GD81060]に入れて、37℃でインキュベートした。1時間後,ピペッティングでデスメ膜から角膜内皮細胞を剥離して回収し、1000rpm 5分間遠心分離して上清を除去した.沈殿している角膜内皮細胞に培養培地を加えて混和し、FNC Coating Mixをコートした6ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はDMEM(カタログ番号:12320;Gibco-Invitrogen)に10% FBS、50μg/ml ゲンタマイシン(カタログ番号:15710-064;Invitrogen)、10μg/ml Y-27632(カタログ番号:6880005;Calbiochem, La Jolla,CA)、2ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor;カタログ番号:13256-029;bFGF; Invitrogen)を加えたものを使用した。ウサギの角膜内皮細胞(CEC)の培養には、サルと同様、以前に報告した系[Tan DTら、Lancet., 2012;379:1749-1761; Koizumi Nら、 Exp Eye Res., 2012;95:60-67; Koizumi Nら、 Invest Ophthalmol Vis Sci..2007;48:4519-4526;Okumura Nら、 Am J Pathol. 2012;181:268-277]を使用した。
カニクイザルの角膜内皮を20ゲージシリコーン針(Soft Tapered Needle; Inami & Co., Ltd., Tokyo, Japan)を用いて機械的に剥離して水疱性角膜症モデルを作製した。図9では、水疱性角膜症モデルの前房内に、培養したサル角膜内皮細胞5.0×105個を、濃度2.1nMに調整したラミニン511 E8フラグメントを含有するDMEMととともに注入してうつむき姿勢を3時間取らせた。図10では、作製した水疱性角膜症モデルにおいてデスメ膜剥離を行い同様に、この水疱性角膜症モデルの前房内に、培養したサル角膜内皮細胞5.0×105個を、濃度2.1nMに調整したラミニン511 E8フラグメントを含有するDMEMととともに注入してうつむき姿勢を3時間取らせた。
超音波パキメーター(Ultrasound pachymeter)(SP-2000; Tomey, Nagoya, Japan)により角膜厚を測定した。測定不可の場合は測定可能上限値である1200μmとした。
結果を図9~10に示す。図9は、ラミニン511-E8を併用したサル水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植後の前眼部写真を示す。生体内での角膜内皮増殖が著しく制限される霊長類モデルにおいても本発明のラミニンまたはそのフラグメントは、ROCK阻害剤とともに用いて、角膜内皮細胞とともに投与することで、水疱性角膜症が治癒することが分かった。一方で、図10は、サル水疱性角膜症モデルにおいてデスメ膜剥離を行い、ラミニン511-E8を併用して培養角膜内皮細胞を移植した後の前眼部写真を示す。カニクイザルの角膜内皮細胞を機械的に掻爬したモデルにおいては、角膜の透明治癒は得られなかった。ウサギ水疱性角膜症モデルにおいては透明治癒が得られたが、カニクイザルモデルにおいては治療効果が得られなかった。このことはデスメ膜を剥離すること移植した細胞の角膜への接着が低下するために動物種によっては角膜内皮が再生しない可能性が示唆された。図11にデスメ剥離を行わずに移植した個体と、デスメ剥離を行って移植した個体の角膜厚の変化をグラフに示す。デスメ剥離群においては角膜厚が菲薄化しなかった一方、デスメ膜剥離しない場合には菲薄化した。
次に、別途デスメ膜剥離により露出した角膜裏側の実質をラミニンでコーティングすることで、ラミニンとROCK阻害剤と角膜内皮細胞の移植併用の効果が改善することを確認した。
(使用した試薬等)
本実施例では、以下の試薬等を使用した。
・培養サル角膜内皮細胞(実施例3のように調製したもの)
・ラミニン511 E8フラグメント(実施例1と同じ;株式会社ニッピ、382-02413)
・Y-27632((R)-(+)-トランス-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)(実施例2と同じ;カタログ番号:6880005;Calbiochem, La Jolla,CA)
(方法)
カニクイザルの角膜内皮を20-ゲージシリコーン針(Soft Tapered Needle; Inami & Co., Ltd., Tokyo, Japan)を用いて機械的に剥離して水疱性角膜症モデルを作製した。作製した水疱性角膜症モデルにおいてデスメ膜剥離を行い、水疱性角膜症モデルの前房内に、ラミニン511-E8フラグメントを21nMの濃度で注入し1時間おいた。このことにより、デスメ膜の剥離により露出した角膜実質を生体内でコーティングした。その後実施例3と同様に、水疱性角膜症モデルの前房内に、培養したサル角膜内皮細胞5.0×105個を、濃度2.1nMに調整したラミニン511-E8フラグメントを含むDMEMととともに注入してうつむき姿勢を3時間取らせた。
結果を図12に示す。図12に示すようにデスメ膜を剥離したのちに前房内にラミニン511 E8フラグメントを21nMの濃度で注入して角膜実質をコーティングすることで、コーティング無しでは得られなかった(図10)角膜の透明治癒が得られた。このことはラミニンは細胞懸濁液とともに注入することで、細胞接着を促進するのみならず、生体内のコーティング剤としても用い、細胞の生体内における生着を促進することが可能であることを示す。
本実施例では、各種インテグリンの角膜内皮細胞の細胞接着への影響を調べた。
(使用した試薬等)
本実施例では、以下の試薬等を使用した。
・コントロールは、ラミニン511-E8フラグメント非添加の群を意味する
・マウスIgG(DAKO、X0931)
・抗インテグリンα3(Millipore、MAB1952Z-20)
・抗インテグリンα6(Millipore、MAB1378-20)
・抗インテグリンα2(Millipore、MAB1950Z-20)
・抗インテグリンβ1(R&D Systems、MAB17781)
・抗インテグリンα3β1および抗インテグリンα6β1は上記を組み合わせたものを使用した。
・511-E8フラグメント(上記実施例と同じである)
(方法)
ヒト角膜内皮細胞を培養している培養皿から培地を完全に除去し、PBS(-)で2回洗浄した。洗浄後、リン酸緩衝液を添加し、37℃(5% CO2)で5分間インキュベートした。その後、PBS(-)を除去し、TrypLETMSelect(10X)(Life Technologies、A12177-01)を添加し、37℃(5% CO2)で10分間インキュベートした。その後、Opti-MEMI(Life Technologies、31985-070)を添加し、細胞を回収した。回収後、1200rpmで3分間遠心分離し、Opti-MEMIにて細胞懸濁液を作製した。この時、コントロールとしてラミニン511-E8フラグメント非添加の群、ラミニン511-E8フラグメントを最終濃度2.1nMとなるように添加した群を用意した。同時に、ラミニン511-E8フラグメント添加群にはmouseIgG、インテグリン中和抗体を最終濃度2μg/mlになるように添加し、調整した。調整後、96well plateの1wellあたり5000個の細胞を播種し、37℃(5%CO2)で24時間インキュベートした。播種24時間後、培地を完全に除去し、PBS(-)で2回洗浄した。洗浄後、培地とCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation, Madison, WI)を1:1の割合で添加し、2分間遮光で振盪した後、10分間静置した。その後測定した。24h,*p<0.01, Dunnet検定, n=6。
(結果)
結果を図13に示す。示されるように、ラミニン511-E8フラグメントを播種時に培地に添加することで角膜内皮細胞の細胞接着はコントロールに対して促進されたが、インテグリンβ1の中和抗体により、細胞接着はコントロールと同程度まで抑制された。
次に、本実施例では、細胞接着関連タンパク質の活性化はインテグリンを介していることを実証した。
(試薬等)
原則として実施例5と同じ条件を用いた。
・マウスIgG(実施例5と同じである)
・抗インテグリンα3(実施例5と同じである)
・抗インテグリンα6(実施例5と同じである)
・抗インテグリンα2(実施例5と同じである)
・抗インテグリンβ1(実施例5と同じである)
・抗インテグリンα3β1(実施例5と同じである)
・抗インテグリンα6β1(実施例5と同じである)
(方法)
ヒト角膜内皮細胞を培養している培養皿から培地を完全に除去し、PBS(-)で2回洗浄した。洗浄後、リン酸緩衝液を添加し、37℃(5% CO2)で5分間インキュベートした。その後、PBS(-)を除去し、TrypLETMSelect(10X)(Life Technologies、A12177-01)を添加し、37℃(5% CO2)で10分間インキュベートした。その後、Opti-MEMI(Life Technologies、31985-070)を添加し、細胞を回収した。回収後、1200rpmで3分間遠心分離し、Opti-MEMIにより、細胞懸濁液を作製した。この時、コントロールとしてラミニン511-E8フラグメント非添加の群、ラミニン511-E8フラグメントを最終濃度2.1nMとなるように添加した群を用意した。同時に、ラミニン511-E8フラグメント添加群にはmouseIgG、インテグリン中和抗体を最終濃度2μg/mlになるように添加し、調整した。調整後、12well plateの1wellあたり1×105個の細胞を播種し、播種3時間後にタンパク質を回収した。ウエスタンブロッティング法により、Phospho-FAK(Cell Signaling TECHNOLOGY、8556S)、FAK(Cell Signaling TECHNOLOGY、3285S)、p-Paxillin(Cell Signaling TECHNOLOGY、2541S)の検出を行った。各抗体の希釈倍率は1:1000とした。デンシトメトリーはImage Jを用いて定量した。
結果を図14に示す。示されるように、播種3時間後ではp-FAKはラミニン511-E8フラグメントにより促進されたが、インテグリン中和抗体によりコントロールと同程度まで抑制された。p-Paxillinもラミニン511-E8フラグメントにより促進されたが、インテグリンβ1の中和抗体によりコントロールと同程度まで抑制された。このことからE8はインテグリンを介して接着関連タンパク質を活性化することで細胞接着を促進していることがわかる。
促進することで角膜内皮細胞の基質接着性を促進するものと考えられる。したがって、ラミニン511-フラグメントE8等のラミニンは角膜内皮細胞移植に応用できるものと考えられる。
本実施例では、製剤例として、本発明の因子を含有する治療液を以下のようにして製造する。
ラミニン511、ラミニン521および/またはそれらのフラグメント(0.75μg/cm2)
最終濃度が2.1nM
培養角膜内皮細胞 (実施例1等に準じて調製したものを適量)
適宜の緩衝液 適量
全量 100mL
本実施例では、製剤例として、本発明の因子を含む、コーティング用溶液を以下のように製造する。
ラミニン511、ラミニン521および/またはそれらのフラグメント(0.75μg/cm2)
最終濃度が21nM
適宜の緩衝液 適量
全量 100mL
各成分は、実施例1~4に記載のように入手することができる。
配列番号2:ラミニンα5鎖アミノ酸配列(NP_005551)
配列番号3:ラミニンβ1鎖核酸配列(NM_002291)
配列番号4:ラミニンβ1鎖アミノ酸配列(NP_002282)
配列番号5:ラミニンβ2鎖核酸配列(NM_002292)
配列番号6:ラミニンβ2鎖アミノ酸配列(NP_002283)
配列番号7:ラミニンγ1鎖核酸配列(NM_002293)
配列番号8:ラミニンγ1鎖アミノ酸配列(NP_002284)
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- 図面に記載の発明。
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