TW202117019A - 細胞的分化狀態的評價方法、自富潛能幹細胞製造視網膜色素上皮細胞的方法、胚胎幹細胞製造視網膜色素上皮細胞的方法 - Google Patents

Abstract

本發明是有關於一種對自誘導性富潛能幹細胞（iPS細胞）向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中的、細胞的分化狀態進行評價的方法。進而，本發明是有關於一種對自胚胎幹細胞（ES細胞）向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中的、細胞的分化狀態進行評價的方法。

Description

細胞的分化狀態的評價方法、自富潛能幹細胞製造視網膜色素上皮細胞的方法、胚胎幹細胞製造視網膜色素上皮細胞的方法

本發明是有關於一種對自人誘導性富潛能幹細胞（Induced Pluripotent Stem cells，iPS細胞）向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中的、細胞的分化狀態進行評價的方法。進而，本發明是有關於一種對自人胚胎幹細胞（Embryonic Stem cells，ES細胞）向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中的、細胞的分化狀態進行評價的方法。

高齡黃斑變性症為位於視網膜中心的黃斑部的功能降低的疾病，是發達國家中導致老年人失明的主要疾病之一。高齡黃斑變性有滲出型及萎縮型。視網膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium，RPE）細胞形成存在於有黃斑的視網膜的外側的片狀單層細胞層，對於維持視網膜的視細胞而言重要。於RPE細胞層的更外側，存在富含血管的脈絡膜。為了獲得正常的視力，需要位於視網膜的外側的RPE細胞及脈絡膜正常地發揮功能。滲出型高齡黃斑變性為如下疾病：因高齡所致的RPE細胞的功能降低或損傷等，來自脈絡膜的異常的新生血管貫穿視網膜色素上皮並形成於視網膜下，且因視網膜下的出血或血液成分的漏出等，視細胞的功能受到阻礙。萎縮型高齡黃斑變性為如下疾病：因老化而RPE細胞產生炎症，RPE細胞以及位於其上部的視細胞丟失，視力受到阻礙。

作為滲出型高齡黃斑變性的治療，以抑制新生血管為目的，進行抗血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）抗體等VEGF抑制劑的眼內注射。但是，抗VEGF抗體的治療效果的持續時間短，因此復發的病例多。對於萎縮型高齡黃斑變性，尚未獲得有效的治療方法。關於滲出型及萎縮型高齡黃斑變性的任一者，認為均是因RPE細胞的功能降低或損傷而引起的，因此嘗試有如下治療：自作為富潛能幹細胞的ES細胞或iPS細胞分化誘導RPE細胞，並於去除新生血管後移植到視網膜。為此，開發有如下方法：自ES細胞或iPS細胞分化誘導為RPE細胞的方法、以及自進行了分化的RPE細胞製作片狀視網膜色素上皮的方法（專利文獻1、非專利文獻1及非專利文獻2）。

於對源自人iPS細胞的RPE細胞進行移植的臨床研究中，並未充分弄清怎樣的RPE細胞顯示出高的移植效果。另一方面，RPE細胞的色素（黑色素（melanin））量與細胞的成熟度密切相關，因此，提出有藉由色素沈著的觀察或色素量的測定來篩選出適於移植的RPE細胞的方法（非專利文獻3）。但是，於進行自iPS細胞向RPE細胞的分化且RPE細胞成熟後方可進行色素量的測定，因此，於色素進行沈著之前的階段中，難以篩選出適於移植的可能性高的RPE細胞。自富潛能幹細胞向RPE細胞進行分化誘導時，通常需要數十天的長期間的培養（非專利文獻4及非專利文獻5）。因此，就準備RPE細胞的移植的方面而言，重要的是於培養過程中預測是否可獲得進行了分化的RPE細胞。非專利文獻5中，報告有OTX1及OTX2作為存在自ES細胞向RPE細胞進行分化的可能性的前驅細胞的標記。但是，為了測定OTX1或OTX2表達量，需要對細胞進行破碎或溶解這一對於細胞的侵襲性處理，無法將預定移植的細胞設為評價對象。 [現有技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]WO2014/030749 [非專利文獻]

[非專利文獻1]平見Y、小坂田F、高橋K等人，「自小鼠與人誘導性富潛能幹細胞向視網膜細胞的產生」，「神經科學快報」（2009;458:126-131）（Hirami Y, Osakada F, Takahashi K, et al. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 2009;458:126-131.） [非專利文獻2]鐮尾H、萬代M、岡本S等人，「旨在臨床應用的由人誘導性富潛能幹細胞衍生的視網膜色素上皮細胞片的表徵」，「幹細胞報告」（2014;2:205-218）（Kamao H, Mandai M, Okamoto S, et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports 2014;2:205-218.） [非專利文獻3]鐮尾H、萬代M、若宮S等人，「由人誘導性富潛能幹細胞衍生的RPE的色素沈著程度的客觀評價」，「眼科研究與視力學」（2014;55:8309-8318）（Kamao H, Mandai M, Wakamiya S, et al. Objective evaluation of the degree of pigmentation in human induced pluripotent stem cell-derived RPE. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55:8309-8318.） [非專利文獻4]萊恩A、飛利浦LR、魯班L等人，「自人富潛能幹細胞向視網膜色素上皮的工程高效分化」，「幹細胞轉化醫學」（2014;3:1295-1304）（Lane A, Philip LR, Ruban L, et al. Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2014;3:1295-1304.） [非專利文獻5]弗格A、凱爾AJ、勞倫斯J等人，「由HESC衍生RPE的現象闡述：細胞生成、擴張與視網膜移植的解剖」，「實驗神經學」（2008;214:347-361）（Vugler A, Carr AJ, Lawrence J, et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE：anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 2008;214:347-361.）

[發明所欲解決之課題] 於自人誘導性富潛能幹細胞（iPS細胞）或人胚胎幹細胞（ES細胞）向視網膜色素上皮細胞（RPE細胞）進行分化的步驟中，即便為相同培養條件下的情況，亦會獲得分化為成熟的RPE細胞的細胞與保持未分化的狀態的細胞。本發明的目的為提供一種方法，其藉由在觀察到成為細胞的成熟度的指標的色素沈著之前，對細胞進行非侵襲性評價，而於早期判別自富潛能幹細胞向RPE細胞進行分化的細胞與不分化的細胞。 [解決課題之手段]

即，本發明的目的可藉由以下發明來達成。 〔1〕 一種方法，其對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中的、該富潛能幹細胞的分化狀態進行評價，所述方法包括： （1）對富潛能幹細胞的培養上清液中的指標物質的存在量進行測定的步驟；以及 （2）基於所述指標物質的存在量的變化，對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價的步驟， 所述指標物質為鳥胺酸及/或瓜胺酸。 〔2〕 如〔1〕所述的方法，其中於所述步驟（2）中，藉由對培養上清液中的所述指標物質的存在量的經時變化進行分析，來評價富潛能幹細胞的分化狀態。 〔3〕 如〔2〕所述的方法，其中對所述經時變化進行分析的期間為將所述富潛能幹細胞的培養基自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天的、第0天至第20天為止的期間。 〔4〕 如〔2〕所述的方法，其中對所述經時變化進行分析的期間為將所述富潛能幹細胞的培養基自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天的、第3天至第12天為止的期間。 〔5〕 如〔2〕至〔4〕中任一項所述的方法，其中於判定為所述經時變化大的情況下，評價為進行自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞分化的可能性高。 〔6〕 如〔1〕所述的方法，其中於所述步驟（1）中，對作為所述指標物質的鳥胺酸及瓜胺酸的存在量進行測定，且於鳥胺酸及瓜胺酸的存在量的經時變化實質上相同的情況下，評價為進行自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞分化。 〔7〕 如〔2〕至〔4〕中任一項所述的方法，其中於所述步驟（2）中，基於與所述指標物質的存在量相關的變動係數的閾值，對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價。 〔8〕 如〔7〕所述的方法，其中於所述變動係數的閾值與鳥胺酸的存在量相關而為0.20以上及/或與瓜胺酸的存在量相關而為0.30以上的情況下，評價為進行自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞分化。 〔9〕 如〔1〕所述的方法，其進而包括：步驟（3），對細胞的分化狀態已知的對照細胞的培養上清液中的指標物質的存在量進行測定，並且 藉由對所述步驟（1）中進行測定的所述富潛能幹細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量、與所述步驟（3）中進行測定或已測定的所述對照細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量進行比較，來對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價。 〔10〕 如〔9〕所述的方法，其中基於所述富潛能幹細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量、與所述對照細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量的比或差是否為預先規定的閾值以上、或者是否小於閾值，對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價。 〔11〕 如〔9〕所述的方法，其中藉由對所述富潛能幹細胞的培養上清液中的指標物質的存在量的經時變化、與所述對照細胞的培養上清液中的指標物質的存在量的經時變化進行比較，來對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價。 〔12〕 如〔9〕至〔11〕中任一項所述的方法，其中所述對照細胞為於自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中維持未分化的狀態的細胞。 〔13〕 如〔1〕所述的方法，其進而包括：步驟（4），將於自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中確認到細胞的分化的細胞設為對照細胞，並預先對該對照細胞的培養上清液中的指標物質的存在量進行測定，並且 藉由對所述富潛能幹細胞的培養上清液中的指標物質的存在量、與所述對照細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量進行比較，來評價細胞的分化狀態。 〔14〕 如〔13〕所述的方法，其中基於根據所述對照細胞的培養上清液中的指標物質的存在量而規定的閾值，評價細胞的分化狀態。 〔15〕 如〔1〕至〔14〕中任一項所述的方法，其中所述富潛能幹細胞為誘導性富潛能幹細胞（iPS細胞）或胚胎幹細胞（ES細胞）。 〔16〕 如〔1〕至〔15〕中任一項所述的方法，其中利用質譜法對所述指標物質的存在量進行測定。 〔17〕 一種自富潛能幹細胞製造視網膜色素上皮細胞的方法，其使用如〔1〕至〔16〕中任一項所述的方法。 〔18〕 一種方法，其對自胚胎幹細胞（ES細胞）向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中的、該ES細胞的分化狀態進行評價，所述方法包括： （1）對ES細胞的培養上清液中的指標物質的存在量進行測定的步驟；以及 （2）基於所述指標物質的存在量的變化，對自ES細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價的步驟， 所述指標物質為選自由麩胱甘肽、鳥胺酸、瓜胺酸、半胱胺酸、六氫菸鹼酸、腐胺、脯胺酸、2-胺基己二酸、胞苷、脫氧胞苷、腺苷及肌苷所組成的群組中的至少一種。 〔19〕 一種方法，其對自胚胎幹細胞（ES細胞）向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中的、該ES細胞的分化狀態進行評價，所述方法包括： （1）對ES細胞的培養上清液中的指標物質的存在量進行測定的步驟；以及 （2）基於所述指標物質的存在量的變化，對自ES細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價的步驟， 所述指標物質為選自由麩胱甘肽、鳥胺酸、瓜胺酸、六氫菸鹼酸、2-胺基己二酸、胞苷及脫氧胞苷所組成的群組中的至少一種。 〔20〕 一種方法，其對自胚胎幹細胞（ES細胞）向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中的、該ES細胞的分化狀態進行評價，所述方法包括： （1）對ES細胞的培養上清液中的指標物質的存在量進行測定的步驟；以及 （2）基於所述指標物質的存在量的變化，對自ES細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價的步驟， 所述指標物質為腺苷及/或肌苷。 〔21〕 如〔18〕至〔20〕中任一項所述的方法，其中於所述步驟（2）中，藉由對培養上清液中的所述指標物質的存在量的經時變化進行分析，來評價所述ES細胞的分化狀態。 〔22〕 如〔18〕至〔21〕中任一項所述的方法，其中利用質譜法對所述指標物質的存在量進行測定。 〔23〕 一種自ES細胞製造視網膜色素上皮細胞的方法，其使用如〔18〕至〔22〕中任一項所述的方法。 [發明的效果]

根據本發明，於自作為富潛能幹細胞的誘導性富潛能幹細胞（iPS細胞）或胚胎幹細胞（ES細胞）向視網膜色素上皮細胞（RPE細胞）進行分化的過程中，藉由在成為分化為成熟的RPE細胞的指標的色素（黑色素）沈著產生之前，對培養上清液中的指標物質進行測定，可於早期判別向RPE細胞進行分化的細胞與不分化的細胞。自富潛能幹細胞向RPE細胞進行分化誘導時，需要長時間的培養，但藉由可於早期判別分化的成敗，可於早期將因不分化而無法用於移植的細胞排除。該情況會削減不必要的培養成本與用於培養的勞力與時間。進而，本發明的方法於不需要對細胞進行破碎或溶解這一對於細胞的侵襲性處理的情況下對細胞上清液中的指標物質進行測定，因此，對於細胞而言為非侵襲性的，且關於實際預定移植的細胞其本身，可事先對分化誘導的成敗進行評價。因此，可順利地進行RPE細胞的移植準備。

本發明提供一種對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中的該富潛能幹細胞的分化狀態進行評價的方法。該方法包括：（1）對富潛能幹細胞的培養上清液中的指標物質的存在量進行測定的步驟；以及（2）基於所述指標物質的存在量的變化，對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價的步驟。另外，所述指標物質為鳥胺酸及/或瓜胺酸。

進而，本發明提供一種對自胚胎幹細胞（ES細胞）向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中的、該ES細胞的分化狀態進行評價的方法。該方法包括：（1）對ES細胞的培養上清液中的指標物質的存在量進行測定的步驟；以及（2）基於所述指標物質的存在量的變化，對自ES細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價的步驟。另外，所述指標物質為選自由麩胱甘肽、半胱胺酸、脫氧胞苷、2-胺基己二酸、瓜胺酸、六氫菸鹼酸、腐胺、鳥胺酸、胞苷、腺苷、肌苷及脯胺酸所組成的群組中的至少一種。亦可將所述指標物質設為選自由麩胱甘肽、脫氧胞苷、2-胺基己二酸、瓜胺酸、六氫菸鹼酸、鳥胺酸及胞苷所組成的群組中的至少一種。

於本發明的分化誘導步驟中，視網膜色素上皮細胞是由富潛能幹細胞製作。作為富潛能幹細胞，可使用作為未分化細胞的iPS細胞（Induced Pluripotent Stem cells）或ES細胞（Embryonic Stem cells）。iPS細胞為人工幹細胞，可藉由將核酸、蛋白質或作為低分子化合物等的特定富潛能誘導因子導入體細胞內來製作（高橋K、山中D，「細胞」（2006;126:663-676）（Takahashi K. Yamanaka D. Cell, 2006;126:663-676）；高橋K等人，「細胞」（2007;131:861-872）（Takahashi K. et al. Cell, 2007;131:861-872）；WO2007/069666）。ES細胞可藉由自哺乳動物的受精卵的胚胞取出內細胞團並對該內細胞團進行培養來製作（末守H等人，「生物化學與生物物理學研究通訊」（2006;345:926-932）（Suemori H. et al. Biochem Biophys Res Commun. 2006;345:926-932））。iPS細胞及ES細胞可使用源自哺乳動物、例如人、猴子、小鼠、大鼠、狗、貓、牛、馬、豬、綿羊、山羊、兔子、倉鼠及豚鼠等的細胞，較佳為源自人的細胞。

於自作為富潛能幹細胞的iPS細胞或ES細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中，首先，於細胞增殖用培養基中對所述幹細胞進行培養，其次，置換為細胞分化用培養基來進行培養。使所述幹細胞分化為視網膜色素上皮細胞的培養條件及培養基可使用本領域技術人員公知的培養條件及培養基，本領域技術人員亦可適當地進行改變。亦可使用市售的培養基，作為細胞增殖用培養基，例如可列舉伊森謝（Essential）8（註冊商標）培養基，作為細胞分化用培養基，例如可列舉伊森謝（Essential）6（註冊商標）培養基。

作為對自iPS細胞或ES細胞向視網膜色素上皮細胞的分化進行確認的方法，報告有若干方法（厚生勞動省醫藥食品局審查管理課 醫藥食品局醫療機器審查管理室發令0529第1號（2013年5月29日）附件1「與源自自體iPS細胞的視網膜色素上皮細胞相關的評價指標」）。例如，藉由利用相位差顯微鏡觀察等，對視網膜色素上皮細胞特有的茶褐色的色素（黑色素）沈著或者多邊形或石板狀細胞形態等的存在進行觀察，可確認向視網膜色素上皮細胞的分化。另外，藉由確認視網膜色素上皮細胞的特徵性基因的表達，可確認向視網膜色素上皮細胞的分化。作為視網膜色素上皮細胞的特徵性基因，可列舉：RPE65、CRALBP、MERTK及BEST1等。關於iPS細胞或ES細胞（未分化細胞）的混合存在，可藉由如下方式來評價：作為未分化標記的Oct3/4、Sox及TRA-1-60等的利用免疫染色進行的分析、或者未分化標記基因（OCT3/4、Nanog及Lin28等）的測定。

本發明的方法可於確認到自作為富潛能幹細胞的iPS細胞或ES細胞向視網膜色素上皮細胞的分化之前，在早期判別進行分化的細胞或細胞集團。出於該目的，於本發明的步驟（1）中，對iPS細胞或ES細胞的培養上清液中的指標物質的存在量進行測定。所謂指標物質，為作為iPS細胞或ES細胞的代謝產物而釋放於培養上清液中的化合物或分化用培養基中所含的培養基成分，較佳為作為胺基酸的一種的鳥胺酸（ornithine）及瓜胺酸（citrulline）。關於ES細胞，作為用於在早期判別自ES細胞向視網膜色素上皮細胞進行分化的細胞或細胞集團的指標物質，除了鳥胺酸及瓜胺酸以外，亦可進而選擇麩胱甘肽（glutathione）、半胱胺酸（cysteine）、六氫菸鹼酸（pipecolic acid）、腐胺（putrescine）、脯胺酸（proline）、2-胺基己二酸（2-aminoadipic acid）、胞苷（cytidine）、脫氧胞苷（deoxycytidine）、腺苷（adenosine）及肌苷（inosine）。該些可單獨或將兩種以上加以組合來評價細胞的分化狀態。

本發明的步驟（2）為基於本發明的步驟（1）中已測定的、富潛能幹細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量，對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價的步驟。於本發明的一實施方式中，藉由對所述指標物質的存在量的經時變化進行分析，來評價富潛能幹細胞的分化狀態。所謂指標物質的存在量的經時變化，為隨著富潛能幹細胞的培養時間的經過的、培養上清液中的指標物質量的變化。培養上清液中的指標物質量可由培養液中的指標物質的濃度或絕對量、每單位細胞數的指標物質量及每一培養容器的總指標物質量等來表示，但並不限定於該些。於對培養上清液中的指標物質的存在量的經時變化進行分析時，包含在指標物質的存在量的經時變化的曲線或輪廓中檢測出存在量的短暫性或持續性的增加或減少的情況。培養上清液中的指標物質的存在量的短暫性或持續性的增加或減少是作為存在量的經時變化的曲線或輪廓自基線（baseline）的變動而被識別。

於本發明的一實施方式中，對培養上清液中的鳥胺酸及/或瓜胺酸的存在量的經時變化進行分析的期間較佳為將富潛能幹細胞的培養基自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天的、第0天至第20天為止的期間。經時變化的分析可於該期間的整個範圍內進行，但只要可觀察到變化，亦可於更短的期間、例如第3天至第12天內進行分析。於鳥胺酸的存在量的情況下，可於第4天至第12天為止的期間內進行分析，另外，於瓜胺酸的存在量的情況下，可於第8天至第12天為止的期間內進行分析。通常，自細胞增殖用培養基向細胞分化用培養基的置換較佳為於在細胞增殖用培養基中培養7天～10天後進行，可根據細胞的增殖程度來增減天數。

於本發明的一實施方式中，在判定為富潛能幹細胞的培養上清液中的鳥胺酸或瓜胺酸的存在量的經時變化大的情況下，評價為進行自該富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞分化的可能性高。所謂判定為所述經時變化大的情況，是指鳥胺酸或瓜胺酸的存在量的經時變化的曲線或輪廓自基線（baseline）的變動或偏離大，鳥胺酸或瓜胺酸的存在量急速增加，然後減少的狀態。其結果，於鳥胺酸或瓜胺酸的存在量的經時變化中，觀察到明確的峰值。若為本領域技術人員，可藉由參照經時變化的曲線或輪廓而容易地識別出該峰值。經時變化中的該峰值可為單峰性峰值，或者亦可為多峰性峰值。

為了作為富潛能幹細胞的iPS細胞或ES細胞分化為視網膜色素上皮細胞並產生作為已進行分化的指標的色素沈著，通常需要30天～50天左右的培養時間。另一方面，於產生細胞中的色素沈著的時期之前觀察培養上清液中的鳥胺酸或瓜胺酸的存在量的經時變化中的峰值。觀察到該峰值的培養細胞藉由之後繼續進行培養而產生向視網膜色素上皮細胞進行分化的指標即色素沈著，因此評價為於觀察到該峰值的時間點，進行自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞分化的可能性高。

於本發明的一實施方式中，在富潛能幹細胞的培養上清液中的鳥胺酸及瓜胺酸的存在量的經時變化實質上相同的情況下，評價為進行自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞分化。由於是基於鳥胺酸及瓜胺酸的存在量的經時變化此兩者進行評價，因此與單獨使用鳥胺酸或瓜胺酸的存在量的經時變化的某一者進行評價的情況相比，評價結果的可靠性提高。所謂培養上清液中的鳥胺酸及瓜胺酸的存在量的經時變化實質上相同，是指該經時變化滿足以下兩個條件的情況。該條件為：（1）於如下方面共通，即於鳥胺酸及瓜胺酸的存在量的經時變化中觀察到的峰值為存在量隨著培養時間的經過而增加、然後減少這一形狀的峰值；（2）即便所述峰值為多峰性，獲得存在量最高的主峰值的培養時間亦大致共通。所謂大致共通，是指於鳥胺酸及瓜胺酸之間賦予主峰值位置的培養時間的差異為5天以內，較佳為3天以內，更佳為1天以內。

於本發明的一實施方式中，基於與作為指標物質的鳥胺酸及/或瓜胺酸的存在量相關的變動係數的閾值，評價自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態。所述變動係數是藉由用所述存在量的標準偏差除以所述存在量的平均值來算出。即，將富潛能幹細胞的培養期間中的、指標物質的存在量的測定次數設為資料數，算出各次測定的存在量的平均值。其次，算出用各次測定的存在量的值與所述存在量的平均值的差的平方的合計值除以所述資料數而得的值的正的正方根作為標準偏差。用如此算出的標準偏差除以所述存在量的平均值，藉此算出變動係數。變動係數為資料的偏差的大小的比率，所述變動係數越大，表示培養期間中所測定的指標物質的存在量的變動越大，相反，若所述變動係數小，則表示培養期間中所測定的指標物質的存在量的變動小。

於本發明的一實施方式中，在所述變動係數的閾值關於鳥胺酸的存在量而為0.20以上、較佳為0.25以上及/或關於瓜胺酸的存在量而為0.30以上的情況下，評價為進行自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞分化。即，於培養上清液中的鳥胺酸及/或瓜胺酸的存在量在培養期間中顯示出一定的變動的情況下，評價為進行所述細胞分化。與鳥胺酸及/或瓜胺酸的存在量相關的變動係數的閾值為根據變動係數的算出值與自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞分化狀態的對比而經驗性地導出的值，若為本領域技術人員，則亦可根據進行對比的試驗例或試驗數來再次設定被推測為更適當的閾值。用於算出所述變動係數的培養期間若為富潛能幹細胞的培養基自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期以後，則可任意規定。所述培養期間為將富潛能幹細胞的培養基自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天的、較佳為第0天至第20天為止的期間，更佳為第3天至第12天。於鳥胺酸的存在量的情況下，所述培養期間進而佳為第4天至第12天為止的期間，另外，於瓜胺酸的存在量的情況下，進而佳為第8天至第12天為止的期間。

於本發明的一實施方式中，提供一種方法，其進而包括：步驟（3），對細胞的分化狀態已知的對照細胞的培養上清液中的指標物質（鳥胺酸及/或瓜胺酸）的存在量進行測定，並且藉由對本發明的步驟（1）中進行測定的所述富潛能幹細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量、與所述步驟（3）中進行測定或已測定的所述對照細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量進行比較，來對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價。對對照細胞的培養上清液中的指標物質的存在量進行測定的所述步驟（3）可與所述步驟（1）同期執行，或者亦可獨立於所述步驟（1）的執行而於執行所述步驟（1）之前實施。對照細胞可為源自如下細胞株的富潛能幹細胞，所述細胞株與供於自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導的細胞相同，或者亦可為源自與供於分化誘導的細胞不同的富潛能幹細胞株的細胞。所謂細胞的分化狀態已知的對照細胞，為已知細胞為未分化的狀態、抑或為已分化狀態、且分化狀態於培養期間中不會變化的細胞。未分化的狀態例如可藉由如下方式來確認：利用免疫染色來分析Oct3/4、Sox及TRA-1-60等未分化標記的存在；或者未分化標記基因（OCT3/4、Nanog及Lin28等）的測定。關於已分化的狀態，例如若為視網膜色素上皮細胞，則可藉由茶褐色的色素（黑色素）沈著或者多邊形或石板狀細胞形態的存在、或者藉由測定RPE65、CRALBP、MERTK及BEST1等基因表達來確認。

於本發明的一實施方式中，提供一種方法，其中基於所述富潛能幹細胞的培養上清液中的指標物質（鳥胺酸及/或瓜胺酸）的存在量、與所述對照細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量的比或差是否為預先規定的閾值以上、或者是否小於閾值，對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價。所述閾值可藉由如下方式導出：關於確認到自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化的細胞以及未確認到分化的細胞的培養上清液，增加細胞培養的樣品數，反覆測定各樣品中的鳥胺酸及瓜胺酸的存在量。即，所述閾值為經驗性地導出的值，若為本領域技術人員，則可容易地設定。

於本發明的一實施方式中，提供一種方法，其中藉由對所述富潛能幹細胞的培養上清液中的指標物質（鳥胺酸及/或瓜胺酸）的存在量的經時變化、與所述對照細胞的培養上清液中的指標物質的存在量的經時變化進行比較，來對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化狀態進行評價。所謂指標物質的存在量的經時變化，對於富潛能幹細胞及對照細胞任一者而言，均是指隨著培養時間的經過的培養上清液中的指標物質量的變化。指標物質量可由培養液中的指標物質的濃度或絕對量、每單位細胞數的指標物質量及每一培養容器的總指標物質量等來表示，但並不限定於該些。所謂對培養上清液中的指標物質的存在量的經時變化進行比較，是指掌握指標物質的存在量的經時變化的曲線或輪廓的類似性或者非類似性。

於本發明的一實施方式中，作為所述對照細胞，可使用於自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中維持未分化的狀態的細胞。所謂於自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中維持未分化的狀態，意味著未自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞進行分化，且是指維持未觀察到色素（黑色素）沈著、或者未觀察到RPE65、CRALBP、MERTK及BEST1等視網膜色素上皮細胞的特徵性基因的表達的狀態。將富潛能幹細胞維持為未分化的狀態可藉由如下方式來達成：並不將富潛能幹細胞的培養基置換為細胞分化用培養基，而是直接於細胞增殖用培養基中進行繼代培養。

於本發明的一實施方式中，提供一種方法，其進而包括：步驟（4），將於自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中確認到細胞的分化的細胞設為對照細胞，並預先對該對照細胞的培養上清液中的指標物質（鳥胺酸及/或瓜胺酸）的存在量進行測定，並且藉由對所述富潛能幹細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量、與所述對照細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量進行比較，來評價細胞的分化狀態。該方法中，預先對確認到自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化的對照細胞測定培養上清液中的所述指標物質的存在量，並將該測定值設為用於判別已進行分化誘導的參照值或指標。根據該方法，可將所述參照值或指標作為基準，來判別培養的富潛能幹細胞是否分化為視網膜色素上皮細胞。所述富潛能幹細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量、與所述對照細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量的比較可藉由某特定培養時間下的存在量的比較來進行。於本發明的一實施方式中，可基於根據所述對照細胞的培養上清液中的指標物質的存在量而規定的閾值，對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化狀態進行評價。

於本發明的一實施方式中，可將與所述步驟（4）中獲得的多種對照細胞的分化狀態及該對照細胞的培養上清液中的指標物質（鳥胺酸及/或瓜胺酸）的存在量相關的資訊記錄為針對每個對照細胞的庫（library）。若使用該庫，則亦可藉由將所述分化誘導步驟中的富潛能幹細胞的培養上清液中的指標物質的存在量、和與所述分化誘導步驟中的富潛能幹細胞相同的細胞株所對應的所述庫中的存在量的相關資訊加以對照，來評價細胞的分化狀態。

所述富潛能幹細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量、與所述對照細胞的培養上清液中的所述指標物質的存在量的比較亦可藉由多個培養時間下的存在量的比較、即對存在量的經時變化的曲線或輪廓進行比較來進行。其原因在於：藉由比較多個培養時間下的存在量，是否已進行分化的判別精度提高。是否已進行分化的判別可基於所述曲線或輪廓的類似性來進行。此處，所謂類似性，是指隨著培養時間的經過的曲線或輪廓的形狀類似。

於本發明中，作為對培養上清液中的所述指標物質的存在量進行定量測定的方法，可使用氣相層析法（Gas Chromatography，GC）、液相層析法（Liquid Chromatography，LC）及質譜法（Mass Spectrometry，MS）等。進而，於指標物質的定量性測定中亦可適宜地使用液相層析質譜法（LC-MS）及氣相層析質譜法（GC-MS），但並不限定於該些。

利用LC-MS進行的分析可以如下方式進行。對於培養上清液試樣100 μL，添加0.5 mM異丙基蘋果酸水溶液20 μL作為內部標準，混合後，添加乙腈或甲醇200 μL，去除蛋白質。對所獲得的試樣，使用托彌（TOMY）精工製造的離心機，於15,000 rpm下且於室溫下離心分離15分鐘，之後，回收上清液，利用超純水（MiLLi-Q（註冊商標）水，默克（Merck）股份有限公司）稀釋10倍，供於LC-MS分析。LC-MS分析是依照島津製作所製造的「LC/MS/分析方法包細胞培養剖析」（以下，簡稱為「MP」）中所收錄的分析條件。MP中彙集有用於利用LC-MS對培養基中所含的化合物以及自細胞分泌的代謝物進行分析的分析條件參數。化合物的鑑定是將如下情況作為基準來進行：MP中所註冊的標準品的保持時間與試樣中的化合物的保持時間的差為±0.3分鐘以內、檢測出定量離子及確認離子兩者的峰值、以及強度值為1000以上。化合物的定量是藉由如下方法進行：對試樣中的各化合物的特徵性離子（定量離子），算出質量層析圖的面積。

利用GC-MS進行的分析可以如下方式進行。對於培養上清液試樣100 μL，添加0.5 mg/mL異丙基蘋果酸水溶液10 μL作為內部標準，混合後，添加乙腈200 μL，去除蛋白質。將所獲得的試樣於15,000 rpm下且於室溫下離心分離15分鐘，之後，回收上清液100 μL，進行減壓乾燥。於包含甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液中對各試樣進行培育，藉此進行試樣中的化合物的甲肟化。進而，於各試樣中添加MSTFA（N-甲基-三甲基矽烷基三氟乙醯胺），使試樣中的化合物三甲基矽烷化（衍生物化）。將如此進行了衍生物化處理的試樣供於利用GC-MS進行的分析中。

於GC-MS分析中，使用島津製作所製造的「智慧型代謝物資料庫（Smart Metabolites Database）」（以下簡稱為「DB」）。該DB中彙集有利用GC-MS對進行了與所述衍生物化處理相同的處理的各種標準品進行分析而得的資料。化合物的鑑定是將如下情況作為指標來進行：所述DB中所設定的保持指標（使保持時間相對化而成的數值）與試樣中的衍生物化化合物的保持指標的差是否為±5以內、以及對於試樣中的衍生物化化合物是否檢測出所述DB中所設定的定量離子及確認離子此兩者。另一方面，化合物的定量是藉由如下方法來進行：依照所述DB中所設定的條件，對試樣中的各衍生物化化合物的特徵性離子，算出質量層析圖的面積。

作為培養上清液中的所述指標物質的存在量，例如於使用GC、LC、GC-MS或LC-MS的情況下，可使用根據該些測定方法中的所述指標物質的峰值面積值（Area）、或所述指標物質的峰值面積值（Area）來算出的培養上清液中的所述指標物質的濃度（Concentration）。進而，亦可使用利用細胞的密集度（Confluency）進行修正（規格化）後的「Area/Confluency」或「Concentration/Confluency」、或者利用細胞數（Cell Number或Cell Count）進行修正後的「Area/Cell Number」或「Concentration/Cell Number」。藉由使用利用細胞的密集度（Confluency）或細胞數（Cell Number或Cell Count）進行修正（規格化）後的值，於所述分化誘導步驟中的富潛能幹細胞與所述對照細胞之間，即便細胞的增殖率存在差異的情況下，亦可於所述細胞間對每單位細胞數的所述指標物質的峰值面積值（Area/Confluency）或所述指標物質的濃度（Concentration/Confluency）進行比較。因此，可以高精度評價細胞的分化狀態。

本發明提供一種自富潛能幹細胞製造視網膜色素上皮細胞的方法，其包括對本發明的富潛能幹細胞的分化狀態進行評價的方法。富潛能幹細胞包含iPS細胞及ES細胞。本發明的製造視網膜色素上皮細胞的方法可於自富潛能幹細胞製造視網膜色素上皮細胞的步驟中，判別向視網膜色素上皮細胞進行分化的細胞、與不分化的細胞。本發明的製造視網膜色素上皮細胞的方法可包括將判斷為不向視網膜色素上皮細胞進行分化的細胞或細胞集團去除的步驟。 實施例

其次，列舉實施例來詳細說明本發明，但本發明的範圍不受該些實施例的限定。 實施例1

〔自人iPS細胞向視網膜色素上皮細胞的分化〕 將人iPS細胞播種到由玻連蛋白（vitronectin）塗佈的組織培養用燒瓶中，使用伊森謝（Essential）8（英傑公司（Invitrogen），註冊商標）作為細胞增殖用培養基，並於5%CO₂ 、37℃下進行培養。培養後7天時，將細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基（TeSR-E6，幹細胞技術公司（STEMCELL Technologies）），進而於5%CO₂ 、37℃下進行培養。培養後75天～99天內，利用反射型明視野觀察裝置觀察細胞。培養容器16035（圖1的（A））、17005（圖1的（C））及17010（圖1的（D））的細胞中，觀察到色素沈著，顯示出向視網膜色素上皮細胞進行了分化。但是，儘管於相同條件下進行培養，在培養容器16040（圖1的（B））中，未觀察到色素沈著，顯示出未分化為視網膜色素上皮細胞。 實施例2

〔人iPS細胞的培養上清液中的鳥胺酸及瓜胺酸的測定〕 利用LC-MS對實施例1中所培養的人iPS細胞的培養上清液中的鳥胺酸量及瓜胺酸量進行經時性測定（分別為圖2及圖3）。分析裝置使用LCMS-8050（島津製作所）。於觀察到色素沈著、顯示出向視網膜色素上皮細胞的分化的培養容器16035、17005及17010的細胞的培養上清液中，在將自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天的、第3天至第12天為止的期間內，確認到鳥胺酸存在量的單峰性峰值。另外，在將自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天的、第5天至第15天為止的期間內，確認到瓜胺酸存在量的單峰性峰值。另一方面，於未觀察到色素沈著、顯示出保持未分化的狀態的培養容器16040的細胞的培養上清液中，鳥胺酸存在量的變動少，在將自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天的、至第40天為止的期間內，於鳥胺酸存在量的經時變化中未確認到明確的峰值。培養容器16040的細胞的培養上清液中的瓜胺酸量自將自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天的、第25天附近起有漸增的傾向，但未確認到明確的峰值。

於培養容器16035、17005及17010的細胞中，是在將自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天的、第40天附近觀察到色素沈著，相對於此，是在此之前的、第3天至第12天為止的期間及第5天至第15天為止的期間內分別觀察到鳥胺酸存在量及瓜胺酸存在量的峰值。其結果表示：藉由對培養上清液中的鳥胺酸存在量及/或瓜胺酸存在量進行測定並加以分析，可於藉由色素沈著確認到自iPS細胞向視網膜色素上皮細胞的分化之前，判別進行分化的細胞與不分化的細胞。相反，未賦予鳥胺酸存在量及瓜胺酸存在量的峰值的細胞表示即便繼續進行培養，不分化的可能性亦高。根據該些情況，表示可藉由對培養上清液中的鳥胺酸及/或瓜胺酸的存在量的經時變化進行分析，來預測細胞分化。

將人iPS細胞的培養上清液中的鳥胺酸量及瓜胺酸量的經時性變化以變動係數的形式來加以表示。將其結果分別示於圖4的（A）及圖4的（B）中。另外，將變動係數的數值的一覽表示於圖5中。圖4以及圖5中所示的培養時間（天）是將自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期表示為第0天。關於向視網膜色素上皮細胞進行了分化的培養容器16035、17005及17010的細胞的培養上清液中的鳥胺酸的存在量的變動係數，於鳥胺酸存在量的經時變化中賦予峰值的第0天至第20天為止的期間內的至少第4天至第12天為止的期間中，賦予0.20以上的數值。另一方面，於顯示出保持未分化的狀態的培養容器16040的細胞的培養上清液中，第6天至第20天為止的期間內的變動係數小於0.20。關於向視網膜色素上皮細胞進行了分化的培養容器16035、17005及17010的細胞的培養上清液中的瓜胺酸的存在量的變動係數，於瓜胺酸存在量的經時變化中賦予峰值的第0天至第20天為止的期間內的至少第8天至第12天為止的期間中，賦予0.60以上的數值。另一方面，於顯示出保持未分化的狀態的培養容器16040的細胞的培養上清液中，第8天至第12天為止的期間內的變動係數小於0.30。 實施例3

〔人ES細胞及人iPS細胞的培養上清液中的指標物質的比較〕 將人ES細胞及人iPS細胞播種到由玻連蛋白塗佈的六孔板（6-well plate）（福魯康（FALCON））中，以4 mL/孔添加伊森謝（Essential）8（英傑公司（Invitrogen），註冊商標）作為細胞增殖用培養基，並於5%CO₂ 、37℃下進行培養。於培養後10天以內，每天更換細胞增殖用培養基。於培養後第10天，將培養基更換為不含bFGF（鹼性纖維母細胞生長因子）及TGF-β1（轉化增殖因子-β1）的伊森謝（Essential）6（細胞分化用培養基）（4 mL/孔），於培養後80天以內，每週更換2次細胞分化用培養基，同時於5%CO₂ 、37℃下進行培養。人ES細胞及人iPS細胞的培養上清液中的指標物質的存在量是藉由LC-MS經時性地測定。分析裝置使用LCMS-8050（島津製作所）。將培養開始後的各指標物質的存在量的經時變化示於圖6a至圖6c中：（A）鳥胺酸、（B）瓜胺酸、（C）麩胱甘肽、（D）半胱胺酸、（E）六氫菸鹼酸、（F）腐胺、（G）脯胺酸、（H）2-胺基己二酸、（I）胞苷、（J）脫氧胞苷、（K）腺苷及（L）肌苷。

培養後的人ES細胞於培養後42天附近，細胞形態呈現為多邊形或石板狀，且觀察到色素沈著，藉此確認到向視網膜色素上皮細胞進行分化。另一方面，培養後的人iPS細胞未觀察到色素沈著，判斷為未進行細胞分化。於最終向視網膜色素上皮細胞進行了分化的人ES細胞、與未分化的人iPS細胞的比較中，得知各指標物質的存在量的經時變化的特徵根據指標物質而不同。於人ES細胞中，麩胱甘肽（圖6a的（C））及半胱胺酸（圖6a的（D））的存在量於培養後5天以內急速增加，然後減少。其結果，於培養時間1天～10天時賦予存在量的峰值。尤其是，關於麩胱甘肽，於培養時間1天～10天內，人iPS細胞幾乎未產生麩胱甘肽，與人ES細胞明顯不同。於人ES細胞中，脫氧胞苷（圖6c的（J））的存在量於培養後8天以內急速增加，然後減少。其結果，於培養時間5天～10天時賦予存在量的峰值。脫氧胞苷進而於培養時間20天～30天之間賦予存在量的峰值。關於鳥胺酸（圖6a的（A））及瓜胺酸（圖6a的（B）），得知於人ES細胞中，在培養時間15天～25天時賦予單峰性峰值，但於人iPS細胞中未觀察到峰值，明顯不同。關於六氫菸鹼酸（圖6b的（E）），於人ES細胞中，在培養時間15天～25天時賦予單峰性峰值，但於人iPS細胞中，在培養時間30天～45天時賦予峰值。另外，關於腐胺（圖6b的（F））及2-胺基己二酸（圖6b的（H）），於人ES細胞中，在培養時間15天～30天時賦予單峰性峰值，但同期的人iPS細胞中的腐胺的存在量低，並且未顯示出明確的峰值。關於胞苷（圖6c的（I）），於人ES細胞中，在培養時間20天～35天時賦予明瞭的單峰性峰值。於人iPS細胞中，雖亦確認到峰值狀的胞苷存在量的增加，但與人ES細胞的情況相比，是峰值高度為四分之一左右的小峰值。該些指標物質的存在量的經時變化的特徵為藉由色素沈著確認到人ES細胞向視網膜色素上皮細胞的分化之前的變化，藉由對該些指標物質進行測定，可預先判別是否進行分化。進而，藉由將多種該些指標物質組合，可提高是否進行分化的預測精度。於未向視網膜色素上皮細胞進行分化的人iPS細胞中，未觀察到向視網膜色素上皮細胞進行了分化的人ES細胞中的、所述各指標物質的存在量的經時變化的特徵。

於培養時間42天附近，確認到培養後的人ES細胞向視網膜色素上皮細胞的分化。於該培養時間以後，發現顯示出存在量的特徵性經時變化的指標物質。關於腺苷（圖6c的（K））及肌苷（圖6c的（L）），於人ES細胞中，在確認到分化的培養時間42天以後，與人iPS細胞相比穩定地顯示出高值。另一方面，關於脯胺酸（圖6b的（G）），於人ES細胞中，在培養時間20天以後，顯示出存在量的降低傾向。尤其是，於確認到分化的培養時間42天以後，成為不含細胞的培養基（空白）中的存在量水準以下。該些指標物質的特徵性經時變化由於在未向視網膜色素上皮細胞進行分化的人ES細胞中未觀察到，因此可用於確認人ES細胞向視網膜色素上皮細胞進行了分化。

無

圖1是將人iPS細胞於A（16035）、B（16040）、C（17005）及D（17010）的獨立的培養容器中培養75天（A）、76天（B）、99天（C）及91天（D），並利用反射型明視野觀察裝置進行拍攝的圖。於A、C及D中，觀察到色素沈著（表示為「Good（良好）（=有色素沈著（Pigmentation））」，且觀察到向視網膜色素上皮細胞的分化（未顯示結果）。於B中，未觀察到色素沈著（表示為「Bad（差）（=無色素沈著）」，且未觀察到向視網膜色素上皮細胞的分化。 圖2是表示將人iPS細胞於獨立的培養容器（16035、16040、17005及17010）中加以培養，並對各培養容器中的鳥胺酸的存在量進行測定而得的結果。培養容器16035、16040、17005及17010與圖1中所示的培養容器相同。於最終觀察到色素沈著的培養容器16035、17005及17010的iPS細胞中，在將自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天的、第3天至第12天為止的期間內，確認到鳥胺酸的存在量顯著增加，但於該期間內未觀察到色素沈著。於16040中，未確認到鳥胺酸的存在量顯著增加。 圖3是表示將人iPS細胞於獨立的培養容器（16035、16040、17005及17010）中加以培養，並對各培養容器中的瓜胺酸的存在量進行測定而得的結果。培養容器16035、16040、17005及17010與圖1中所示的培養容器相同。於最終觀察到色素沈著的培養容器16035、17005及17010的iPS細胞中，在將自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天的、第5天至第12天為止的期間內，確認到瓜胺酸的存在量顯著增加，但於該期間內未觀察到色素沈著。於16040中，未確認到瓜胺酸的存在量顯著增加。 圖4是將人iPS細胞的鳥胺酸（A）及瓜胺酸（B）產生量的經時性變化以變動係數的形式加以表示的圖。將iPS細胞於獨立的培養容器（16035、16040、17005及17010）中加以培養，並對各培養容器中的鳥胺酸（A）及瓜胺酸（B）的存在量進行測定。培養容器16035、16040、17005及17010與圖1中所示的培養容器相同。變動係數是將細胞的培養期間中的鳥胺酸或瓜胺酸的存在量的測定次數設為資料數，並基於各次測定的存在量的平均值及標準偏差來算出。 圖5是針對每一培養容器而以數值形式表示圖4所示的鳥胺酸及瓜胺酸的存在量的變動係數的圖。 圖6a是表示對人ES細胞及人iPS細胞進行培養並對培養上清液中的指標物質的存在量進行測定而得的結果的圖。（A）為鳥胺酸的測定結果、（B）為瓜胺酸的測定結果、（C）為麩胱甘肽的測定結果及（D）為半胱胺酸的測定結果。觀察到所使用的人ES細胞向視網膜色素上皮細胞的分化，但人iPS細胞未分化。僅是不含細胞的培養基（空白）的情況下，幾乎未觀察到培養上清液中的指標物質的存在量的經時性變化。 圖6b是表示對人ES細胞及人iPS細胞進行培養並對培養上清液中的指標物質的存在量進行測定而得的結果的圖。（E）為六氫菸鹼酸的測定結果、（F）為腐胺的測定結果、（G）為脯胺酸的測定結果及（H）為2-胺基己二酸的測定結果。觀察到所使用的人ES細胞向視網膜色素上皮細胞的分化，但人iPS細胞未分化。僅是不含細胞的培養基（空白）的情況下，幾乎未觀察到培養上清液中的指標物質的存在量的經時性變化。 圖6c是表示對人ES細胞及人iPS細胞進行培養並對培養上清液中的指標物質的存在量進行測定而得的結果的圖。（I）為胞苷的測定結果、（J）為脫氧胞苷的測定結果、（K）為腺苷的測定結果及（L）為肌苷的測定結果。觀察到所使用的人ES細胞向視網膜色素上皮細胞的分化，但人iPS細胞未分化。僅是不含細胞的培養基（空白）的情況下，幾乎未觀察到培養上清液中的指標物質的存在量的經時性變化。

Claims (23)

1. 一種方法，其是在自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中，對所述富潛能幹細胞的分化狀態進行評價的方法，包括： 步驟1：對富潛能幹細胞的培養上清液中的指標物質存在量進行測定的步驟；以及 步驟2：基於所述指標物質存在量的變化，對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價的步驟， 所述指標物質為鳥胺酸及/或瓜胺酸。
2. 如請求項1所述的方法，其中於所述步驟2中，藉由對培養上清液中的所述指標物質存在量的經時變化進行分析，來評價富潛能幹細胞的分化狀態。
3. 如請求項2所述的方法，其中將所述富潛能幹細胞的培養基自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天時，對所述經時變化進行分析的期間為第0天至第20天為止的期間。
4. 如請求項2所述的方法，其中將所述富潛能幹細胞的培養基自細胞增殖用培養基置換為細胞分化用培養基的日期設為第0天時，對所述經時變化進行分析的期間為第3天至第12天為止的期間。
5. 如請求項2至請求項4中任一項所述的方法，其中所述經時變化判定為大的情況下，評價為進行自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞分化的可能性高。
6. 如請求項1所述的方法，其中於所述步驟1中，對作為所述指標物質的鳥胺酸及瓜胺酸存在量進行測定，且於鳥胺酸及瓜胺酸存在量的經時變化實質上相同的情況下，評價為進行自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞分化。
7. 如請求項2至請求項4中任一項所述的方法，其中於所述步驟2中，基於與所述指標物質存在量相關的變動係數的閾值，對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價。
8. 如請求項7所述的方法，其中於所述變動係數的閾值與鳥胺酸存在量相關而為0.20以上及/或與瓜胺酸存在量相關而為0.30以上的情況下，評價為進行自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞分化。
9. 如請求項1所述的方法，其進而包括： 步驟3：對已知細胞分化狀態的對照細胞的培養上清液中的指標物質存在量進行測定的步驟，並且 藉由對所述步驟1中進行測定的所述富潛能幹細胞的培養上清液中的所述指標物質存在量、與所述步驟3中進行測定或已測定的所述對照細胞的培養上清液中的所述指標物質存在量進行比較，來對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價。
10. 如請求項9所述的方法，其中基於所述富潛能幹細胞的培養上清液中的所述指標物質存在量、與所述對照細胞的培養上清液中的所述指標物質存在量的比或差是否為預先規定的閾值以上、或者是否小於閾值，對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價。
11. 如請求項9所述的方法，其中藉由對所述富潛能幹細胞的培養上清液中的指標物質存在量的經時變化、與所述對照細胞的培養上清液中的指標物質存在量的經時變化進行比較，來對自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價。
12. 如請求項9至請求項11中任一項所述的方法，其中所述對照細胞為於自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中維持未分化的狀態的細胞。
13. 如請求項1所述的方法，其進而包括： 步驟4：將於自富潛能幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中確認到細胞的分化的細胞設為對照細胞，並預先對所述對照細胞的培養上清液中的指標物質存在量進行測定，並且 藉由對所述富潛能幹細胞的培養上清液中的指標物質存在量、與所述對照細胞的培養上清液中的所述指標物質存在量進行比較，來評價細胞的分化狀態。
14. 如請求項13所述的方法，其中基於根據所述對照細胞的培養上清液中的指標物質存在量而規定的閾值，評價細胞的分化狀態。
15. 如請求項1至請求項4中任一項所述的方法，其中所述富潛能幹細胞為誘導性富潛能幹細胞或胚胎幹細胞。
16. 如請求項1至請求項4中任一項所述的方法，其中利用質譜法對所述指標物質存在量進行測定。
17. 一種自富潛能幹細胞製造視網膜色素上皮細胞的方法，其使用如請求項1至請求項16中任一項所述的方法。
18. 一種方法，其是在自胚胎幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中，對所述胚胎幹細胞的分化狀態進行評價的方法，包括： 步驟1：對胚胎幹細胞的培養上清液中的指標物質存在量進行測定的步驟；以及 步驟2：基於所述指標物質存在量的變化，對自胚胎幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價的步驟， 所述指標物質為選自由麩胱甘肽、鳥胺酸、瓜胺酸、半胱胺酸、六氫菸鹼酸、腐胺、脯胺酸、2-胺基己二酸、胞苷、脫氧胞苷、腺苷及肌苷所組成的群組中的至少一種。
19. 一種方法，其是在自胚胎幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中，對所述胚胎幹細胞的分化狀態進行評價的方法，包括： 步驟1：對胚胎幹細胞的培養上清液中的指標物質存在量進行測定的步驟；以及 步驟2：基於所述指標物質存在量的變化，對自胚胎幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價的步驟， 所述指標物質為選自由麩胱甘肽、鳥胺酸、瓜胺酸、六氫菸鹼酸、2-胺基己二酸、胞苷及脫氧胞苷所組成的群組中的至少一種。
20. 一種方法，其是在自胚胎幹細胞向視網膜色素上皮細胞的分化誘導步驟中，對所述胚胎幹細胞的分化狀態進行評價的方法，包括： 步驟1：對胚胎幹細胞的培養上清液中的指標物質存在量進行測定的步驟；以及 步驟2：基於所述指標物質存在量的變化，對自胚胎幹細胞向視網膜色素上皮細胞的細胞的分化狀態進行評價的步驟， 所述指標物質為腺苷及/或肌苷。
21. 如請求項18至請求項20中任一項所述的方法，其中於所述步驟2中，藉由對培養上清液中的所述指標物質存在量的經時變化進行分析，來評價所述胚胎幹細胞的分化狀態。
22. 如請求項18至請求項20中任一項所述的方法，其中利用質譜法對所述指標物質存在量進行測定。
23. 一種自胚胎幹細胞製造視網膜色素上皮細胞的方法，其使用如請求項18至請求項22中任一項所述的方法。

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