JP7344421B2

JP7344421B2 - 細胞の分化状態の評価方法

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Publication number: JP7344421B2
Application number: JP2021534873A
Authority: JP
Inventors: 圭祐原; 慎一五味; 智久永田; 健一加川; 康弘大島; 崇鈴木; 雅俊高橋; 貴子山本; 伸川真田
Original assignee: Shimadzu Corp; Tokyo Electron Ltd
Current assignee: Shimadzu Corp; Tokyo Electron Ltd
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2023-09-14
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: EP4001425A4; US20220260580A1; TW202117019A; WO2021014515A1; CN114450418A; JPWO2021014515A1; EP4001425A1

Description

本発明は、ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程における、細胞の分化状態を評価する方法に関する。本発明はさらに、ヒト胚性幹細胞（ES細胞）から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程における、細胞の分化状態を評価する方法に関する。

加齢黄斑変性症は、網膜の中心にある黄斑部の機能が低下する疾患であり、先進国における高齢者の失明原因の主たる疾患の一つである。加齢黄斑変性には、滲出型および萎縮型がある。網膜色素上皮（RPE、Retinal Pigment Epithelium）細胞は、黄斑のある網膜の外側に存在するシート状の単層細胞層を形成しており、網膜の視細胞を維持するために重要である。RPE細胞層のさらに外側には、血管に富む脈絡膜が存在する。正常な視力を得るためには、網膜の外側にあるRPE細胞および脈絡膜が正常に機能する必要がある。滲出型加齢黄斑変性は、加齢によるRPE細胞の機能低下や損傷などにより、脈絡膜からの異常な新生血管が網膜色素上皮を貫いて網膜下に形成され、網膜下での出血や血液成分の漏出などにより視細胞の機能が障害される疾患である。萎縮型加齢黄斑変性は、老化によりRPE細胞に炎症が生じ、RPE細胞と共にその上部にある視細胞が失われ、視力が障害される疾患である。

滲出型加齢黄斑変性の治療として、新生血管を抑制することを目的として、抗VEGF（vascular endothelial cell growth factor）抗体などのVEGF阻害薬の眼内注射が行われる。しかしながら、抗VEGF抗体の治療効果は持続時間が短いため、再発する症例が多い。萎縮型加齢黄斑変性に対しては、有効な治療法がまだ得られていない。滲出型および萎縮型加齢黄斑変性のいずれについても、RPE細胞の機能低下や損傷に起因すると考えられることから、多能性幹細胞であるES細胞またはiPS細胞からRPE細胞を分化誘導し、新生血管除去後に網膜に移植する治療が試みられている。このために、ES細胞またはiPS細胞からRPE細胞に分化誘導する方法、および分化したRPE細胞からシート状の網膜色素上皮を作製する方法が開発されている（特許文献１、非特許文献１および非特許文献２）。

ヒトiPS細胞由来RPE細胞を移植する臨床研究において、どのようなRPE細胞が高い移植効果を示すかは十分に解明されていない。一方で、RPE細胞の色素（メラニン）量は、細胞の成熟度とよく相関するため、色素沈着の観察または色素量の測定により、移植に適したRPE細胞を選別する方法が提案されている（非特許文献３）。しかしながら、色素量の測定は、iPS細胞からRPE細胞への分化が進み、RPE細胞が成熟した後で可能になるため、色素が沈着する前の段階で、移植に適する可能性の高いRPE細胞を選別することは困難である。多能性幹細胞からRPE細胞への分化誘導には、通常、数十日という長期間の培養が必要である（非特許文献４および５）。このため、分化したRPE細胞が得られるかどうかを培養中に予測することは、RPE細胞の移植を準備する上で重要である。非特許文献５は、ES細胞からRPE細胞へ分化する可能性のある前駆細胞のマーカーとして、OTX1およびOTX2を報告している。しかしながら、OTX1またはOTX2発現量を測定するためには、細胞を破砕または溶解するという、細胞に対する侵襲的な処理が必要となり、移植を予定する細胞を評価対象とすることができない。

ＷＯ２０１４／０３０７４９

Hirami Y, Osakada F, Takahashi K, et al. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 2009;458:126-131. Kamao H, Mandai M, Okamoto S, et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports 2014;2:205-218. Kamao H, Mandai M, Wakamiya S, et al. Objective evaluation of the degree of pigmentation in human induced pluripotent stem cell-derived RPE. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55:8309-8318. Lane A, Philip LR, Ruban L, et al. Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2014;3:1295-1304. Vugler A, Carr AJ, Lawrence J, et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 2008;214:347-361.

ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）またはヒト胚性幹細胞（ES細胞）から網膜色素上皮細胞（RPE細胞）へ分化させる工程において、同一の培養条件下であった場合でも、成熟したRPE細胞へと分化する細胞と分化しないままの細胞とが得られる。本発明の目的は、細胞の成熟度の指標となる色素沈着が観察される前に、細胞に対して非侵襲的な評価を行うことにより、多能性幹細胞からRPE細胞へ分化する細胞と分化しない細胞とを、早期に判別する方法を提供することである。

すなわち、本発明の目的は、以下の発明により達成される。
〔１〕
多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程における、該多能性幹細胞の分化状態を評価する方法であって、
（１）多能性幹細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する工程、および、
（２）前記指標物質の存在量の変化に基づいて、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する工程、を含み、
前記指標物質が、オルニチンおよび／またはシトルリンであり、
前記工程（２）において、色素沈着が観察されるようになる前の期間に培養上清における前記指標物質の存在量の経時変化を解析することにより、多能性幹細胞の分化状態を評価し、
前記経時変化が大きいと判定される場合に、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行する可能性が高いと評価する、方法。
〔２〕
前記経時変化を解析する期間が、前記多能性幹細胞の培地を細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第0日から第20日までの期間である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記経時変化を解析する期間が、前記多能性幹細胞の培地を細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第3日から第12日までの期間である、〔１〕に記載の方法。
〔４〕
前記工程（１）において、前記指標物質としてオルニチンおよびシトルリンの存在量を測定し、オルニチンおよびシトルリンの存在量の経時変化が実質的に同一である場合に、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行すると評価する、〔１〕に記載の方法。
〔５〕
前記工程（２）において、前記指標物質の存在量に関する変動係数の閾値に基づいて、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕
前記変動係数の閾値が、オルニチンの存在量に関して0.20以上および／またはシトルリンの存在量に関して0.30以上の場合に、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行すると評価する、〔５〕に記載の方法。
〔７〕
細胞の分化状態が既知である対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する工程（３）をさらに含み、
前記工程（１）において測定される、前記多能性幹細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記工程（３）において測定される、または測定された、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する、〔１〕に記載の方法。
〔８〕
前記多能性幹細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比または差が、あらかじめ定めた閾値以上であるか、または閾値未満であるかに基づいて、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する、〔７〕に記載の方法。
〔９〕
前記多能性幹細胞の培養上清における指標物質の存在量の経時変化と、前記対照細胞の培養上清における指標物質の存在量の経時変化とを比較することにより、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する、〔７〕に記載の方法。
〔１０〕
前記対照細胞が、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程において、未分化な状態が維持された細胞である、〔７〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕
多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程において、細胞の分化が確認された細胞を対照細胞として、当該対照細胞の培養上清における指標物質の存在量をあらかじめ測定する工程（４）をさらに含み、
前多能性幹細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、細胞の分化状態を評価する、〔１〕に記載の方法。
〔１２〕
前記対照細胞の培養上清における指標物質の存在量に基づき定められる閾値に基づき、細胞の分化状態を評価する、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（iPS細胞）または胚性幹細胞（ES細胞）である、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕
前記指標物質の存在量を質量分析法により測定する、〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕
〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法を用いる、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を製造する方法。
〔１６〕
胚性幹細胞（ES細胞）から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程における、該ES細胞の分化状態を評価する方法であって、
（１）ES細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する工程、および、
（２）前記指標物質の存在量の変化に基づいて、ES細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する工程、を含み、
前記指標物質が、グルタチオン、オルニチン、シトルリン、システイン、ピペコリン酸、プトレシン、2-アミノアジピン酸、シチジンおよびデオキシシチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
前記工程（２）において、色素沈着が観察されるようになる前の期間に培養上清における前記指標物質の存在量の経時変化を解析することにより、前記ES細胞の分化状態を評価し、
前記経時変化が大きいと判定される場合に、ES細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行する可能性が高いと評価する、方法。
〔１７〕
前記指標物質が、グルタチオン、オルニチン、シトルリン、ピペコリン酸、2-アミノアジピン酸、シチジンおよびデオキシシチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕
胚性幹細胞（ES細胞）から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程における、該ES細胞の分化状態を評価する方法であって、
（１）ES細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する工程、および、
（２）前記指標物質の存在量の変化に基づいて、ES細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する工程、を含み、
前記指標物質が、プロリン、アデノシンおよびイノシンからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
前記工程（２）において、培養上清における前記指標物質の存在量の経時変化を解析することにより、ES細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化の進行状態を評価する、方法。
〔１９〕
前記指標物質の存在量を質量分析法により測定する、〔１６〕～〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕
〔１６〕～〔１９〕のいずれかに記載の方法を用いる、ES細胞から網膜色素上皮細胞を製造する方法。

本発明によれば、多能性幹細胞である人工多能性幹細胞（iPS細胞）または胚性幹細胞（ES細胞）から網膜色素上皮細胞（RPE細胞）へ分化させる過程において、成熟したRPE細胞へと分化したことの指標となる色素（メラニン）沈着が生じる前に、培養上清中の指標物質を測定することにより、RPE細胞へ分化する細胞と分化しない細胞とを、早期に判別することができる。多能性幹細胞からRPE細胞への分化誘導には長時間の培養が必要であるが、分化の成否を早期に判別できることにより、分化しないために移植に使用することができない細胞を早期に除外することができる。これは、不要な培養コストと培養のための労力と時間の削減につながる。さらに、本発明の方法は、細胞を破砕または溶解するという、細胞に対する侵襲的な処理は必要ではなく、細胞上清中の指標物質を測定するため、細胞に対して非侵襲的であり、実際に移植を予定する細胞そのものについて、分化誘導の成否を事前に評価することができる。このため、RPE細胞の移植準備を円滑に行うことができる。

ヒトiPS細胞を、Ａ（16035）、Ｂ（16040）、Ｃ（17005）およびＤ（17010）の独立した培養容器で75日間（Ａ）、76日間（Ｂ）、99日間（Ｃ）および91日間（Ｄ）培養し、反射型明視野観察装置により撮影した図である。Ａ、ＣおよびＤでは、色素沈着が観察され（「Good(=Pigmentationあり)」と表示）、網膜色素上皮細胞への分化が観察された（結果は示さず）。Ｂでは色素沈着が観察されず（「Bad(=Pigmentationなし)」と表示）、網膜色素上皮細胞への分化は観察されなかった。ヒトiPS細胞を、独立した培養容器（16035、16040、17005および17010）で培養し、それぞれの培養容器におけるオルニチンの存在量を測定した結果を示す。培養容器16035、16040、17005および17010は、図１で示した培養容器と同一である。最終的に色素沈着が観察された培養容器16035、17005および17010のiPS細胞では、細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第3日から第12日までの期間でオルニチンの存在量の顕著な増加が確認されたが、その期間における色素沈着は観察されなかった。16040では、オルニチンの存在量の顕著な増加は認められなかった。ヒトiPS細胞を、独立した培養容器（16035、16040、17005および17010）で培養し、それぞれの培養容器におけるシトルリンの存在量を測定した結果を示す。培養容器16035、16040、17005および17010は、図１で示した培養容器と同一である。最終的に色素沈着が観察された培養容器16035、17005および17010のiPS細胞では、細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第5日から第12日までの期間でシトルリンの存在量の顕著な増加が確認されたが、その期間における色素沈着は観察されなかった。16040では、シトルリンの存在量の顕著な増加は認められなかった。ヒトiPS細胞のオルニチン（Ａ）およびシトルリン（Ｂ）産生量の経時的な変化を、変動係数として表示した図である。iPS細胞を、独立した培養容器（16035、16040、17005および17010）で培養し、それぞれの培養容器におけるオルニチン（Ａ）およびシトルリン（Ｂ）の存在量を測定した。培養容器16035、16040、17005および17010は、図１で示した培養容器と同一である。変動係数は、細胞の培養期間中のオルニチンまたはシトルリンの存在量の測定回数をデータ数とし、各回において測定された存在量の平均値および標準偏差に基づいて算出した。図４で示されるオルニチンおよびシトルリンの存在量の変動係数を、培養容器ごとに数値で示した図である。ヒトES細胞およびヒトiPS細胞を培養し、培養上清中の指標物質の存在量を測定した結果を示す図である。（Ａ）オルニチン、（Ｂ）シトルリン、（Ｃ）グルタチオンおよび（Ｄ）システインの測定結果である。使用したヒトES細胞は、網膜色素上皮細胞への分化が観察されたが、ヒトiPS細胞は分化しなかった。細胞を含まない培地のみ（ブランク）の場合、培養上清中の指標物質の存在量の経時的変化はほとんど観察されなかった。ヒトES細胞およびヒトiPS細胞を培養し、培養上清中の指標物質の存在量を測定した結果を示す図である。（Ｅ）ピペコリン酸、（Ｆ）プトレシン、（Ｇ）プロリンおよび（Ｈ）2-アミノアジピン酸の測定結果である。使用したヒトES細胞は、網膜色素上皮細胞への分化が観察されたが、ヒトiPS細胞は分化しなかった。細胞を含まない培地のみ（ブランク）の場合、培養上清中の指標物質の存在量の経時的変化はほとんど観察されなかった。ヒトES細胞およびヒトiPS細胞を培養し、培養上清中の指標物質の存在量を測定した結果を示す図である。（Ｉ）シチジン、（Ｊ）デオキシシチジン、（Ｋ）アデノシンおよび（Ｌ）イノシンの測定結果である。使用したヒトES細胞は、網膜色素上皮細胞への分化が観察されたが、ヒトiPS細胞は分化しなかった。細胞を含まない培地のみ（ブランク）の場合、培養上清中の指標物質の存在量の経時的変化はほとんど観察されなかった。

本発明は、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程における該多能性幹細胞の分化状態を評価する方法を提供する。該方法は、（１）多能性幹細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する工程、および（２）前記指標物質の存在量に基づいて、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する工程を含む。また前記指標物質は、オルニチンおよび／またはシトルリンである。

本発明はさらに、胚性幹細胞（ES細胞）から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程における、該ES細胞の分化状態を評価する方法を提供する。該方法は、（１）ES細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する工程、および（２）前記指標物質の存在量の変化に基づいて、ES細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する工程を含む。また前記指標物質は、グルタチオン、システイン、デオキシシチジン、2-アミノアジピン酸、シトルリン、ピペコリン酸、プトレシン、オルニチン、シチジン、アデノシン、イノシンおよびプロリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である。前記指標物質を、グルタチオン、デオキシシチジン、2-アミノアジピン酸、シトルリン、ピペコリン酸、オルニチンおよびシチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種とすることもできる。

本発明の分化誘導工程において、網膜色素上皮細胞は、多能性幹細胞から作製される。多能性幹細胞としては、未分化細胞であるiPS細胞（Induced Pluripotent Stem cells）またはES細胞（Embryonic Stem cells）を使用することができる。iPS細胞は、人工の幹細胞であり、核酸、タンパク質または低分子化合物等である特定の多能性誘導因子を体細胞に導入することにより作製することができる（Takahashi K. Yamanaka D. Cell, 2006;126:663-676、Takahashi K. et al. Cell, 2007;131:861-872、WO2007/069666）。ES細胞は、哺乳動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取り出し、この内部細胞塊を培養することにより作製することができる（Suemori H. et al. Biochem Biophys Res Commun. 2006;345:926-932）。iPS細胞およびES細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスターおよびモルモットなどに由来する細胞を使用することができるが、好ましくはヒト由来の細胞である。

多能性幹細胞であるiPS細胞またはES細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程では、前記幹細胞を、まず細胞増殖用培地で培養し、次に、細胞分化用培地に置き換えて培養する。前記幹細胞を網膜色素上皮細胞に分化させる培養条件および培地は、当業者に公知の培養条件および培地を用いることができるが、当業者が適切に改変することもできる。市販の培地を使用してもよく、細胞増殖用培地としては、例えば、Essential 8（登録商標）培地が挙げられ、細胞分化用培地としては、例えば、Essential 6（登録商標）培地が挙げられる。

iPS細胞またはES細胞から網膜色素上皮細胞への分化を確認する方法としては、いくつか報告されている（厚生労働省医薬食品局審査管理課薬食機発０５２９第１号（平成２５年５月２９日）別添１「自己iPS 細胞由来網膜色素上皮細胞に関する評価指標」）。例えば、位相差顕微鏡観察等により、網膜色素上皮細胞特有の茶褐色の色素（メラニン）沈着または多角形もしくは敷石状細胞形態などの存在を観察することにより、網膜色素上皮細胞への分化を確認することができる。また、網膜色素上皮細胞に特徴的な遺伝子の発現を確認することにより、網膜色素上皮細胞への分化を確認することができる。網膜色素上皮細胞に特徴的な遺伝子としては、RPE65、CRALBP、MERTKおよびBEST1などが挙げられる。iPS細胞またはES細胞（未分化細胞）の混在については、未分化マーカーであるOct3/4、SoxおよびTRA-1-60などの免疫染色による解析、または未分化マーカー遺伝子（OCT3/4、NanogおよびLin28など）の測定により評価することができる。

本発明の方法は、多能性幹細胞であるiPS細胞またはES細胞から網膜色素上皮細胞への分化が確認される前に、分化する細胞または細胞集団を早期に判別することができる。その目的のために、本発明の工程（１）において、iPS細胞またはES細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する。指標物質とは、iPS細胞またはES細胞における代謝産物として培養上清中に放出される化合物または分化用培地に含まれる培地成分であり、アミノ酸の一種であるオルニチン（ornithine）およびシトルリン（citrulline）が好ましい。ES細胞については、ES細胞から網膜色素上皮細胞へ分化する細胞または細胞集団を早期に判別するための指標物質として、オルニチンおよびシトルリンに加えて、さらに、グルタチオン（glutathione）、システイン（cysteine）、ピペコリン酸（pipecolic acid）、プトレシン（putrescine）、プロリン（proline）、2-アミノアジピン酸（2-aminoadipic acid）、シチジン（cytidine）、デオキシシチジン（deoxycytidine）、アデノシン（adenosine）およびイノシン（inosine）を選択することができる。これらは、単独で、または２種以上を組み合わせて、細胞の分化状態を評価することができる。

本発明の工程（２）は、本発明の工程（１）において測定した、多能性幹細胞の培養上清における前記指標物質の存在量に基づき、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する工程である。本発明の一実施態様において、前記指標物質の存在量の経時変化を解析することにより、多能性幹細胞の分化状態を評価する。指標物質の存在量の経時変化とは、多能性幹細胞の培養時間の経過に伴う培養上清中の指標物質量の変化である。培養上清中の指標物質量は、培養液中の指標物質の濃度または絶対量、単位細胞数当たりの指標物質量および培養容器当たりの総指標物質量などで表示することができるが、これらに限定されない。培養上清における指標物質の存在量の経時変化を解析することには、指標物質の存在量の経時変化のグラフまたはプロファイルにおいて、存在量の一過性もしくは持続性の増加または減少を検出することが含まれる。培養上清における指標物質の存在量の一過性もしくは持続性の増加または減少は、存在量の経時変化のグラフまたはプロファイルの基線（ベースライン）からの変動として認識される。

本発明の一実施態様において、培養上清におけるオルニチンおよび／またはシトルリンの存在量の経時変化を解析する期間は、多能性幹細胞の培地を、細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第0日から第20日までの期間であることが好ましい。経時変化の解析は、この期間の全域で行ってもよいが、変化が観察される限りにおいては、より短期間で、例えば、第3日から第12日で解析してもよい。オルニチンの存在量の場合には、第4日から第12日のまでの期間で解析してもよく、またシトルリンの存在量の場合には、第8日から第12日のまでの期間で解析してもよい。通常、細胞増殖用培地から細胞分化用培地への置換は、好ましくは細胞増殖用培地で7日～10日間培養後に行われるが、細胞の増殖の程度に応じて日数は増減される。

本発明の一実施態様において、多能性幹細胞の培養上清におけるオルニチンまたはシトルリンの存在量の経時変化が大きいと判定される場合、該多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行する可能性が高いと評価される。前記経時変化が大きいと判定される場合とは、オルニチンもしくはシトルリンの存在量の経時変化のグラフもしくはプロファイルの基線（ベースライン）からの変動または乖離が大きく、オルニチンまたはシトルリンの存在量が急速に増加し、その後減少する状態を指す。その結果、オルニチンまたはシトルリンの存在量の経時変化において、明確なピークが観察される。当業者であれば、経時変化のグラフまたはプロファイルを参照することにより、該ピークを容易に認識することができる。経時変化における該ピークは、一峰性ピークであってもよく、または多峰性ピークであってもよい。

多能性幹細胞であるiPS細胞またはES細胞が網膜色素上皮細胞へと分化し、分化したことの指標である色素沈着が生じるには、通常、30～50日程度の培養時間が必要である。一方、培養上清におけるオルニチンまたはシトルリンの存在量の経時変化におけるピークは、細胞における色素沈着が生じる時期より以前に観察される。該ピークが観察された培養細胞は、その後に培養を継続することにより網膜色素上皮細胞への分化指標である色素沈着が生じるため、該ピークが観察された時点で、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行する可能性が高いと評価される。

本発明の一実施態様において、多能性幹細胞の培養上清におけるオルニチンおよびシトルリンの存在量の経時変化が実質的に同一である場合に、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行すると評価される。オルニチンおよびシトルリンの存在量の経時変化の両方に基づいて評価するため、オルニチンまたはシトルリンの存在量の経時変化のどちらかを単独で使用して評価する場合に比較して、評価結果の信頼性が向上する。培養上清におけるオルニチンおよびシトルリンの存在量の経時変化が実質的に同一であるとは、該経時変化が以下の二つの条件を満たす場合を意味する。該条件とは、（１）オルニチンおよびシトルリンの存在量の経時変化において観察されるピークが、培養時間の経過に伴って存在量が増加し、その後減少するという形状のピークであることにおいて共通する；（２）前記ピークが多峰性であっても、存在量が最も高い主ピークが得られる培養時間がほぼ共通する。ほぼ共通するとは、オルニチンおよびシトルリンとの間で主ピーク位置を与える培養時間の相違が、5日以内、好ましくは3日以内、より好ましくは1日以内である。

本発明の一実施態様において、指標物質であるオルニチンおよび／またはシトルリンの存在量に関する変動係数の閾値に基づいて、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態が評価される。前記変動係数は、前記存在量の標準偏差を、前記存在量の平均値で割ることにより算出する。すなわち、多能性幹細胞の培養期間中であって、指標物質の存在量の測定回数をデータ数とし、各回において測定された存在量の平均値を算出する。次に、各回における測定された存在量の値と前記存在量の平均値の差の二乗の合計値を、前記データ数で割った値の正の正方根を、標準偏差として算出する。このようにして算出された標準偏差を、前記存在量の平均値で割ることにより、変動係数が算出される。変動係数はデータのばらつきの大きさの比率であり、前記変動係数が大きいほど、培養期間中に測定された指標物質の存在量の変動が大きいことが示され、逆に前記変動係数が小さいと、培養期間中に測定された指標物質の存在量の変動が小さいことが示される。

本発明の一実施態様において、前記変動係数の閾値が、オルニチンの存在量について0.20以上、好ましくは0.25以上および／またはシトルリンの存在量について0.30以上の場合に、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行すると評価される。すなわち、培養上清中のオルニチンおよび／またはシトルリンの存在量が、培養期間中に一定の変動を示す場合には、前記細胞分化が進行すると評価される。オルニチンおよび／またはシトルリンの存在量に関する変動係数の閾値は、変動係数の算出値と多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化状態との対比から経験的に導かれる値であり、当業者であれば、対比する試験例または試験数に応じて、より適切と推定される閾値を再設定することもできる。前記変動係数を算出するための培養期間は、多能性幹細胞の培地を細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日以降であれば任意に定めることができる。かかる培養期間は、多能性幹細胞の培地を、細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、好ましくは第0日から第20日までの期間であり、より好ましくは第3日から第12日である。オルニチンの存在量の場合には、かかる培養期間は第4日から第12日のまでの期間がさらに好ましく、またシトルリンの存在量の場合には、第8日から第12日のまでの期間がさらに好ましい。

本発明の一実施態様において、細胞の分化状態が既知である対照細胞の培養上清における指標物質（オルニチンおよび／またはシトルリン）の存在量を測定する工程（３）をさらに含み、本発明の工程（１）において測定される、前記多能性幹細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記工程（３）において測定される、または測定された、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する方法が提供される。対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する前記工程（３）は、前記工程（１）と同時期に実行してもよく、または、前記工程（１）の実行とは独立して、前記工程（１）の実行前に実施してもよい。対照細胞は、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導に供された細胞と同一の細胞株由来の多能性幹細胞でもよく、または分化誘導に供せられた細胞とは異なる多能性幹細胞株由来の細胞であってもよい。細胞の分化状態が既知である対照細胞とは、細胞が未分化の状態であるか、または分化した状態であるかが既知であって、分化状態が培養期間中に変化しない細胞である。未分化の状態は、例えば、Oct3/4、SoxおよびTRA-1-60などの未分化マーカーの存在を免疫染色により、または未分化マーカー遺伝子（OCT3/4、NanogおよびLin28など）の測定により確認することができる。分化した状態は、例えば、網膜色素上皮細胞であれば、茶褐色の色素（メラニン）沈着または多角形もしくは敷石状細胞形態の存在により、またはRPE65、CRALBP、MERTKおよびBEST1などの遺伝子発現を測定することにより確認することができる。

本発明の一実施態様において、前記多能性幹細胞の培養上清における指標物質（オルニチンおよび／またはシトルリン）の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比または差が、あらかじめ定めた閾値以上であるか、または閾値未満であるかに基づいて、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する方法が提供される。前記閾値は、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化が確認された細胞および分化が確認されなかった細胞の培養上清について、細胞培養のサンプル数を増やし、各サンプルにおけるオルニチンおよびシトルリンの存在量を繰り返し測定することにより導くことができる。即ち、前記閾値は、経験的に導かれる値であり、当業者であれば容易に設定することができる。

本発明の一実施態様において、前記多能性幹細胞の培養上清における指標物質（オルニチンおよび／またはシトルリン）の存在量の経時変化と、前記対照細胞の培養上清における指標物質の存在量の経時変化とを比較することにより、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化状態を評価する方法が提供される。指標物質の存在量の経時変化とは、多能性幹細胞および対照細胞のいずれについても、培養時間の経過に伴う培養上清中の指標物質量の変化である。指標物質量は、培養液中の指標物質の濃度または絶対量、単位細胞数当たりの指標物質量および培養容器当たりの総指標物質量などで表示することができるが、これらに限定されない。培養上清における指標物質の存在量の経時変化を比較するとは、指標物質の存在量の経時変化のグラフもしくはプロファイルの類似性または非類似性を把握することである。

本発明の一実施態様において、前記対照細胞として、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程において、未分化な状態が維持された細胞を用いてもよい。多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程において、未分化な状態が維持されたとは、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞へ分化していないことを意味し、色素（メラニン）沈着が観察されず、またはRPE65、CRALBP、MERTKおよびBEST1などの、網膜色素上皮細胞に特徴的な遺伝子の発現が観察されない状態が維持されたことを指す。多能性幹細胞を未分化な状態に維持するには、多能性幹細胞の培地を、細胞分化用培地に置き換えることなく、細胞増殖用培地のままで継代培養することにより達成される。

本発明の一実施態様において、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程において、細胞の分化が確認された細胞を対照細胞として、当該対照細胞の培養上清における指標物質（オルニチンおよび／またはシトルリン）の存在量をあらかじめ測定する工程（４）をさらに含み、前記多能性幹細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、細胞の分化状態を評価する方法が提供される。この方法は、あらかじめ、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化が確認された対照細胞について、培養上清中の前記指標物質の存在量を測定しておき、その測定値を、分化誘導されたことを判別するための参照値または指標とするものである。この方法によれば、前記参照値または指標を基準として、培養している多能性幹細胞が網膜色素上皮細胞へと分化するかどうかを判別することができる。前記多能性幹細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比較は、ある特定の培養時間における存在量の比較で行うことができる。本発明の一実施態様において、前記対照細胞の培養上清における指標物質の存在量に基づき定められる閾値に基づき、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化状態を評価することができる。

本発明の一実施態様において、前記工程（４）において得られる、複数種類の対照細胞の分化状態および該対照細胞の培養上清における指標物質（オルニチンおよび／またはシトルリン）の存在量に関する情報を、対照細胞ごとのライブラリとして記録することができる。このライブラリを使用すれば、前記分化誘導工程にある多能性幹細胞の培養上清における指標物質の存在量を、前記分化誘導工程にある多能性幹細胞と同一の細胞株に対応する前記ライブラリ中の存在量に関する情報と照合することにより、細胞の分化状態を評価することもできる。

前記多能性幹細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比較は、複数の培養時間における存在量の比較、すなわち存在量の経時変化のグラフまたはプロファイルを比較することによっても行われる。複数の培養時間における存在量を比較することにより、分化したかどうかの判別精度が向上するためである。分化したかどうかの判別は、前記グラフまたはプロファイルの類似性に基づいて行うことができる。ここで類似性とは、培養時間の経過に伴うグラフまたはプロファイルの形状が類似することを指す。

本発明において、培養上清における前記指標物質の存在量を定量的に測定する方法としては、ガスクロマトグラフ法（ＧＣ）、液体クロマトグラフ法（ＬＣ）および質量分析法（ＭＳ）などを用いることができる。さらに、液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）およびガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）を、指標物質の定量的な測定に好適に用いることができるが、これらに限定されない。

ＬＣ－ＭＳによる分析は以下のようにして行うことができる。培養上清試料100μLに対して、内部標準として0.5 mMイソプロピルリンゴ酸水溶液20μLを添加し、混合した後、アセトニトリルまたはメタノール200μLを添加して除タンパク質を行う。得られた試料をトミー精工製の遠心機を使用し、15,000 rpmで15分間、室温で遠心分離した後、上清を回収し、超純水（MiLLi-Q（登録商標）水、メルク株式会社）で10倍希釈してＬＣ－ＭＳ分析に供する。ＬＣ－ＭＳ分析では、島津製作所製の「ＬＣ／ＭＳ／メソッドパッケージ細胞培養プロファイリング」（以下「ＭＰ」と略す）に収録された分析条件に従う。ＭＰは、培地に含まれる化合物および細胞から分泌される代謝物をＬＣ－ＭＳにより分析するための分析条件パラメータが集約されたものである。化合物の同定は、ＭＰに登録されている標準品の保持時間と試料中の化合物の保持時間との差が±0.3分以内であること、定量イオンおよび確認イオンの両ピークが検出されていること、ならびに強度値が1000以上であることを基準として行う。化合物の定量は、試料中の各化合物に特徴的なイオン（定量イオン）について、マスクロマトグラムの面積を算出する方法により行う。

ＧＣ－ＭＳによる分析は以下のようにして行うことができる。培養上清試料100μLに対して、内部標準として0.5 mg/mLイソプロピルリンゴ酸水溶液10μLを添加し、混合した後、アセトニトリル200μLを添加して除タンパク質を行う。得られた試料を15,000 rpmで15分間、室温で遠心分離した後、上清100μLを回収し、減圧乾燥する。各試料を、メトキシアミン塩酸塩を含むピリジン溶液中でインキュベートすることにより、試料中の化合物のメトキシム化を行う。さらに、各試料にＭＳＴＦＡ（Ｎ－メチル－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド）を添加して、試料中の化合物をトリメチルシリル化（誘導体化）する。このように誘導体化処理を行った試料を、ＧＣ－ＭＳによる分析に供する。

ＧＣ－ＭＳ分析では、島津製作所製の「Smart Metabolites Database」（以下「ＤＢ」と略す）を使用する。該ＤＢは、上述した誘導体化処理と同様の処理を行った種々の標準品をＧＣ－ＭＳで分析したデータが集約されたものである。化合物の同定は、前記ＤＢで設定された保持指標（保持時間を相対化した数値）と試料中の誘導体化化合物の保持指標との差が±5以内であるか否か、ならびに前記ＤＢで設定された定量イオンおよび確認イオンの両者が、試料中の誘導体化化合物について検出されているか否かを指標に行う。一方、化合物の定量は、前記ＤＢで設定された条件に従い、試料中の各誘導体化化合物に特徴的なイオンについて、マスクロマトグラムの面積を算出する方法により行う。

培養上清における前記指標物質の存在量としては、例えばＧＣ、ＬＣ、ＧＣ－ＭＳまたはＬＣ－ＭＳを用いる場合、これらの測定法における前記指標物質のピーク面積値（Area）、もしくは前記指標物質のピーク面積値（Area）から算出される培養上清における前記指標物質の濃度（Concentration）を用いることができる。さらには、細胞の密集度（Confluency）で補正（規格化）した「Area／Confluency」もしくは「Concentration／Confluency」、または細胞数（Cell NumberもしくはCell Count）で補正した「Area／Cell Number」もしくは「Concentration／Cell Number」を用いてもよい。細胞の密集度（Confluency）または細胞数（Cell NumberもしくはCell Count）で補正（規格化）した値を用いることにより、前記分化誘導工程にある多能性幹細胞と前記対照細胞との間で、細胞の増殖率に差異がある場合であっても、前記細胞間で、細胞数当たりの前記指標物質のピーク面積値（Area／Confluency）または前記指標物質の濃度（Concentration／Confluency）を比較することができる。そのため、細胞の分化状態を高い精度で評価することが可能となる。

本発明は、本発明の多能性幹細胞の分化状態を評価する方法を含む、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を製造する方法を提供する。多能性幹細胞には、iPS細胞およびES細胞が含まれる。本発明の網膜色素上皮細胞を製造する方法は、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を製造する工程において、網膜色素上皮細胞へ分化する細胞と、分化しない細胞を判別することができる。本発明の網膜色素上皮細胞を製造する方法は、網膜色素上皮細胞へ分化しないと判断される細胞または細胞集団を除去する工程を備えることができる。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらよって限定されない。

〔ヒトiPS細胞から網膜色素上皮細胞への分化〕
ヒトiPS細胞を、ビトロネクチンでコーティングした組織培養用フラスコに播種し、細胞増殖用培地としてEssential 8（Invitrogen、登録商標）を用いて5％CO₂、37℃で培養した。培養後7日に、細胞増殖用培地を細胞分化用培地（TeSR-E6、STEMCELL Technologies）に置き換え、さらに5％CO₂、37℃で培養した。培養後75～99日で、細胞を反射型明視野観察装置で観察した。培養容器16035（図１Ａ）、17005（図１Ｃ）および17010（図１Ｄ）の細胞は、色素沈着が観察され、網膜色素上皮細胞へ分化したことが示された。しかしながら、同一条件で培養したにも関わらず、培養容器16040（図１Ｂ）では色素沈着が観察されず、網膜色素上皮細胞に分化しなかったことが示された。

〔ヒトiPS細胞の培養上清中のオルニチンおよびシトルリンの測定〕
実施例１で培養したヒトiPS細胞の培養上清中のオルニチン量およびシトルリン量を、ＬＣ－ＭＳにより経時的に測定した（それぞれ図２および図３）。分析装置はLCMS-8050（島津製作所）を用いた。色素沈着が観察され、網膜色素上皮細胞への分化が示された培養容器16035、17005および17010の細胞の培養上清では、細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第3日から第12日までの期間でオルニチン存在量の一峰性のピークが認められた。また、細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第5日から第15日までの期間でシトルリン存在量の一峰性のピークが認められた。一方、色素沈着が観察されず、未分化のままであることが示された培養容器16040の細胞の培養上清では、オルニチン存在量の変動は少なく、細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第40日までの期間では、オルニチン存在量の経時変化において明確なピークは認められなかった。培養容器16040の細胞の培養上清中のシトルリン量は、細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第25日付近から漸増する傾向があったが、明確なピークは認められなかった。

培養容器16035、17005および17010の細胞において、色素沈着が観察されるようになるのは、細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第40日付近であるのに対し、オルニチン存在量およびシトルリン存在量のピークは、それ以前の、それぞれ第3日から第12日までの期間および第5日から第15日までの期間に観察される。この結果は、培養上清中のオルニチン存在量および／またはシトルリン存在量を測定し、解析することにより、iPS細胞から網膜色素上皮細胞への分化が、色素沈着により確認される以前に、分化する細胞と分化しない細胞とを判別できることを示す。逆に、オルニチン存在量およびシトルリン存在量のピークを与えない細胞は、培養を継続しても分化しない可能性が高いことが示される。これらのことより、培養上清中のオルニチンおよび／またはシトルリンの存在量の経時変化を解析することにより、細胞分化を予測することができることが示される。

ヒトiPS細胞の培養上清中のオルニチン量およびシトルリン量の経時的な変化を、変動係数として表示した。その結果を、それぞれ図４Ａおよび図４Ｂに示した。また、変動係数の数値の一覧を図５に示した。図４Ａおよび図４Ｂならびに図５に示される培養時間（日）は、細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として示される。網膜色素上皮細胞へ分化した培養容器16035、17005および17010の細胞の培養上清におけるオルニチンの存在量の変動係数は、オルニチン存在量の経時変化においてピークを与える第0日から第20日までの期間内における少なくとも第4日から第12日のまでの期間において、0.20以上の数値を与えた。一方、未分化のままであることが示された培養容器16040の細胞の培養上清においては、第6日から第20日までの期間における変動係数は0.20未満であった。網膜色素上皮細胞へ分化した培養容器16035、17005および17010の細胞の培養上清におけるシトルリンの存在量の変動係数は、シトルリン存在量の経時変化においてピークを与える第0日から第20日までの期間内における少なくとも第8日から第12日のまでの期間において、0.60以上の数値を与えた。一方、未分化のままであることが示された培養容器16040の細胞の培養上清においては、第8日から第12日までの期間における変動係数は0.30未満であった。

〔ヒトES細胞およびヒトiPS細胞の培養上清中の指標物質の比較〕
ヒトES細胞およびヒトiPS細胞を、ビトロネクチンでコーティングした6－ウェルプレート（FALCON）に播種し、細胞増殖用培地としてEssential 8（Invitrogen、登録商標）を4 mL／ウェルで添加し、5％CO₂、37℃で培養した。培養後10日まで、細胞増殖用培地を毎日交換した。培養後10日目に、培地を、bFGF（塩基性線維芽細胞成長因子）およびTGF-β1（トランスフォーミング増殖因子-β1）を含まないEssential 6（細胞分化用培地）に交換し（4 mL／ウェル）、培養後80日まで、細胞分化用培地を週に2回交換しながら5％CO₂、37℃で培養した。ヒトES細胞およびヒトiPS細胞の培養上清中の指標物質の存在量は、ＬＣ－ＭＳにより経時的に測定した。分析装置はLCMS-8050（島津製作所）を用いた。培養開始後の各指標物質の存在量の経時変化は図６a～６cに示した：（Ａ）オルニチン、（Ｂ）シトルリン、（Ｃ）グルタチオン、（Ｄ）システイン、（Ｅ）ピペコリン酸、（Ｆ）プトレシン、（Ｇ）プロリン、（Ｈ）2-アミノアジピン酸、（Ｉ）シチジン、（Ｊ）デオキシシチジン、（Ｋ）アデノシンおよび（Ｌ）イノシン。

培養したヒトES細胞は、培養後42日付近で、細胞形態が多角形または敷石状となり、かつ色素沈着が観察されることより、網膜色素上皮細胞へ分化することが確認された。一方、培養したヒトiPS細胞は、色素沈着が観察されず、細胞分化しなかったと判断された。最終的に網膜色素上皮細胞へ分化したヒトES細胞と、分化しなかったヒトiPS細胞との比較において、各指標物質の存在量の経時変化の特徴は、指標物質によって異なることが分かった。ヒトES細胞において、グルタチオン（図６Ｃ）およびシステイン（図６Ｄ）は、培養後5日までに存在量が急速に増加し、その後減少した。その結果、培養時間1～10日に存在量のピークを与えた。特にグルタチオンについては、培養時間1～10日において、ヒトiPS細胞はほとんど産生せず、ヒトES細胞とは大きく異なった。ヒトES細胞において、デオキシシチジン（図６Ｊ）は、培養後8日までに存在量が急速に増加し、その後減少した。その結果、培養時間5～10日に存在量のピークを与えた。デオキシシチジンは、さらに、培養時間20～30日の間に存在量のピークを与えた。オルニチン（図６Ａ）およびシトルリン（図６Ｂ）は、ヒトES細胞において、培養時間15～25日に一峰性のピークを与えたが、ヒトiPS細胞ではピークが観察されず、大きく相違することが分かった。ピペコリン酸（図６Ｅ）は、ヒトES細胞において、培養時間15～25日に一峰性のピークを与えたが、ヒトiPS細胞では、培養時間30～45日にピークを与えた。また、プトレシン（図６Ｆ）および2-アミノアジピン酸（図６Ｈ）は、ヒトES細胞において、培養時間15～30日に一峰性のピークを与えたが、同時期のヒトiPS細胞におけるプトレシンの存在量は低く、また明確なピークを示さなかった。シチジン（図６Ｉ）は、ヒトES細胞において、培養時間20～35日に一峰性の明瞭なピークを与えた。ヒトiPS細胞においても、ピーク様のシチジン存在量の増加が認められたが、ヒトES細胞の場合と比較して、ピーク高さが四分の一程度の小さなピークであった。これらの指標物質の存在量の経時変化の特徴は、ヒトES細胞の網膜色素上皮細胞への分化が、色素沈着により確認される以前の変化であり、これらの指標物質を測定することにより、あらかじめ分化するかどうかの判別が可能となる。さらに、これらの指標物質を複数組み合わせることにより、分化するかどうかの予測精度を向上させることができる。網膜色素上皮細胞へ分化したヒトES細胞における、上述した各指標物質の存在量の経時変化の特徴は、網膜色素上皮細胞へ分化しなかったヒトiPS細胞では観察されなかった。

培養時間42日付近で、培養したヒトES細胞の網膜色素上皮細胞への分化が確認される。この培養時間以降において、存在量の特徴的な経時変化を示す指標物質が見出された。アデノシン（図６Ｋ）およびイノシン（図６Ｌ）は、ヒトES細胞において、分化が確認される培養時間42日以降、ヒトiPS細胞と比較して安定的に高値を示した。一方、プロリン（図６Ｇ）は、ヒトES細胞において、培養時間20日以降、存在量の低下傾向を示した。特に、分化が確認される培養時間42日以降では、細胞を含まない培地（ブランク）における存在量レベル以下となった。これらの指標物質の特徴的な経時変化は、網膜色素上皮細胞へ分化しなかったヒトES細胞では観察されないため、ヒトES細胞が網膜色素上皮細胞へ分化したことを確認するために使用することができる。

Claims

多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程における、該多能性幹細胞の分化状態を評価する方法であって、
（１）多能性幹細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する工程、および、
（２）前記指標物質の存在量の変化に基づいて、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する工程、を含み、
前記指標物質が、オルニチンおよび／またはシトルリンであり、
前記工程（２）において、色素沈着が観察されるようになる前の期間に培養上清における前記指標物質の存在量の経時変化を解析することにより、多能性幹細胞の分化状態を評価し、
前記経時変化が大きいと判定される場合に、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行する可能性が高いと評価する、方法。
前記経時変化を解析する期間が、前記多能性幹細胞の培地を細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第0日から第20日までの期間である、請求項１に記載の方法。
前記経時変化を解析する期間が、前記多能性幹細胞の培地を細胞増殖用培地から細胞分化用培地に置き換えた日を第0日として、第3日から第12日までの期間である、請求項１に記載の方法。
前記工程（１）において、前記指標物質としてオルニチンおよびシトルリンの存在量を測定し、オルニチンおよびシトルリンの存在量の経時変化が実質的に同一である場合に、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行すると評価する、請求項１に記載の方法。
前記工程（２）において、前記指標物質の存在量に関する変動係数の閾値に基づいて、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記変動係数の閾値が、オルニチンの存在量に関して0.20以上および／またはシトルリンの存在量に関して0.30以上の場合に、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行すると評価する、請求項５に記載の方法。
細胞の分化状態が既知である対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する工程（３）をさらに含み、
前記工程（１）において測定される、前記多能性幹細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記工程（３）において測定される、または測定された、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する、請求項１に記載の方法。
前記多能性幹細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比または差が、あらかじめ定めた閾値以上であるか、または閾値未満であるかに基づいて、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する、請求項７に記載の方法。
前記多能性幹細胞の培養上清における指標物質の存在量の経時変化と、前記対照細胞の培養上清における指標物質の存在量の経時変化とを比較することにより、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する、請求項７に記載の方法。
前記対照細胞が、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程において、未分化な状態が維持された細胞である、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程において、細胞の分化が確認された細胞を対照細胞として、当該対照細胞の培養上清における指標物質の存在量をあらかじめ測定する工程（４）をさらに含み、
前記多能性幹細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、細胞の分化状態を評価する、請求項１に記載の方法。
前記対照細胞の培養上清における指標物質の存在量に基づき定められる閾値に基づき、細胞の分化状態を評価する、請求項１１に記載の方法。
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（iPS細胞）または胚性幹細胞（ES細胞）である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
前記指標物質の存在量を質量分析法により測定する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法を用いる、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を製造する方法。
胚性幹細胞（ES細胞）から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程における、該ES細胞の分化状態を評価する方法であって、
（１）ES細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する工程、および、
（２）前記指標物質の存在量の変化に基づいて、ES細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する工程、を含み、
前記指標物質が、グルタチオン、オルニチン、シトルリン、システイン、ピペコリン酸、プトレシン、2-アミノアジピン酸、シチジンおよびデオキシシチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
前記工程（２）において、色素沈着が観察されるようになる前の期間に培養上清における前記指標物質の存在量の経時変化を解析することにより、前記ES細胞の分化状態を評価し、
前記経時変化が大きいと判定される場合に、ES細胞から網膜色素上皮細胞への細胞分化が進行する可能性が高いと評価する、方法。
前記指標物質が、グルタチオン、オルニチン、シトルリン、ピペコリン酸、2-アミノアジピン酸、シチジンおよびデオキシシチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１６に記載の方法。
胚性幹細胞（ES細胞）から網膜色素上皮細胞への分化誘導工程における、該ES細胞の分化状態を評価する方法であって、
（１）ES細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定する工程、および、
（２）前記指標物質の存在量の変化に基づいて、ES細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化状態を評価する工程、を含み、
前記指標物質が、プロリン、アデノシンおよびイノシンからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
前記工程（２）において、培養上清における前記指標物質の存在量の経時変化を解析することにより、ES細胞から網膜色素上皮細胞への細胞の分化の進行状態を評価する、方法。
前記指標物質の存在量を質量分析法により測定する、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
請求項１６～１９のいずれか１項に記載の方法を用いる、ES細胞から網膜色素上皮細胞を製造する方法。