CN109576223A - 一种胎盘血造血干细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胎盘血造血干细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)采集胎盘血，通过0.3‑1.0wt％的氯化钠溶液稀释，0.3‑1.0wt％的甲基纤维素溶液沉淀，再用浓度为12‑16％的人AB血浆重悬和分离液分离纯化，获得单个核细胞；(2)向单个核细胞重悬液中加入CD34+抗体孵育，然后加入CD34+免疫磁珠孵育，用新洗涤液洗涤后置于磁场中，静置，得CD34+细胞；(3)将CD34+细胞接种于胎盘血造血干细胞培养基中培养，获得细胞。该培养方法稳定有效，使得造血干细胞能够长久处于增殖不分化状态，避免造血干细胞在增殖过程中分泌大量氧化产物促使细胞凋亡的问题，提高了造血干细胞的扩增率和细胞活性。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种胎盘血造血干细胞的培养方法。
背景技术
造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具体长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。由于造血干细胞具有多向分化的潜能，将造血干细胞移植到体内是治疗白血病、淋巴瘤等恶性肿瘤、代谢性疾病、自身免疫性疾病及先天免疫缺陷等严重危害人类健康疾病的有效方法，可以有效的减轻患者的痛苦。但是，由于造血干细胞在体内的数量极少，大大的限制了造血干细胞在临床中的应用。
随着医学和生物技术的发展，近年来发现胎盘含有大量的造血干细胞，且所含造血干细胞数量很高，而且移植胎盘造血干细胞的配型要求不需要很严格，移植后反应较轻且不需要采用药物等优点，从胎盘血中提取造血干细胞的方向成为领域内的研究方向。
目前，提取出的造血干细胞的体位增殖途径主要有两种，一种是通过基质的灌注进行体外培养；第二种是将造血干细胞接种于造血干细胞培养基进行体外培养。但采用这两种方法培养的造血干细胞大多存在活性和增殖能力较差的问题，且细胞易分化。因此，现急需研究一种能够提高造血干细胞的扩增率和细胞活性的培养方法。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种胎盘血造血干细胞的培养方法，可有效解决现有的培养方法培养的造血干细胞活性和增殖能力较差的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种胎盘血造血干细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)采集胎盘血，加入等体积的稀释液进行稀释，得胎盘血稀释液，接着向胎盘血稀释液中加入质量百分数为4-8％的沉淀液进行沉淀，然后离心，弃除上清液，得沉淀，向沉淀中加入重悬液，混匀，然后再加入分离液，离心，取云雾层，向云雾层中加入重悬液，混匀，离心，得单个核细胞，向单个核细胞中加入重悬液，得细胞重悬液，细胞重悬液中单个核细胞密度为1-2×108个/mL；
(2)向细胞重悬液中加入CD34+抗体，混匀，室温下孵育10-20min，然后加入CD34+免疫磁珠，混匀，室温下孵育10-20min，用新洗涤液洗涤后置于磁场中，静置3-5min后弃去上清液，得造血干细胞CD34+细胞；其中，CD34+抗体加入量为80-100μL/mL，CD34+免疫磁珠加入量为40-60μL/mL细胞重悬液；
(3)将造血干细胞CD34+细胞接种于胎盘血造血干细胞培养基中，使造血干细胞CD34+细胞密度为1-3×105个/mL，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养5-7天，收获细胞。
进一步地，稀释液为0.3-1.0wt％的氯化钠溶液；沉淀液为0.3-1.0wt％的甲基纤维素溶液；重悬液为浓度为12-16％的人AB血浆；分离液为密度为1.075-1.085g/mL聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液；细胞洗涤液为添加有1.5-2.0％FBS和0.01-0.03％EDTA的PBS溶液。
进一步地，胎盘血造血干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，按终浓度计，添加剂包括以下含量的组分：海藻糖60-80ng/mL、维生素C 50-65ng/mL、小蘖碱1-3mg/mL、千金藤碱30-50μmol/mL、第一细胞因子缓释球体1.2-2.5mg/mL、第二细胞因子缓释球体15-30mg/mL、氯化钠3-8mg/mL、谷胱甘肽20-30mg/mL、透明质酸5-10μg/mL、葡萄籽提取物2-5mg/mL、人参皂苷6-12mg/mL和银耳多糖5-10mg/mL。
进一步地，胎盘血造血干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，按终浓度计，添加剂包括以下含量的组分：海藻糖70ng/mL、维生素C 55ng/mL、小蘖碱2mg/mL、千金藤碱38μmol/mL、第一细胞因子缓释球体2.0mg/mL、第二细胞因子缓释球体22mg/mL、氯化钠4mg/mL、谷胱甘肽25mg/mL、透明质酸6μg/mL、葡萄籽提取物3mg/mL、人参皂苷7mg/mL和银耳多糖6mg/mL。
进一步地，基础培养基为DMEM培养基。
进一步地，第一细胞因子缓释球体通过以下方法制备得到：
(1)将葡聚糖和聚乙二醇分别加入水中，搅拌至溶解，制得8-10wt％的葡聚糖水溶液和质量浓度为8-10wt％的聚乙二醇水溶液；
(2)在0-4℃条件下，将葡聚糖水溶液和聚乙二醇水溶液按质量比为1：5-10混合，然后再加入白介素-3、白介素-6、GM-CSF和促红细胞生成素，搅拌，形成水相-水相乳液；其中，白介素-3、白介素-6、GM-CSF和促红细胞生成素的浓度均为1-2wt％；
(3)将聚乳酸-聚羟基乙酸加入二氯甲烷溶液中，超声分散2-3min，得混合物，该混合物中聚乳酸-聚羟基乙酸浓度为20-25wt％；
(4)将步骤(2)所得物与步骤(3)所得物按体积比为1：2-3混合；
(5)将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀，聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠的浓度分别为1-2wt％、0.6-1.2wt％和1-2wt％，然后加入步骤(4)所得物，搅拌1-1.5h，用水洗涤，然后离心分离，最后真空冷冻干燥，制得第一细胞因子缓释球体。
进一步地，第一细胞因子缓释球体的粒径为50-60μm。
进一步地，第二细胞因子缓释球体通过以下方法制备得到：
(1)将干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体和聚乙二醇分别加入预先添加有葡聚糖和季戊四醇锌盐的水溶液中，搅拌均匀，得混合物1；其中，混合物1中干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、聚乙二醇、葡聚糖和季戊四醇锌盐的浓度分别为2-2.5wt％、2-2.5wt％、5-6wt％、4.5-5.5wt％和2.5-3.5wt％；
(2)将聚乳酸-聚羟基乙酸加入二氯甲烷溶液中，超声分散2-3min，得混合物，该混合物中聚乳酸-聚羟基乙酸浓度为20-25wt％；
(3)将步骤(1)所得物与步骤(2)所得物按体积比为1：2-3混合；
(4)将聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠加入水中，搅拌均匀，聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠的浓度分别为1-2wt％、0.6-1.2wt％和1-2wt％，然后加入步骤(3)所得物，搅拌1-1.5h，用水洗涤，然后离心分离，最后真空冷冻干燥，制得第二细胞因子缓释球体。
进一步地，第二细胞因子缓释球体的粒径为60-80μm。
进一步地，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32-35％的水和0.03-0.08％的酵母，室温下密封发酵10-12天，然后真空干燥至含量量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60-62℃，萃取压力为3.8-4.0MPa，萃取时间为1-1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/3-1/4，所得浓缩液以0.6-0.8V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
本发明提供的胎盘血造血干细胞的培养方法，具有以下有益效果：
(1)通过对稀释液、沉淀液、重悬液、分离液的选择，可以有效提高单个核细胞的分离纯化效率。
(2)本发明提供的胎盘血造血干细胞培养方法稳定有效，使得造血干细胞能够长久处于增殖不分化状态，避免造血干细胞在增殖过程中分泌大量氧化产物促使细胞凋亡的问题，提高了造血干细胞的扩增率和细胞活性，并保持了造血干细胞的特性，培养后的培养液中也未检测出真菌、细菌、支原体等，微生物检测指标符合要求。
(3)本发明中所用的培养基，其各组分搭配合理，特定的组分之间相互配合，可以滋养造血干细胞，促进造血干细胞的活性，其中谷胱甘肽、维生素C、葡萄籽提取物、人参皂苷和银耳多糖相互配合，可以清除细胞内的自由基，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基，有利于酶活性的发挥，并且能恢复已被破坏的酶分子中-SH基的活性功能，使酶重新恢复活性，降低细胞发生凋亡的概率；透明质酸、海藻糖、氯化钠等相互配合，维持细胞的渗透平衡；同时透明质酸、海藻糖、谷胱甘肽与人参皂苷和银耳多糖相互配合，可以增强细胞的新陈代谢，促进造血干细胞快速大量增殖；小蘖碱、千金藤碱、与人参皂苷和银耳多糖相互配合，不仅可以提高培养基的抗病原微生物作用，提高干细胞的存活率，而且还可以提高造血干细胞的增殖速度，提高造血干细胞的活性。
具体实施方式
实施例1
一种胎盘血造血干细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)采集胎盘血，加入等体积的稀释液进行稀释，得胎盘血稀释液，接着向胎盘血稀释液中加入质量百分数为4％的沉淀液进行沉淀，然后离心，弃除上清液，得沉淀，向沉淀中加入重悬液，混匀，然后再加入分离液，离心，取云雾层，向云雾层中加入重悬液，混匀，离心，得单个核细胞，向单个核细胞中加入重悬液，得细胞重悬液，细胞重悬液中单个核细胞密度为1-2×108个/mL；
(2)向细胞重悬液中加入CD34+抗体，混匀，室温下孵育10min，然后加入CD34+免疫磁珠，混匀，室温下孵育10min，用新洗涤液洗涤后置于磁场中，静置5min后弃去上清液，得造血干细胞CD34+细胞；其中，CD34+抗体加入量为80μL/mL，CD34+免疫磁珠加入量为40μL/mL细胞重悬液；
(3)将造血干细胞CD34+细胞接种于胎盘血造血干细胞培养基中，使造血干细胞CD34+细胞密度为1-3×105个/mL，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养5天，收获细胞。
其中，稀释液为0.3wt％的氯化钠溶液；沉淀液为0.3wt％的甲基纤维素溶液；重悬液为浓度为12％的人AB血浆(Life Technologies公司)；分离液为密度为1.075g/mL聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液(GE公司)；细胞洗涤液为添加有1.5％FBS和0.01％EDTA的PBS溶液。
所用培养基包括基础培养基和添加剂，基础培养基为DMEM培养基，按终浓度计，添加剂包括以下含量的组分：海藻糖80ng/mL、维生素C 65ng/mL、小蘖碱3mg/mL、千金藤碱50μmol/mL、第一细胞因子缓释球体2.5mg/mL、第二细胞因子缓释球体30mg/mL、氯化钠8mg/mL、谷胱甘肽30mg/mL、透明质酸10μg/mL、葡萄籽提取物5mg/mL、人参皂苷12mg/mL和银耳多糖10mg/mL。
其中，第一细胞因子缓释球体通过以下方法制备得到：
(1)将葡聚糖和聚乙二醇分别加入水中，搅拌至溶解，制得10wt％的葡聚糖水溶液和质量浓度为10wt％的聚乙二醇水溶液；
(2)在0-4℃条件下，将葡聚糖水溶液和聚乙二醇水溶液按质量比为1：10混合，然后再加入白介素-3、白介素-6、GM-CSF和促红细胞生成素，搅拌，形成水相-水相乳液；其中，水相-水相乳液中白介素-3、白介素-6、GM-CSF和促红细胞生成素的浓度均为2wt％；
(3)将聚乳酸-聚羟基乙酸加入二氯甲烷溶液中，超声分散2-3min，得混合物，该混合物中聚乳酸-聚羟基乙酸浓度为25wt％；
(4)将步骤(2)所得物与步骤(3)所得物按体积比为1：3混合；
(5)将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀，聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠的浓度分别为2wt％、1.2wt％和2wt％，然后加入步骤(4)所得物，搅拌1h，用水洗涤，然后离心分离，最后真空冷冻干燥，制得第一细胞因子缓释球体，其粒径为50-60μm。
第二细胞因子缓释球体通过以下方法制备得到：
(1)将干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体和聚乙二醇分别加入预先添加有葡聚糖和季戊四醇锌盐的水溶液中，搅拌均匀，得混合物1；其中，混合物1中干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、聚乙二醇、葡聚糖和季戊四醇锌盐的浓度分别为2.5wt％、2.5wt％、6wt％、5.5wt％和3.5wt％；
(2)将聚乳酸-聚羟基乙酸加入二氯甲烷溶液中，超声分散2-3min，得混合物，该混合物中聚乳酸-聚羟基乙酸浓度为25wt％；
(3)将步骤(1)所得物与步骤(2)所得物按体积比为1：3混合；
(4)将聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠加入水中，搅拌均匀，聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠的浓度分别为2wt％、1.2wt％和2wt％，然后加入步骤(3)所得物，搅拌1.5h，用水洗涤，然后离心分离，最后真空冷冻干燥，制得第二细胞因子缓释球体，其粒径为60-80μm。
葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量35％的水和0.08％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含量量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为62℃，萃取压力为4.0MPa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.8V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
实施例2
一种胎盘血造血干细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)采集胎盘血，加入等体积的稀释液进行稀释，得胎盘血稀释液，接着向胎盘血稀释液中加入质量百分数为8％的沉淀液进行沉淀，然后离心，弃除上清液，得沉淀，向沉淀中加入重悬液，混匀，然后再加入分离液，离心，取云雾层，向云雾层中加入重悬液，混匀，离心，得单个核细胞，向单个核细胞中加入重悬液，得细胞重悬液，细胞重悬液中单个核细胞密度为1-2×108个/mL；
(2)向细胞重悬液中加入CD34+抗体，混匀，室温下孵育20min，然后加入CD34+免疫磁珠，混匀，室温下孵育20min，用新洗涤液洗涤后置于磁场中，静置3-5min后弃去上清液，得造血干细胞CD34+细胞；其中，CD34+抗体加入量为100μL/mL，CD34+免疫磁珠加入量为60μL/mL细胞重悬液；
(3)将造血干细胞CD34+细胞接种于胎盘血造血干细胞培养基中，使造血干细胞CD34+细胞密度为1-3×105个/mL，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养7天，收获细胞。
其中，稀释液为1.0wt％的氯化钠溶液；沉淀液为1.0wt％的甲基纤维素溶液；重悬液为浓度为16％的人AB血浆(Life Technologies公司)；分离液为密度为1.085g/mL聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液(GE公司)；细胞洗涤液为添加有2.0％FBS和0.03％EDTA的PBS溶液。
所用培养基包括基础培养基和添加剂，基础培养基为DMEM培养基，按终浓度计，添加剂包括以下含量的组分：海藻糖80ng/mL、维生素C 65ng/mL、小蘖碱3mg/mL、千金藤碱50μmol/mL、第一细胞因子缓释球体2.5mg/mL、第二细胞因子缓释球体30mg/mL、氯化钠8mg/mL、谷胱甘肽30mg/mL、透明质酸10μg/mL、葡萄籽提取物5mg/mL、人参皂苷12mg/mL和银耳多糖10mg/mL。
其中，第一细胞因子缓释球体通过以下方法制备得到：
(1)将葡聚糖和聚乙二醇分别加入水中，搅拌至溶解，制得10wt％的葡聚糖水溶液和质量浓度为10wt％的聚乙二醇水溶液；
(2)在0-4℃条件下，将葡聚糖水溶液和聚乙二醇水溶液按质量比为1：10混合，然后再加入白介素-3、白介素-6、GM-CSF和促红细胞生成素，搅拌，形成水相-水相乳液；其中，水相-水相乳液中白介素-3、白介素-6、GM-CSF和促红细胞生成素的浓度均为2wt％；
(3)将聚乳酸-聚羟基乙酸加入二氯甲烷溶液中，超声分散2-3min，得混合物，该混合物中聚乳酸-聚羟基乙酸浓度为25wt％；
(4)将步骤(2)所得物与步骤(3)所得物按体积比为1：3混合；
(5)将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀，聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠的浓度分别为2wt％、1.2wt％和2wt％，然后加入步骤(4)所得物，搅拌1h，用水洗涤，然后离心分离，最后真空冷冻干燥，制得第一细胞因子缓释球体，其粒径为50-60μm。
第二细胞因子缓释球体通过以下方法制备得到：
(1)将干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体和聚乙二醇分别加入预先添加有葡聚糖和季戊四醇锌盐的水溶液中，搅拌均匀，得混合物1；其中，混合物1中干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、聚乙二醇、葡聚糖和季戊四醇锌盐的浓度分别为2.5wt％、2.5wt％、6wt％、5.5wt％和3.5wt％；
(2)将聚乳酸-聚羟基乙酸加入二氯甲烷溶液中，超声分散2-3min，得混合物，该混合物中聚乳酸-聚羟基乙酸浓度为25wt％；
(3)将步骤(1)所得物与步骤(2)所得物按体积比为1：3混合；
(4)将聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠加入水中，搅拌均匀，聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠的浓度分别为2wt％、1.2wt％和2wt％，然后加入步骤(3)所得物，搅拌1.5h，用水洗涤，然后离心分离，最后真空冷冻干燥，制得第二细胞因子缓释球体，其粒径为60-80μm。
葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量35％的水和0.08％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含量量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为62℃，萃取压力为4.0MPa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.8V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
实施例3
一种胎盘血造血干细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)采集胎盘血，加入等体积的稀释液进行稀释，得胎盘血稀释液，接着向胎盘血稀释液中加入质量百分数为6％的沉淀液进行沉淀，然后离心，弃除上清液，得沉淀，向沉淀中加入重悬液，混匀，然后再加入分离液，离心，取云雾层，向云雾层中加入重悬液，混匀，离心，得单个核细胞，向单个核细胞中加入重悬液，得细胞重悬液，细胞重悬液中单个核细胞密度为1-2×108个/mL；
(2)向细胞重悬液中加入CD34+抗体，混匀，室温下孵育15min，然后加入CD34+免疫磁珠，混匀，室温下孵育15min，用新洗涤液洗涤后置于磁场中，静置3-5min后弃去上清液，得造血干细胞CD34+细胞；其中，CD34+抗体加入量为80μL/mL，CD34+免疫磁珠加入量为60μL/mL细胞重悬液；
(3)将造血干细胞CD34+细胞接种于胎盘血造血干细胞培养基中，使造血干细胞CD34+细胞密度为1-3×105个/mL，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养7天，收获细胞。
其中，稀释液为1.0wt％的氯化钠溶液；沉淀液为1.0wt％的甲基纤维素溶液；重悬液为浓度为16％的人AB血浆(Life Technologies公司)；分离液为密度为1.085g/mL聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液(GE公司)；细胞洗涤液为添加有2.0％FBS和0.03％EDTA的PBS溶液。
所用培养基包括基础培养基和添加剂，基础培养基为DMEM培养基，按终浓度计，添加剂包括以下含量的组分：海藻糖70ng/mL、维生素C 55ng/mL、小蘖碱2mg/mL、千金藤碱38μmol/mL、第一细胞因子缓释球体2.0mg/mL、第二细胞因子缓释球体22mg/mL、氯化钠4mg/mL、谷胱甘肽25mg/mL、透明质酸6μg/mL、葡萄籽提取物3mg/mL、人参皂苷7mg/mL和银耳多糖6mg/mL。
其中，第一细胞因子缓释球体通过以下方法制备得到：
(1)将葡聚糖和聚乙二醇分别加入水中，搅拌至溶解，制得10wt％的葡聚糖水溶液和质量浓度为10wt％的聚乙二醇水溶液；
(2)在0-4℃条件下，将葡聚糖水溶液和聚乙二醇水溶液按质量比为1：8混合，然后再加入白介素-3、白介素-6、GM-CSF和促红细胞生成素，搅拌，形成水相-水相乳液；其中，水相-水相乳液中白介素-3、白介素-6、GM-CSF和促红细胞生成素的浓度均为1.5wt％；
(3)将聚乳酸-聚羟基乙酸加入二氯甲烷溶液中，超声分散2-3min，得混合物，该混合物中聚乳酸-聚羟基乙酸浓度为22wt％；
(4)将步骤(2)所得物与步骤(3)所得物按体积比为1：3混合；
(5)将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀，聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠的浓度分别为1.5wt％、1.0wt％和1.5wt％，然后加入步骤(4)所得物，搅拌1h，用水洗涤，然后离心分离，最后真空冷冻干燥，制得第一细胞因子缓释球体，其粒径为50-60μm。
第二细胞因子缓释球体通过以下方法制备得到：
(1)将干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体和聚乙二醇分别加入预先添加有葡聚糖和季戊四醇锌盐的水溶液中，搅拌均匀，得混合物1；其中，混合物1中干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、聚乙二醇、葡聚糖和季戊四醇锌盐的浓度分别为2.2wt％、2.2wt％、5.5wt％、5.0wt％和3.0wt％；
(2)将聚乳酸-聚羟基乙酸加入二氯甲烷溶液中，超声分散2-3min，得混合物，该混合物中聚乳酸-聚羟基乙酸浓度为22wt％；
(3)将步骤(1)所得物与步骤(2)所得物按体积比为1：2.5混合；
(4)将聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠加入水中，搅拌均匀，聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠的浓度分别为1.5wt％、1.0wt％和1.5wt％，然后加入步骤(3)所得物，搅拌1h，用水洗涤，然后离心分离，最后真空冷冻干燥，制得第二细胞因子缓释球体，其粒径为60-80μm。
葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量33％的水和0.05％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含量量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为4.0MPa，萃取时间为1.2h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.8V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
实施例4
本实施例中所用的培养基缺少小蘖碱、千金藤碱，其余成分和培养方法均与实施例3相同。
实施例5
本实施例中所用的培养基缺少葡萄籽提取物、人参皂苷和银耳多糖，其余成分和培养方法均与实施例3相同。
实施例6
本实施例中所用的培养基缺少第二细胞因子缓释球体，其余其余成分和培养方法均与实施例3相同。
分别取实施例1-6培养方法培养的细胞，采用Becton Dickinson型流式细胞仪进行细胞计数，并对细胞进行CD34-FITC抗体检测，细胞标记方法为：细胞用PBS缓冲盐溶液洗涤一次，加入CD34-FITC抗体10μL，于4℃避光孵育30min，孵育结束后用PBS缓冲盐溶液再洗涤一次，使用流式细胞仪分析CD34+细胞含量，检测结果见表1。
表1细胞总数及CD34+细胞含量
由表1可知，采用本发明提供的胎盘血造血干细胞培养方法培养造血干细胞，其细胞数量和CD34+细胞含量均得到显著提高。
分别取实施例1-6培养方法培养的细胞，经流式细胞仪分析G0/G1期、G2/M期细胞百分比，检测结果见表2。
表2 G0/G1期、G2/M期细胞百分比结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | |
| G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub>期 | 72.1 | 71.7 | 74.2 | 59.6 | 58.3 | 45.9 |
| G<sub>2</sub>/M期 | 8.9 | 9.1 | 7.5 | 19.9 | 22.3 | 16.1 |
由表2可知，实施例1-3中培养的细胞，处于G0/G1期的细胞百分比均大于对照组，表明采用本发明提供的胎盘血造血干细胞培养方法培养的活细胞数量明显多于对比例，同时实施例1-3培养的细胞处于G0/G1期的细胞百分明显高于G2/M期细胞百分比，说明采用本发明提供的培养方法及所用培养基能够延长造血干细胞的G0/G1期，使其能够长期处于增殖状态而不分化，从而保持了造血干细胞的特性。
Claims (10)
1.一种胎盘血造血干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集胎盘血，加入等体积的稀释液进行稀释，得胎盘血稀释液，接着向胎盘血稀释液中加入质量百分数为4-8％的沉淀液进行沉淀，然后离心，弃除上清液，得沉淀，向沉淀中加入重悬液，混匀，然后再加入分离液，离心，取云雾层，向云雾层中加入重悬液，混匀，离心，得单个核细胞，向单个核细胞中加入重悬液，得细胞重悬液，细胞重悬液中单个核细胞密度为1-2×108个/mL；
(2)向细胞重悬液中加入CD34+抗体，混匀，室温下孵育10-20min，然后加入CD34+免疫磁珠，混匀，室温下孵育10-20min，用新洗涤液洗涤后置于磁场中，静置3-5min后弃去上清液，得造血干细胞CD34+细胞；其中，CD34+抗体加入量为80-100μL/mL，CD34+免疫磁珠加入量为40-60μL/mL细胞重悬液；
(3)将造血干细胞CD34+细胞接种于胎盘血造血干细胞培养基中，使造血干细胞CD34+细胞密度为1-3×105个/mL，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养5-7天，收获细胞。
2.根据权利要求1所述的胎盘血造血干细胞的培养方法，其特征在于，所述稀释液为0.3-1.0wt％的氯化钠溶液；沉淀液为0.3-1.0wt％的甲基纤维素溶液；重悬液为浓度为12-16％的人AB血浆；分离液为密度为1.075-1.085g/mL聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液；细胞洗涤液为添加有1.5-2.0％FBS和0.01-0.03％EDTA的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的胎盘血造血干细胞的培养方法，其特征在于，所述胎盘血造血干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，按终浓度计，添加剂包括以下含量的组分：海藻糖60-80ng/mL、维生素C 50-65ng/mL、小蘖碱1-3mg/mL、千金藤碱30-50μmol/mL、第一细胞因子缓释球体1.2-2.5mg/mL、第二细胞因子缓释球体15-30mg/mL、氯化钠3-8mg/mL、谷胱甘肽20-30mg/mL、透明质酸5-10μg/mL、葡萄籽提取物2-5mg/mL、人参皂苷6-12mg/mL和银耳多糖5-10mg/mL。
4.根据权利要求3所述的胎盘血造血干细胞的培养方法，其特征在于，所述胎盘血造血干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，按终浓度计，添加剂包括以下含量的组分：海藻糖70ng/mL、维生素C 55ng/mL、小蘖碱2mg/mL、千金藤碱38μmol/mL、第一细胞因子缓释球体2.0mg/mL、第二细胞因子缓释球体22mg/mL、氯化钠4mg/mL、谷胱甘肽25mg/mL、透明质酸6μg/mL、葡萄籽提取物3mg/mL、人参皂苷7mg/mL和银耳多糖6mg/mL。
5.根据权利要求3或4所述的胎盘血造血干细胞的培养方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM培养基。
6.根据权利要求3或4所述的胎盘血造血干细胞的培养方法，其特征在于，所述第一细胞因子缓释球体通过以下方法制备得到：
(1)将葡聚糖和聚乙二醇分别加入水中，搅拌至溶解，制得8-10wt％的葡聚糖水溶液和质量浓度为8-10wt％的聚乙二醇水溶液；
(2)在0-4℃条件下，将葡聚糖水溶液和聚乙二醇水溶液按质量比为1：5-10混合，然后再加入白介素-3、白介素-6、GM-CSF和促红细胞生成素，搅拌，形成水相-水相乳液；其中，白介素-3、白介素-6、GM-CSF和促红细胞生成素的浓度均为1-2wt％；
(3)将聚乳酸-聚羟基乙酸加入二氯甲烷溶液中，超声分散2-3min，得混合物，该混合物中聚乳酸-聚羟基乙酸浓度为20-25wt％；
(4)将步骤(2)所得物与步骤(3)所得物按体积比为1：2-3混合；
(5)将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀，聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠的浓度分别为1-2wt％、0.6-1.2wt％和1-2wt％，然后加入步骤(4)所得物，搅拌1-1.5h，用水洗涤，然后离心分离，最后真空冷冻干燥，制得第一细胞因子缓释球体。
7.根据权利要求6所述的胎盘血造血干细胞的培养方法，其特征在于，所述第一细胞因子缓释球体的粒径为50-60μm。
8.根据权利要求3或4所述的胎盘血造血干细胞的培养方法，其特征在于，所述第二细胞因子缓释球体通过以下方法制备得到：
(1)将干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体和聚乙二醇分别加入预先添加有葡聚糖和季戊四醇锌盐的水溶液中，搅拌均匀，得混合物1；其中，混合物1中干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、聚乙二醇、葡聚糖和季戊四醇锌盐的浓度分别为2-2.5wt％、2-2.5wt％、5-6wt％、4.5-5.5wt％和2.5-3.5wt％；
(2)将聚乳酸-聚羟基乙酸加入二氯甲烷溶液中，超声分散2-3min，得混合物，该混合物中聚乳酸-聚羟基乙酸浓度为20-25wt％；
(3)将步骤(1)所得物与步骤(2)所得物按体积比为1：2-3混合；
(4)将聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠加入水中，搅拌均匀，聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠的浓度分别为1-2wt％、0.6-1.2wt％和1-2wt％，然后加入步骤(3)所得物，搅拌1-1.5h，用水洗涤，然后离心分离，最后真空冷冻干燥，制得第二细胞因子缓释球体。
9.根据权利要求8所述的胎盘血造血干细胞的培养方法，其特征在于，所述第二细胞因子缓释球体的粒径为60-80μm。
10.根据权利要求3或4所述的胎盘血造血干细胞的培养方法，其特征在于，所述葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32-35％的水和0.03-0.08％的酵母，室温下密封发酵10-12天，然后真空干燥至含量量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60-62℃，萃取压力为3.8-4.0MPa，萃取时间为1-1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/3-1/4，所得浓缩液以0.6-0.8V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
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