CN104693276B

CN104693276B - 一种肿瘤特异性靶标及其制备细胞免疫治疗制剂的应用

Info

Publication number: CN104693276B
Application number: CN201510082266.XA
Authority: CN
Inventors: 李彬
Original assignee: Hebei Bohai Biology Engineering Development Co Ltd
Current assignee: Hebei Bio High Technology Deve Co ltd
Priority date: 2015-02-15
Filing date: 2015-02-15
Publication date: 2018-12-14
Anticipated expiration: 2035-02-15
Also published as: CN104693276A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种肿瘤特异性靶标及其应用。本发明所述靶标氨基酸序列为：SAKYGVRKF，可实现树突状细胞体外的有效扩增和活化，所递呈的T淋巴细胞对肿瘤具有特异的杀伤作用，是目前最符合细胞免疫学原理的细胞免疫治疗技术，具有良好的应用前景。

Description

一种肿瘤特异性靶标及其制备细胞免疫治疗制剂的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及肿瘤特异性靶标及其应用。

背景技术

肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病，伴随着人类对自然的改造进程而产生的环境污染，更使得全球恶性肿瘤患者人数大大增加。而传统的治疗手段如手术、化疗、放疗这三大疗法由于缺乏靶向性，在治疗肿瘤的同时也大大的损害了机体的正常组织细胞，不能达到良好的抗肿瘤效果。

细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的治疗模式，是一种基于自身免疫的新型治疗方法，其运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发/增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。

细胞疗法的具体方法是通过科技手段将病人体内的单个核细胞提取出来，用特殊方法在患者体外将其培养成为树突状细胞(DC)，赋予其专杀肿瘤细胞的抗原信息，再使其数量成千万倍增多，成为专门攻击杀伤肿瘤细胞的“细胞导弹”。然后将这种负载抗原信息的DC细胞回输到患者体内，在患者体内形成大量针对肿瘤细胞的免疫杀伤细胞(CTL)，从而针对肿瘤细胞产生主动性和靶向性攻击，迅速准确地杀灭肿瘤细胞。

目前临床所开展的细胞免疫治疗技术基本停留在LAK、NK、CIK、DC水平，而由腺病毒转染负载抗原和CAR-T技术由于含有基因技术，在伦理等方面存在争论。

发明内容

本发明的目的是提供一种肿瘤特异性靶标及其应用。

本发明提供的肿瘤特异性的靶标，其氨基酸序列为SAKYGVRKF，如SEQ ID No 1所示。

作为优选，所述肿瘤为黑色素瘤。

本发明还提供所述靶标在制备治疗黑色素瘤的制剂中的应用，更优选地，所述治疗为细胞免疫治疗。

本发明的另一个目的是提供一种用于细胞免疫治疗体外诱导的制剂，包含所述的靶标。

作为优选，其为细胞培养液。更优选地，其为树突状细胞的细胞培养液。

本发明由于使用了高特异性肿瘤靶标，使树突状细胞在体外可以附载靶标并扩增，经流式细胞仪检测靶标附载量与树突状细胞扩增数量成正相关。

十余年来，发明人通过大量工作获得肿瘤高特异性靶标，所述靶标可实现树突状细胞体外的有效扩增和活化，所递呈的T淋巴细胞对该肿瘤细胞具有特异的杀伤作用，是目前最符合细胞免疫学原理的细胞免疫治疗技术，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1-2靶标体外附载扩增的树突状细胞检测结果；图1为靶标加入24小时树突状细胞密度；图2为靶标加入9天树突状细胞密度；

图3为树突状细胞标志物流式细胞仪检测，附载靶标的DC均高表达CD86、HLA-DR、CD11C，其阳性细胞均在90％以上。

具体实施方式

本发明公开了一种肿瘤特异性靶标及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：肿瘤特异性树突状细胞(DC)靶标体外扩增活化方法

1、标本采集：

要求黑色素瘤患者血象处于正常值范围之内(WBC：4-10×10⁹、LYM％：20％-40％)，上下浮动不超过5％，机采外周血方式循环量1000-4000ml，单个核细胞数：多于1×10⁹。抽血方式50-100ml，单个核细胞数：多于1×10⁶。

抗凝剂首选肝素，枸橼酸钠次之，禁用EDTA。

采集好的标本保存时间不要超过6h，应尽快进行细胞制备。如果制备前保存标本时间超过2h，应将标本保存于4℃。

2.操作前准备

将装有PBMC外周血单个核细胞的悬液的采集袋，用喷有75％酒精自上而下擦拭一遍，再放入传入传递窗，万级层流室中的制备人员从传递窗中取出再用喷有75％酒精的无尘布自上而下擦拭一遍，然后将其放入到处于运行状态的生物安全柜中。

3.分离单个核细胞

转移PBMC细胞悬液标本：使用经灭菌消毒的剪刀剪断塑料管，小心地把采血袋中的PBMC细胞悬液标本倾倒入离心管中。使用后的采血袋需用热合机封口。

离心分离：将离心管配平，1310g，离心10min，RT。

将血浆层吸出，弃之。

稀释：用生理盐水按1:1比例稀释上述细胞沉淀并吹打混匀。

铺层加样：将30ml稀释的细胞悬液缓慢加入盛有室温的15ml人淋巴细胞分离液的50ml无菌离心管中。(方法如下：用10ml的移液管吸取细胞悬液，伸至人淋巴细胞分离液液面上方的0.5cm处，让第一滴液体延管壁缓慢自然滑落铺至人淋巴细胞分离液液面上，然后匀速缓慢加入细胞悬液)，配平后离心750g，20min，RT(离心转速应选择慢升慢降)。

提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。吸取血浆层弃之，直至距白膜层5毫米(mm)处。小心将白膜层细胞转移至50ml无菌离心管中，补充等体积的生理盐水，混匀；

洗涤：750g，离心10min，RT，弃上清，用45ml生理盐水重悬细胞，混匀。

洗涤：300g，离心10min，RT，弃上清，用45ml生理盐水重悬细胞，混匀。(之后的生理盐水洗涤同此步骤)

细胞计数：吸取0.2ml-0.5ml细胞悬液加入到EP管中，混匀后放入细胞计数仪进行计数.

无菌检测留样：再次生理盐水洗涤，取洗涤后上清液至少5ml进行留样，用于无菌检测。

4.接种细胞：根据计数结果，用GT-T551将细胞调整到1×10⁷个细胞/ml，接种至T175培养瓶中，每个T175培养瓶接种30±5ml的细胞悬液，置二氧化碳培养箱37℃；5％CO₂孵育30分钟。

5.细胞培养

将孵育后的贴壁细胞作DC培养，悬浮细胞收集作为CIK培养。

DC细胞培养：

将孵育后的贴壁细胞作DC培养:取出培养瓶，轻轻摇晃十数次，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，并转移至离心管中。再用生理盐水轻轻重复洗涤几次，直至不再有悬浮的细胞。

DC细胞培养：贴壁细胞作DC培养，每瓶加入30ml(T175培养瓶)含特异性靶标的DC细胞培养液GT-T551，置二氧化碳培养箱继续培养，37℃；饱和湿度；5％CO₂。

贴壁细胞培养第2天(24h)，镜下观察细胞变形，并形成典型的树突状突起。

贴壁细胞培养第3天，镜下观察细胞，有部分细胞的树突状突起收缩，DC细胞趋于成熟。用含靶标的DC细胞培养液进行半量换液(吸出10ml培养液后再补加10ml新DC培养液)，置二氧化碳培养箱继续培养，37℃；5％CO₂。

贴壁细胞培养第4天，镜下观察细胞会有部分DC细胞成熟为毛刺状的细胞，并处于半悬浮的状态。

贴壁细胞培养第5天，毛刺状的成熟DC细胞增多，用含靶标的DC细胞培养液进行换液(吸出10ml培养液后再补加10ml新DC培养液)，置二氧化碳培养箱继续培养，37℃；5％CO₂。

贴壁细胞培养第6天，收集所有DC细胞。将培养瓶中的培养液转移到50ml离心管中，培养瓶中加入4℃预冷的生理盐水，反复冲洗后转移到50ml离心管中，重复此步骤，直至将培养瓶中的细胞全部收集到离心管中。将上一步骤的细胞悬液1200rpm，离心10min。用生理盐水重悬细胞，并进行取样计数。细胞悬液1200rpm，离心10min后用生理盐水或细胞培养液重悬即可获得负载抗原的成熟的DC细胞悬液。

收集到的DC细胞分为2部分：第1部分与CIK细胞共同培养MCTL；另一部分作为DC瘤苗回输(5×10⁷)。

6.特异性靶标的配制：

机采方式：肿瘤特异性靶标SAKYGVRKF 150-300微克，每种肿瘤靶标数量大于十种溶于200ml GT-T551培养液中。

7、质控标准：

7.1 DC细胞体外培养扩增倍数，结果见图1、图2。

	100ml	2000ml	4000ml
				1d	﹥1.2*10⁶	﹥1.5*10⁸	﹥2.6*10⁸
3d	﹥2.6*10⁶	﹥3.1*10⁸	﹥5.2*10⁸
				5d	﹥3.5*10⁶	﹥4.9*10⁸	﹥7.1*10⁸
7d	﹥6.9*10⁶	﹥6.0*10⁸	﹥9.2*10⁸
				9d	﹥8.6*10⁶	﹥8.1*10⁸	﹥1.1*10⁹

7.2 靶标单抗检测DC细胞阳性率

靶标活化DC单抗检测阳性率大于90％。

实施例2：靶标单抗检测细胞阳性率的试验方法

结肠癌患者外周血DC细胞表面间接免疫荧光阳性检测步骤

1、取使用DC靶标(SAKYGVRKF)培养液经过5天体外培养的结肠癌患者外周血DC细胞(1x10⁷/ml)200μl，分成两管，实验对照各一管(100μl/管)。

2、用PBA离心洗涤1次，

3、用PBA稀释靶标单克隆抗体20ul加入实验管，对照管加入20ul PBA，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1.5-2h。离心，弃上清。

4、PBA1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。

5、PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体20ul。吹打混匀，4℃孵育30min，避光。(PBA：即PBS加1-2％牛血清白蛋白，加0、1％叠氮钠。)

6、PBS 1ml离心洗涤2次。

7、将细胞重新悬浮于500ulPBS中，混匀，置流式管中，进行流式检测，检测样品细胞浓度1x10⁶/ml。

8、检测结果如下：

试验管阳性细胞98.7％，对照管阳性细胞阴性。

实施例3：DC细胞标志物抗体检测细胞阳性率的试验方法

黑色素瘤患者外周血DC细胞表面间接免疫荧光阳性检测步骤

1、取使用黑色素瘤DC靶标(SAKYGVRKF)培养液经过5天体外培养的黑色素瘤患者外周血DC细胞(1x10⁷/ml)200μl，分成两管，实验对照各一管(100μl/管)。

2、用PBA离心洗涤1次；

3、将FITC-CD86、PE-HLA-DR和APC-CD11c各20μl加入实验管，对照管加入FITC-mouse IgG1、PE-mouse IgG1和APC-mouse IgG1各20μl。

4、轻轻吹打混匀，各管充分混匀后，避光孵育30min。

5、PBS洗涤后上机检测。

6、检测结果见图3，分析如下：

实验管：

HLA-DR⁺细胞：99.74％

CD11c⁺细胞：98.83％

CD86⁺细胞：99.69％

HLA-DR⁺CD11c⁺细胞：97.75％

HLA-DR⁺CD86⁺细胞：99.34％

对照管阴性。

结果说明患者DC细胞在体外与黑色素瘤DC靶标共培养，可以使靶标与DC细胞内的MHC结合并附载细胞膜上使DC细胞活化，被活化的DC细胞将高表达CD11C、CD86、HLA-DR分子并递呈T淋巴细胞成为特异性的识别黑色素瘤细胞的CTL细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种黑色素瘤特异性的靶标，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No 1所示。

2.权利要求1所述的靶标在制备治疗黑色素瘤的制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗为细胞免疫治疗。

4.一种用于细胞免疫治疗体外诱导的制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的靶标。

5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，其为细胞培养液。

6.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，其为树突状细胞的细胞培养液。