CN105521256B - 一种林蛙油平贝母软胶囊及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以林蛙油和平贝母为主要原料的保健食品组合物及其软胶囊剂的制备方法和用途，属于保健食品研制、生产、使用领域。该软胶囊原料由林蛙油5～15份、平贝母3～9份组成。软胶囊内容物配方由林蛙油细粉和平贝母提取物混匀作为活性成分，以大豆油为基质、蜂蜡为助悬剂、吐温80为润湿剂；活性成分与大豆油重量比例为1:1～1:2，蜂蜡用量为大豆油重量的1%～2%，吐温80用量为大豆油重量的0.2%～1%。该软胶囊是通过如下工艺过程制备的:①平贝母提取物的制备；②林蛙油细粉制备；③软胶囊内容物制备；④软胶囊成型。功能评价实验表明，根据本发明生产的保健食品具有增强机体免疫力的功能且无毒副作用，质量符合药典规定。
Description
技术领域
本发明涉及一种以林蛙油和平贝母为主要原料的保健食品组合物及其软胶囊剂的制备方法和用途，具体是指以林蛙油和平贝母提取物为活性成分，大豆油、蜂蜡、吐温80为辅料，该组合物主要用于有助于增强免疫力功能的保健食品，该软胶囊及其制备方法主要用于生产以林蛙油和平贝母为主要原料的软胶囊制剂，属于保健食品研制、生产、使用领域。
背景技术
本发明是以中医学养生理论和药剂学理论为指导，研制一种林蛙油和平贝母为主要原料的软胶囊制剂，该软胶囊所包含的保健食品组合物具有有助于增强免疫力的保健功能；该软胶囊及其制备方法主要用于生产以林蛙油和平贝母为主要原料的软胶囊制剂。该软胶囊内容物配方由林蛙油细粉和平贝母提取物作为活性成分，以大豆油为基质、蜂蜡为助悬剂、吐温80为润湿剂，或者加入保健食品可接受的其他辅助性成分组成。
林蛙油（Ranae Oviductus）又名哈蟆油，为蛙科动物中国林蛙（Rana temporaria chensinensis David）雌蛙的输卵管，经干燥而得。味甘、咸、平，归肺、肾经；具有补肾益精，养阴润肺等功能；用于病后体弱、神疲乏力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血。主要分布于东北三省、华北、西北等地区。林蛙油具有较高的营养保健价值，无论作为药物还是食物，都备受人们的青睐。林蛙油含有丰富的营养物质，如雌醇、孕酮、睾酮等多种生物活性物质、不饱和脂肪酸、维生素及微量元素等多种营养物质。现代医学研究表明,林蛙油具有抗疲劳、延缓衰老、增强机体免疫力、提高应激性等多种药理保健作用，故林蛙油保健食品具有较高的经济价值与社会价值。
平贝母(Fritillariae Ussuriensis Bulbus)，为百合科植物平贝母（Fritillaria ussuriensis Maxim）。的干燥鳞茎，春季采挖，除去外皮、须根及泥沙，晒干或低温干燥。平贝母性味苦、甘，微寒，归肺、心经；具有清热润肺，化痰止咳等功能；用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咳痰带血。主产于东北三省，商品多为栽培品。现代医学研究表明，平贝母主要含有生物碱类成分，具有较显著的止咳、祛痰、平喘、抗溃疡、抗血小板聚集、抗炎等多种药理作用。
免疫力是机体免疫系统对外来入侵的抗原性异物( 细菌、病毒等)的识别、排斥和消灭，以达到生理平衡与稳定的功能。人体的免疫力的强弱主要由遗传基因决定，但是环境因素的影响也很大，如饮食、睡眠、运动、压力等。其中饮食具有决定性的影响，因为有些食物的成分能协助刺激免疫系统，增强机体免疫能力。近年来，中医的扶正和祛邪疗法引起了人们的重视，中医认为“三分治，七分养”，在其理论指导下开发的增强免疫力的保健品越来越得到市场认可。
软胶囊（soft capsules）系指将一定量的液体药物直接包封，或将固体药物溶解或分散在适宜赋形剂中制备成溶液、混悬液、乳状液或半固体，密封于球形或椭圆形的软质囊材中制成的胶囊剂。可用滴制法或压制法制备。本发明以软胶囊为剂型，其优点在于：①起效迅速，有利于生物活性物质的吸收；②可掩盖药物的不良嗅味，提高易吸湿及易氧化的药物稳定性；③可使液态药物固体剂型化，方便携带、服用。
影响软胶囊质量的主要因素之一是软胶囊内容物的性质，软胶囊内容物一般是以植物油为基质，将药物溶解或混悬其中。本发明产品配方中林蛙油、平贝母提取物均难溶于植物油中，故所制备的软胶囊内容物为混悬液，其质量应按照混悬剂质量评定方法进行评定，主要检查沉降容积比、重新分散性、流变学特性等项目。
功能评价实验表明，根据本发明组合物配方生产的保健食品具有有助于增强免疫力功能，且功能显著。
制剂质量检查表明，根据本发明方法所生产的软胶囊剂外观整洁，无黏结、变形、渗漏或囊壳破裂等现象，无异臭；装量差异与崩解时限符合《中华人民共和国药典》2015版（四部）制剂通则“胶囊剂”项下规定。
检索中国专利及文献数据库未见与本发明软胶囊组合物配方及制备方法和用途相似的专利及研究报导，本发明设计理论和思路创新。以本发明为基础开发林蛙油和平贝母为主要原料的保健食品，市场需求前景广阔。
发明内容
本发明的技术方案提供了一种以林蛙油和平贝母为主要原料的保健食品组合物，该组合物具有有助于增强免疫力功能。本发明还提供了以林蛙油和平贝母作为主要原料制备软胶囊的方法。
本发明提供了一种具有有助于增强免疫力功能的保健食品组合物，它是由下述重量配比的原料制成的制剂：林蛙油 5～15份、平贝母3～9份。
进一步优选，它是由下述重量配比的原料制成的制剂：林蛙油5份、平贝母3份。
本发明所制备的软胶囊内容物，是由林蛙油细粉和平贝母提取物混匀作为活性成分，以大豆油为基质、蜂蜡为助悬剂、吐温80为润湿剂，或者加入保健食品可接受的其他辅助性成分制备而成。该软胶囊内容物是由下述配比的成分组成：活性成分与大豆油重量比例为1:1～1:2，蜂蜡用量为大豆油重量的1%～2%，吐温80用量为大豆油重量的0.2%～1%。
进一步优选，该软胶囊内容物是由下述配比的成分组成：活性成分与大豆油重量比例为1:1.5，蜂蜡用量为大豆油重量的1.5%，吐温80用量为大豆油重量的0.5%。
本发明软胶囊制剂制备的方法：
①平贝母提取物的制备：按上述保健食品组合物配方称取平贝母适量，采用浓度为40%-90%乙醇为溶剂，提取2次，溶剂用量分别为料液比1:10、1:8，提取时间分别为2h、1h，收集提取液，在60℃-80℃浓缩、干燥即得。
②林蛙油细粉制备：按上述保健食品组合物配方称取林蛙油适量，采用乳钵或胶体磨研磨粉碎，粉碎粒度为过100目筛（-0.154mm，+0.150mm）,即得。
③软胶囊内容物制备：按上述软胶囊内容物配方，取上述制备的平贝母提取物和林蛙油细粉混匀作为活性成分，以大豆油为基质、蜂蜡为助悬剂、吐温80为润湿剂，混匀，制备软胶囊剂内容物；
④软胶囊成型：取上述内容物置于软胶囊生产设备中，以明胶-甘油或其他高分子材料为囊材，采用压制法或滴制法制备软胶囊。
本发明的组合物主要用于有助于增强免疫力功能的保健食品。
本发明的制备方法主要用于生产以林蛙油和平贝母为主要原料的软胶囊制剂。
具体实施方式
以下结合实验例和实施例对本发明进行更为详细的说明。
实验例1 平贝母中总生物碱含量测定方法的研究
以总生物碱含量为评价指标。建立酸性染料比色法测定平贝母中总生物碱含量。
溶液的配制
缓冲溶液：取0.2mol·L-1邻苯二甲酸氢钾溶100mL（4.08g），用0.2mol·L-1氢氧化钠溶液约50mL（0.4g）调节pH值为5.0，即得。
溴百里香芬兰溶液：称取0.03 g 溴百里香酚蓝，溶于 0.5mL，1mol·L-1氢氧化钠溶液中，加蒸馏水稀释至 100mL摇匀即得。
对照品溶液：精密称取贝母素甲对照品2.55mg，用氯仿定容于25mL 容量瓶中，作为对照品溶液。
样品溶液的制备：精密称取平贝母粉末（过65目筛）2.00g，按照药典相关要求制备。
检测波长的确定
精密吸取贝母甲素对照品溶液 4.0mL 至 25mL容量瓶中，加 5mL pH=5 的缓冲液，2mL溴百里香酚蓝试液，再加氯仿定容，充分摇匀，移入分液漏斗中，放置45 min。取氯仿层（下层液）用干燥滤纸过滤，取续滤液，用氯仿调空白，于紫外可见分光光度计 350～500nm 处，测吸光度。
测定结果表明对照品溶液在408-412nm 处有最大吸收, 结果选择410nm作为测定波长。
线性关系的考察
分别精密吸取贝母素甲对照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 至 25mL 容量瓶中，按2.2项下方法进行比色测定生物碱含量与吸光度的关系，以贝母素甲的含量（ug·mL-1）为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。得回归方程为：Y=0.0424X+0.1454,r =0.9908。结果表明贝母素甲浓度在4.08~20.40ug·mL-1范围内线性关系良好。
精密度考察
精密吸取贝母素甲对照品溶液5mL, 按2项下方法进行比色测定，重复测定5次,以吸光度值计算RSD值为0.086%（n=5），表明仪器精密性良好。
稳定性考察
精密吸取样品溶液5mL，在室温下于0、2、4、6、8h按2项下方法进行比色测定，以吸光度值计算RSD值为2.04%（n=5），表明样品溶液在8h内稳定。
重复性考察
精密吸取样品溶液 5mL，按2项下的方法进行比色测定，重复测定5次,以吸光度值计算RSD值为1.53%（n=5），表明该方法精密性良好。
药材含量测定
分别精密称取平贝母药材5份，按2项下方法操作测定，按以下公式计算平贝母药材中总生物碱的含量为0.237%（mg/g）,RSD值为1.43%（n=5），结果见表1。
表1药材含量测定结果
（y—吸光度，n—稀释倍数，w—试样质量g）
实验例2 平贝母中总生物碱提取工艺的研究
采用乙醇回流提取法，以总生物碱提取量为评价指标，通过正交试验设计优化料液比、提取时间、乙醇浓度等提取工艺参数。
原料处理
取平贝母原料药除去杂质，洗净、烘干、捣碎，得粗粉备用。
提取液样品制备
平贝母粗粉→乙醇回流提取2次→滤过，合并两次滤液→ 滤液减压浓缩，蒸干→残渣加三氯甲烷定容至25mL容量瓶中→精密量取2mL至25mL量瓶中，即得。
单因素试验设计
3.1 提取溶剂的选择
精密称取平贝母粗粉2份，每份10.00g，用水、70%乙醇分别浸泡1h,加热煎煮提取两次，时间分别为1.5h、1h，料液比分别为1:10和1:8，照2项下方法进行提取，并照实验例1“检测波长的确定”项下测定吸光度，结果见表2。
表2不同提取溶剂对总生物碱提取率的影响
结果如上表所示，乙醇对总生物碱提取效果较好,故选用一定浓度的乙醇提取较为合适。
浸泡时间及吸水率的考察
在平贝母药材粗粉中，加入10倍量70%乙醇浸泡，每隔15min沥去溶剂，称量药渣重量，至不在变化为止。结果为药材在1h内吸水完全，重量不再变化，故将浸泡时间定为1h，药材吸水率为173.37%。
正交试验设计
以提取液中总生物碱含量（以吸光度值表示）为指标，采用L9（33）正交试验表，根据单因素试验结果结合相关文献，优选溶剂用量、提取时间、乙醇浓度3个提取工艺参数，因素与水平见表3，试验安排及结果见表4。
方法：精密称取平贝母粗粉适量，按正交试验方案，照上述方法制备提取液样品，测定样品中总生物碱含量（以吸光度值表示）。
表3正交试验设计因素水平表
表4正交试验安排及结果
5 正交试验结果分析
以总生物碱提取率（以吸光度值表示）为考察指标，方差分析结果见表5，结果表明，因素A、B对总生物碱提取率无显著性影响，C因素对总生物碱提取率有显著性影响（p<0.05），各因素 作用主次为C>A>>B为进一步确定最佳提取方案，进行多水平均值检验。
多水平均值检验结果见表6，结果表明，A3>A1>A2 ，B2>B1>B3 ，C3>C2>C1，所以由以上分析得最佳提取方案为A3B2C3，即溶剂用量为10，8倍；提取时间为2，1h；乙醇浓度为80%。
表5方差分析结果
表6多水平均值检验结果
6 验证试验
称取同批次药材3份适量，对最佳工艺A3B2C3进行试验，结果见表7。
表7验证试验结果
结果总生物碱提取率分别为86.08%、84.81%、83.12%，平均提取率为84.67%，RSD值为0.02%，表明优化后的提取工艺稳定、可行。
浸膏收率测定
取全部提取液，减压浓缩回收溶剂至粘稠状，转移至干燥恒重的蒸发皿中放置于65℃鼓风干燥箱中干燥至恒重后，于干燥器中冷却半小时，迅速称重。计算其出膏率16.41%。
实验例3 软胶囊内容物制备工艺研究
本研究以基质吸附率和沉降体积比为评价指标，确定内容物制剂处方和制备方法。首先采用单因素平行试验，对影响软胶囊内容物的各种因素进行考察，筛选基质、润湿剂、助悬剂种类，原料粉碎粒度等处方和工艺条件。然后采用正交试验设计，优选基质及辅料的用量，确定内容物制剂处方比例，并采用研磨分散法制备软胶囊内容物。
评价指标的测定方法
1.1 基质吸附率(base adsorption)的测定
基质吸附率指1g固体药物制成软胶囊内容物混悬液时所需液体基质的的克数。
方法：精密称取林蛙油粉末及平贝母干浸膏粉末适量，分量少次地加入分散介质，混合均匀。观察混悬液能从与液面呈45°角的药刀上稳定、连贯、均匀而不呈“小球”状滴下为止。计算基质吸附率。
公式：基质吸附率=基质重量/固体重量
1.2 沉降体积比（sedimentation rate）的测定
将混合均匀的混悬液转移至带有刻度的10mL具塞试管中，用力振摇1min，静置，测量混悬液的液面高度，记为H0，每隔一段时间观察沉降物高度，至高度不再变化为止，记下沉降面不再改变时的沉降物高度，记为H，计算沉降体积比。
公式：沉降体积比（F）=H/ H0
F值在0-1之间，F值越大，表明沉降物高度越接近混悬液高度，混悬液越稳定。
单因素试验设计
2.1 内容物基质的筛选
取过100目筛的林蛙油粉末和平贝母干浸膏粉末适量，再分别加入大豆油、花生油、玉米油，按1.1和1.2项下方法测定基质吸附率和沉降体积比。重复进行3次平行试验，结果见表8。
表8不同植物油作为基质的基质吸附率和F值（
,n=3）
由表8可知，在三种基质中，大豆油的基质吸附率显著低于其他两种，即采用大豆油作为内容物的基质，辅料用量少。
三种基质F值无显著性差异，为考察加入助悬剂后对混悬液沉降稳定性的影响，在三种分散介质中分别加入1%的助悬剂（蜂蜡），测定F值。
方法：取三种基质适量，分别加入1%的蜂蜡，70℃水浴加热使蜂蜡溶解，放冷后，各加入过100目筛的林蛙油粉末和平贝母干浸膏粉末适量，混合均匀，按1.2项下方法测定F值，重复进行3次平行试验，结果见表9。
表9 三种基质加入助悬剂后混悬液的F值（
,n=3）
由表9可知，加入1%蜂蜡后，大豆油组F值显著高于其他两组，结合表8和表9结果，选用大豆油为分散基质，辅料用量少，内容物混悬液沉降稳定性高。
林蛙油粉末适宜粒径的确定
取大豆油适量，加入1%蜂蜡，再分别加入筛分粒径为A（-0.180mm，+0.154mm）、B（-0.154mm，+0.150mm）、C（-0.150mm，+0.100mm）的林蛙油粉末适量，振荡，混合均匀后，按1.2项下方法，观察林蛙油粉末的沉降情况，记录不同时间段的F值和完全沉降所需时间。重复进行3次平行试验，考察不同粒径林蛙油粉末混悬液的沉降稳定性，结果见表10。
表10不同粒径林蛙油粉末混悬液的沉降稳定性（
,n=3）
由表10可知，粉末筛分粒径为A时与为B、C时，沉降体积及完全沉降时间均有显著差异，即粉末粒度小，混悬液中颗粒沉降速度越慢，完全沉降所需时间越长；为B和C时，F值和完全沉降时间均无显著差异，即在筛分粒径达到B时对混悬液沉降稳定性已无显著影响，故将林蛙油粉末筛分粒径确定为（-0.154mm，+0.150mm），即过100目筛即可。
助悬剂的筛选
取大豆油适量，再分别加入1%单硬脂酸甘油酯和蜂蜡，70℃水浴加热使单硬脂酸甘油酯和蜂蜡溶解，放冷后，分别加入过100目筛的林蛙油粉末和平贝母干浸膏粉末适量，混合均匀，按1.2项下方法，观察药物粉末的沉降情况，记录不同时间段的F值。重复进行3次平行试验，考察不同种类助悬剂对混悬液稳定性的影响，结果见表11。
表11不同种类助悬剂对混悬液稳定性的影响（
,n=3）
由表11可知，加入蜂蜡后的混悬液中颗粒的沉降速率较加入单硬脂酸甘油酯缓慢，混悬液稳定性好，故选用蜂蜡作为助悬剂。
润湿剂的筛选
取大豆油适量，加入1%蜂蜡，70℃水浴加热使蜂蜡溶解，放冷后，分别加入1%的吐温80和司盘80，混合均匀，于混合液中各加入过100目林蛙油粉末和平贝母干浸膏粉末适量，混合均匀，按1.2项下方法，观察药物粉末的沉降情况，记录不同时间段的F值。重复进行3次平行试验，考察不同种类润湿剂对混悬液稳定性的影响，结果见下表。
表12不同种类润湿剂对混悬液稳定性的影响（
,n=3）
由表12可知，加入润湿剂之后混悬液中颗粒的沉降速率减慢，颗粒分布均匀，混悬效果较好，且吐温80的润湿效果较司盘80好，故选吐温80为润湿剂。
正交试验设计
以F值为考察指标，采用L9（33）正交试验设计，优选制剂处方原辅料配比，确定最佳制剂处方。因素水平见表13，试验安排与结果见表14。
方法：精密称取林蛙油粉末和平贝母干浸膏粉混合物适量，按试验方案比例加入辅料，混匀，测定F值。
表13正交试验设计因素水平表
表14正交试验安排及结果
4 正交试验结果分析
以F值为考察指标，方差分析结果见表15，结果表明，因素A、B、C对F值均无显著性影响，各因素作用主次为B>C>A，为进一步优选，进行多水平均值检验。
多水平均值检验结果见表16，结果表明，A2＞A1＞A3 ，B3＞B2＞B1 ，C1＞C2＞C3，考虑到生产成本及服用量问题，确定最佳处方比例为A1B3C1。即药物与基质比例为为1:1.50；助悬剂用量1.5%；润湿剂用量0.5%。
表15方差分析结果
表16多水平均值检验结果
注：* 均数差有显著差别。
验证试验
精密称取林蛙油粉末和平贝母干浸膏粉混合物3份，对最佳制备工艺A1B3C1进行验证。结果F值分别为0.979、0.958、0.959，RSD值为0.02%，表明优化后的制备工艺稳定、可行。
6 软胶囊成型
将内容物主成分与基质、助悬剂、润湿剂混合均匀，置于软胶囊机中，按照软胶囊一般制法进行滴制法或压制法制备，所制备的软胶囊外观应整洁、无黏结、变形、渗漏或囊壳破裂等现象，无异臭。
实验例4 林蛙油平贝母软胶囊质量标准的研究
通过对软胶囊及其内容物进行性状、鉴别、检查、含量测定等方面研究，初步建立本品的质量标准。供试样品为根据本发明生产的三批林蛙油平贝母软胶囊（批号：20150401、20150402、20150403）。
性状
本品为椭圆形软胶囊剂，内容物为棕褐色粘稠状液体，气微香，味微苦。
处方中平贝母的定性鉴别
供试品溶液制备：取供试样品内容物适量（相当于平贝母原药材10g），按药典相关要求制备。
对照药材溶液制备：取平贝母原药材10g，同法制成对照药材溶液。
阴性对照溶液制备：取不含平贝母干浸膏粉的软胶囊内容物适量，同法制成阴性对照溶液。
对照品溶液制备：精密称取贝母素甲对照品1.00mg，加0.5mL甲醇使溶解，作为对照品溶液。
薄层色谱鉴别方法：照薄层色谱法（《中国药典》2015版（四部）通则0502）试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液和阴性对照溶液，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨水-水（10:1:0.5:0.05）为展开剂，展开，取出，晾干，以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液显色。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，阴性对照色谱五次斑点。
检查
3.1内容物流动性检查
黏度是与软胶囊内容物稳定性及质量相关的最重要的流变学参数，因此本研究中采用平行板式旋转黏度计对所制备的混悬型内容物的黏度进行测定，绘制流动特性曲线，通过流动曲线形状判断混悬液的流动类型，以评价其流变学性质。测定结果表明软胶囊内容物混悬液为假塑性流体，可有效地减缓混悬液中微粒的沉降速度。
装量差异检查
依据《中国药典》2015版（四部）通则0103“胶囊剂”项下装量差异有关规定，取所制备软胶囊10粒，精密测定，结果表明所制备软胶囊装量差异符合规定，
3.3崩解时限检查
依据《中国药典》2015版（四部）通则0103“胶囊剂”项下崩解时限有关规定，取所制备软胶囊6粒，置于37℃±1℃的人工胃液（取胃蛋白酶10g，加水约800mL与稀盐酸16.4mL，摇匀后，加水稀释至1000mL，即得。）中进行检查,应在1小时内全部崩解。结果表明所制备软胶囊崩解时限符合规定。
内容物中总生物碱的含量测定
采用酸性染料比色法进行软胶囊中总生物碱的含量测定。
溶液的配制
缓冲溶液、溴麝香草芬兰溶液、对照品溶液配制照实验例1“溶液的配制”项下。
供试品溶液的制备：取供试样品内容物适量（相当于平贝母原药材1.00g）5份，置具塞锥形瓶中，加浓氨水3mL，浸润1小时，加氯仿-甲醇(4:1,v/v)混合溶液40mL，置80℃水浴加热回流2小时，放冷，滤过，用适量氯仿-甲醇(4:1,v/v)混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液与滤液合并，蒸干，残渣加氯仿使溶解，转移至25mL量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀即得。
线性关系考察、精密度考察同实验例1相应项下。
稳定性考察
精密吸取供试品溶液2mL，在室温下于0、30、60、120、180min按实验例1“检测波长的确定”项下方法分别测定吸光度。以吸光度计算RSD值为1.92%（n=5），表明待测样品液在一定时间内稳定。
重复性考察
精密吸取供试品溶液 2mL，按上述方法进行比色测定，重复进样5次，以吸光度计算RSD值为2.00%（n=5），表明该方法精密性良好。
样品含量测定
精密称取3批供试样品内容物，制成供试品溶液，按上述方法进行比色测定，计算软胶囊内容物中总生物碱含量，结果为软胶囊内容物中总生物碱平均含量为17.61μg·g-1。
内容物中1-甲基海因的含量测定
采用RP-HPLC法进行软胶囊中1-甲基海因的含量测定。
色谱条件
色谱柱：Diamonsil ODS柱（5μm,250×4.6mm）,检测波长：215nm，流动相：水，流速：0.5mL/min，柱温：25℃，进样量：10μL。
溶液的配制
供试品溶液：取供试样品内容物适量（相当于林蛙油粉末2g），按照药典相关要求制备。
对照品溶液：精密称取1-甲基海因对照品，加水制成每1mL含2μg的溶液，作为对照品溶液。
线性关系考察
精密吸取1-甲基海因对照品溶液 0.1、0.5、1.0、2.0、2.5mL 至 50mL容量瓶中，按5.1项下色谱条件进样分析，以1-甲基海因的含量（ug·ml-1）为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线。得回归方程为：Y=8143X+359.8,r =0.9998。结果表明1-甲基海因浓度在0.4~1.0ug·ml-1范围内线性关系良好。
精密度考察
精密吸取1-甲基海因对照品溶液，按5.1项下色谱条件进样分析，重复进样5次，以峰面积计算RSD值为0.86%（n=5），表明仪器精密性良好。
稳定性考察
精密吸取供试品溶液，于0、2、4、8、12h按5.1项下色谱条件进样分析，以峰面积计算RSD值为0.93%（n=5），表明供试品溶液在12h内稳定。
重复性考察
精密吸取供试品溶液，按5.1项下色谱条件进样分析，重复进样5次，以峰面积计算RSD值为1.67%（n=5），表明该方法精密性良好。
样品含量测定
精密称取3批供试样品内容物，制成供试品溶液，按5.1项下色谱条件测定，计算软胶囊内容物中1-甲基海因含量，结果软胶囊内容物中1-甲基海因平均含量为8.56μg·g-1。
实验例5 初步稳定性试验研究
依据《中国药典》2015版（四部）指导原则9001的要求，考察了根据本发明生产的林蛙油平贝母软胶囊在影响因素（强光）试验、加速试验条件下的稳定性。
影响因素（强光照射）试验
取林蛙油平贝母软胶囊3批，置于培养皿内，于温度为25℃，照度为4500lx±500lx条件下放置10d，分别于第5d与第10d取样，考察其外观、崩解、总生物碱含量、内容物沉淀状况。试验结果表明所制备软胶囊各考察项目与0d无明显变化，说明其对光线稳定。
加速试验
取所制备软胶囊3批，置于塑料包装瓶中，于温度为40℃±2℃，湿度为75%±5%条件下放置3个月，分别于第1、2、3月末取样，考察其外观、崩解、总生物碱含量、内容物沉淀状况，结果见下表17。结果表明所制备软胶囊各考察项目与0时无明显变化，说明其稳定性较好。
表17软胶囊加速试验结果
实施例1 林蛙油平贝母软胶囊制备
处方：
制备方法：
称取平贝母，采用浓度为80%乙醇为溶剂，提取2次，溶剂用量分别为料液比1:10、1:8，提取时间分别为2h、1h，收集提取液，在70℃浓缩、干燥，即得平贝母提取物；
称取林蛙油，采用乳钵或胶体磨研磨粉碎，粉碎粒度为过100目筛,即得林蛙油细粉；
取上述制备的平贝母提取物和林蛙油细粉混匀，加入大豆油、蜂蜡、吐温80，混匀，即得软胶囊内容物；
取上述软胶囊内容物置于软胶囊生产设备中，以明胶-甘油为囊材，采用压制法或滴制法制备，即得。
实施例2 林蛙油平贝母软胶囊有助于增强免疫力功能的检验和评价
依据卫生部颁发的《保健食品功能学评价程序和检验方法规范》中有助于增强免疫力功能检验方法，以脏器/体重比值、细胞免疫功能测定、体液免疫功能测定、单核—巨噬细胞功能测定、NK细胞活性测定结果为评价指标，对林蛙油平贝母软胶囊进行了有助于增强免疫力功能检验和评价。
实验动物与实验环境
无特定病原体(Specific Pathogen Free, SPF) 昆明种雄性小鼠150只（体重18-22 g）、豚鼠5只（体重250-300 g）由延边大学实验动物中心提供（实验动物生产许可证号SCXK(吉)2011-0007）。饲料由延边大学实验动物中心提供。实验室环境为SPF级动物实验室。室温20±2 ℃；湿度50~60%。
采用随机分组的方法，依据各检测项目的需要将实验小鼠分成五个大组，各30只。再根据相关规定与实验需要将每个大组实验小鼠分成空白对照组、中剂量组、高剂量组，每组10只。
受试样品的制备与给药剂量
受试样品为根据本发明生产的三批林蛙油平贝母软胶囊（批号：20150401、20150402、20150403），去除囊皮取其内容物混合均匀，即得。
受试样品的人体口服推荐剂量为0.1g/d·kg体重，小鼠的等效剂量相当于人体推荐剂量的10倍。故分别以人体推荐剂量的10倍。30倍作为中（1g/d·kg体重）、高（3g/d·kg体重）剂量给药。采取灌胃法，每日灌喂1次，空白对照组以大豆油灌胃，给药期间动物自由摄水、摄食，各受试组小鼠连续灌胃30 d后，测定各项指标。
溶液的配制
绵羊红细胞（SRBC）：用20mL无菌注射器采集绵羊颈静脉血，将所取绵羊颈静脉血迅速放入装有小玻璃珠的灭菌锥形瓶中，按同一方向摇动脱去纤维，然后用适量生理盐水洗涤，在2000rpm条件下离心10min，弃去上层液，取下层沉淀重复以上操作2次后，将所得绵羊红细胞放入4℃冰箱内保存备用，用时以生理盐水配制成相应浓度即可。
补体：采集豚鼠血，离心，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），与压积SRBC以5：1（v/v）比例混合，4℃冰箱放置30~60min，间或震荡，在2500rpm条件下离心15min分离血清，分装，-80℃低温冰箱保存。用时以SA缓冲液按1：10（v/v）比例稀释。
完全培养液：将RPMI-1640培养液过滤除菌，用前加入10％FBS，青霉素（100U/mL），链霉素（100μg·L-1），用无菌的1mol·L-1的HCL或1mol·L-1的NaOH调节pH至7.0-7.2，即完全培养液。
ConA液： 用双蒸水配制成100ug·mL-1的溶液，过滤除菌，-20℃低温冰箱保存。
无菌Hank's液：用前以3.5％的无菌NaHCO3调节pH至7.2-7.4。
MTT液：将5mgMTT溶于1mLpH7.2的PBS液中即得，现用现配。
酸性异丙醇溶液：96mL异丙醇加入4mL1mol·L-1的HCl溶液即得。
表层培养基:称取1g琼脂糖加适量双蒸水，加热使溶解，继续加双蒸水至100mL，即得，现用现配。
注射用墨汁：将印度墨汁原液用生理盐水稀释4倍。
脏器/体重比值测定
小鼠称重后颈椎脱臼处死，取完整胸腺和脾脏称重，计算脏器/体重比值。
细胞免疫功能测定
5.1 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）
小鼠连续灌胃30 d后，脱颈椎处死，参照文献方法测定，小鼠无菌取脾，置于200目筛网上，用大号注射器内芯边轻轻研磨边用无菌Hank's液冲洗，制成单个细胞悬液，离心5min，弃去上清液，加适量红细胞裂解液裂解。用无菌Hank's液洗涤2次，每次在1000rpm条件下离心10min。然后将细胞悬浮于4mL的完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为3×106个/mL。然后将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μL ConA 液（相当于7.5μg·mL-1），另一孔作为对照，置5％二氧化碳，37℃培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含BSA的RPMI-1640培养液，同时加入MTT（5mg·mL-1）50μl /孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，人工吹打混匀，完全溶解紫色结晶。于570nm波长处测定光密度值(OD)。淋巴细胞的增殖能力表示方法：用加ConA孔的光密度值减去未加ConA孔的光密度值。
绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠迟发型变态（DTH）反应（足跖增厚法）
小鼠腹腔注射2％(v/v)SRBC（0.2mL/只，约1×108个SRBC）致敏4d后，用游标卡尺测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC（20μL/只，约1×108个SRBC），于注射后24h用游标卡尺测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。以致敏前后足趾厚度（足趾肿胀程度）差值来表示DTH的程度。
小鼠外周血T淋巴细胞表面活化抗原的检测（FCM）
小鼠连续灌胃30 d后，脱颈椎处死，参照文献方法测定[29]，采小鼠眼球血, 肝素抗凝, 取50μL全血与1μL FITC Hamster Anti-Mouse CD69和5μL PE Ratanti-Mouse CD3Molecular Complex抗体混合, 室温下避光孵育30min , 用0.5mL溶血素准确裂解红细胞10min,在1300rpm条件下离心5min获取有核细胞, 用PBS缓冲液洗涤2 次后上流式细胞仪分析。
小鼠脾脏T淋巴细胞表面活化抗原的检测（FCM）
小鼠连续灌胃30 d后，脱颈椎处死，参照文献方法测定，小鼠无菌取脾，置于200目筛网上，用大号注射器内芯边轻轻研磨边用Hank's液冲洗，将所得脾细胞制成浓度为5×105的单细胞悬液，与1μLFITC Hamster Anti-Mouse CD69和5μL PE Ratanti-Mouse CD3Molecular Complex抗体混合, 室温下避光孵育30min , 用0.5mL溶血素准确裂解红细胞10min,在1300rpm条件下离心5min获取有核细胞, 用PBS缓冲液洗涤2 次后上流式细胞仪分析。
体液免疫功能测定
6.1抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）
小鼠腹腔注射2％(v/v)SRBC（0.2mL/只，约1×108个SRBC）致敏，免疫4d后，将小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，用Hank's液制成细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、离心两次，最后将细胞悬浮在 5mL RPMI-1640 液中。将表层培养基加热溶解后与50 μL20%SRBC（生理盐水配制，v/v）、200μL脾细胞悬液先后加入含有0.5mL顶层的试管中，迅速混匀，倒入六孔板中并铺平顶层混合液，每个样本做两个平行孔。放入37℃、5% CO2培养箱中孵育1 h，然后每孔加入500μL以SA液稀释的补体(1:10)，继续温育1.5 h后计数溶血空斑数 ，以空斑数/106脾细胞表示。
血清溶血素的测定（血凝法）
小鼠腹腔注射2％(v/v)SRBC（0.2mL/只，约1×108个SRBC）致敏，免疫4d后，取眼球血，收集血清，用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL，再加入100μL 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3 h，观察血球凝集程度。
单核-巨噬细胞吞噬功能的测定
7.1小鼠碳廓清试验
小鼠尾静脉注入稀释4倍的印度墨汁，每10g体重0.1mL，墨汁注入后立即计时，于第2、10min分别从眼内眦静脉丛取血20μL，并立即将其转移至 2mL 0.1%Na2CO3溶液中，摇匀。以1%Na2CO3溶液为空白对照，用可见分光光度计于600nm波长处测定光密度值（OD）。
将小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏、脾脏，用滤纸吸干表面血污，分别称其重量。以吞噬指数评价小鼠碳廓清的能力。按以下公式计算吞噬指数a。
其中OD1 、OD2分别为第2、10min时所取血样的光密度值，t2－t1为两次取血样时间差。
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验（FCM）
小鼠连续灌胃30 d后，脱颈椎处死，参照文献方法测定。荧光微球预调理:用PBS缓冲液配制1% BSA 溶液，按1:100稀释微球储存液（FluoSpheres® Carboxylate-ModifiedMicrospheres)，即将80μL微球储存液加入到8mL BSA 溶液中，37℃孵育30min后, 超声处理5min。小鼠腹腔巨噬细胞分离: 实验前4 d前腹腔注射0.2 mL2％(v/v)SRBC (激活巨噬细胞), 实验当天将小鼠颈椎脱臼处死, 暴露腹膜，经腹腔注射7mLHank's液(含5% FBS) ,将小鼠腹部向上置于摇床上摇晃3min，, 剪开腹部, 吸取腹腔洗液至离心管中，冰浴。细胞计数，取6×105个细胞至1.5mLPCR管中，每管加入220μL beads悬液。吞噬作用:巨噬细胞与beads室温避光孵育30 min后, 以2mL冷PBS液轻柔洗涤2次(洗除多余未消化的beads), 然后用细胞刮刮下尚未脱壁的巨噬细胞, 收集细胞悬液, 75μm过滤器过滤, 根据细胞密度用0.2mLPBS液定容后上流式细胞仪分析。根据下列公式计算吞噬百分率和吞噬指数。吞噬百分率（%）=（吞噬荧光微球的巨噬细胞数）/（计数的巨噬细胞数）×100，吞噬指数 =（被吞噬的荧光微球总数）/（计数的巨噬细胞数）。
细胞活性测定
8.1小鼠外周血NK细胞表面活化抗原的检测（FCM）
小鼠连续灌胃30 d后，参照文献方法测定。采小鼠眼球血, 肝素抗凝, 取50μL全血与1μLFITC Hamster Anti-Mouse CD69和5μL PE Ratanti-Mouse NKG2D抗体混合, 室温下避光孵育、裂解红细胞、离心、洗涤，上流式细胞仪分析。
小鼠脾脏NK细胞表面活化抗原的检测（FCM）
小鼠连续灌胃30 d后，参照文献方法测定。小鼠无菌取脾，置于200目筛网上，用大号注射器内芯边轻轻研磨边用Hank's液冲洗，将所得脾细胞制成浓度为5×105的单细胞悬液，与1μLFITC Hamster Anti-Mouse CD69和5μL PE Ratanti-Mouse NKG2D抗体混合, 室温下避光孵育、裂解红细胞、离心、洗涤，上流式细胞仪分析。
流式细胞仪分析
标记的细胞经前向散射(Forward scatter FSC) 及侧向散射(Side scatterSSC), 在二维Dot-Plot 图中划出淋巴细胞区, 然后对淋巴细胞作异硫氰酸（FITC）和藻红色素（PE ）荧光强度检测, 其中FITC为荧光1 ( F L1) , 滤光片带通为530±15nm, PE为荧光2 ( FL 2) , 滤光片带通为585±21nm, 数据显示于双色散点图( FL1vs FL2) 中。测定时各荧光通道均以相同类型AF染色作为同型对照, 计数10000个淋巴细胞，全部数据经FACS Cailbur 流式细胞仪及CellQuest 软件获取和分析。
统计学处理
所有数据均采用SSPS19.0统计软件进行方差分析，首先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值≥F0.05,P≤0.05表明各组间差异有显著性。
结果判定
根据《保健食品功能学评价程序和检验方法》增强免疫力功能判定，在细胞免疫功能测定、体液免疫功能测定、单核—巨噬细胞功能测定、NK细胞活性测定四个方面任两个方面结果为阳性，可判定所制备软胶囊内容物具有增强免疫力功能。
结果
12.1 对小鼠脏器/体重比值的影响
表18对小鼠胸腺、脾脏重量的影响
由上表可知，以小鼠为研究对象，以不同剂量软胶囊内容物对小鼠灌胃30 d后，与对照组相比，各剂量组脏器/体重比值均无显著性差异（P＞0.05）。
对小鼠细胞免疫的影响
12.2.1对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响
表19对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响
注：**表示与对照组比较具有极显著性差异（P＜0.01）
由上表可知，以小鼠为研究对象，以不同剂量软胶囊内容物对小鼠灌胃30 d后，与对照组相比，中剂量组小鼠淋巴细胞增殖能力极明显提高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
对小鼠迟发型变态反应（DTH）的影响
表20对小鼠迟发型变态反应（DTH）的影响
由上表可知，以小鼠为研究对象，以不同剂量软胶囊内容物对小鼠灌胃30 d后，与对照组相比，各剂量组小鼠足趾肿胀程度无显著性差异（P＞0.05）。
对小鼠外周血及脾脏T淋巴细胞表面活化抗原的影响
平贝母醇提物对小鼠外周血T淋巴细胞CD69＋/CD3＋比值的影响，空白对照组为4.34%，中剂量组为6.52% 高剂量组为8.26%
表21对小鼠外周血及脾脏T细胞表面活化抗原的影响
注：*表示与对照组比较具有显著性差异（P＜0.05）
由上表可知，以小鼠为研究对象，以不同剂量软胶囊内容物灌胃30 d后，与对照组相比，高剂量组小鼠外周血T淋巴细胞CD69＋/CD3＋比值明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中、高剂量组小鼠脾脏T细胞CD69＋/CD3＋比值略有增高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。
对小鼠体液免疫的影响
12.3.1对小鼠抗体生成细胞数的影响
表22对小鼠抗体生成细胞数的影响
由上表可知，以小鼠为研究对象，以不同剂量软胶囊内容物对小鼠灌胃30 d后，与对照组相比，各剂量组小鼠抗体生成细胞数无显著性差异（P＞0.05）。
对小鼠血清溶血值的影响
表23对小鼠血清溶血素抗体积数的影响
由上表可知，以小鼠为研究对象，以不同剂量软胶囊内容物对小鼠灌胃30 d后，与对照组相比，各剂量组小鼠血清溶血素抗体积数无显著性差异（P＞0.05）。
对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响
12.4.1对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清的影响
表24对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清的影响
由上表可知，以小鼠为研究对象，以不同剂量软胶囊内容物对小鼠灌胃30 d后，与对照组相比，各剂量组小鼠单核-巨噬细胞吞噬指数无显著性差异（P＞0.05）。
对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球的影响
表25对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球的影响
注：*表示与对照组比较具有显著性差异（P＜0.05）
由上表可知，以小鼠为研究对象，以不同剂量软胶囊内容物对小鼠灌胃30 d后，与对照组相比，中剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球吞噬百分率具有显著性差异（P＜0.05）。
对小鼠NK细胞活性的影响
表26对小鼠外周血及脾脏NK细胞表面活化抗原的影响
注：**表示与对照组比较具有极显著性差异（P＜0.01）
由表上可知，以小鼠为研究对象，以不同剂量软胶囊内容物对小鼠灌胃30 d后，与对照组相比，中剂量组小鼠脾脏NK细胞CD69＋/NKG2D＋比值极明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
结果
本研究结果显示，以小鼠为研究对象，以不同剂量受试样品对小鼠灌胃30 d后，能显著提高小鼠淋巴细胞增殖能力（P＜0.01）、能提高小鼠外周血T淋巴细胞CD69＋/CD3＋比值（P＜0.05）、能显著提高小鼠脾脏NK细胞CD69＋/NKG2D＋比值（P＜0.01）、能增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球吞噬百分率（P＜0.05）。根据《保健食品功能学评价程序和检验方法》可判定受试样品具增强机体免疫力的功能。
上述功能评价实验和动物试食实验表明，根据本发明生产的林蛙油平贝母软胶囊具有增强机体免疫力的功能且无毒副作用。
本发明的保护范围不能认为只局限于上述具体实施方式及具体实例。对所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的基本前提下，还可以做出若干简单推演或等同替换，这些等同替换方案仍然将被视为在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种林蛙油平贝母软胶囊的制备方法，其特征在于：①取平贝母适量，采用浓度为80％乙醇为溶剂，回流提取2次，溶剂用量分别为料液比1:10、1:8，提取时间分别为2h、1h，收集提取液，在60℃-80℃浓缩、干燥，即得平贝母提取物；②取林蛙油适量，采用乳钵或胶体磨研磨粉碎，粉碎粒度为(-0.154mm，+0.150mm)，即得林蛙油细粉；③取上述制备的平贝母提取物和林蛙油细粉混匀作为活性成分，以大豆油为基质、蜂蜡为助悬剂、吐温80为润湿剂，活性成分与大豆油重量比例为1:1.5，蜂蜡用量为大豆油重量的1.5％，吐温80用量为大豆油重量的0.5％混匀，即得软胶囊内容物；④取上述软胶囊内容物置于软胶囊生产设备中，以明胶-甘油或其他高分子材料为囊材，采用压制法或滴制法制备，即得软胶囊；
所述平贝母提取物和林蛙油细粉重量配比的原料组成：林蛙油5～15份、平贝母3～9份。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述平贝母提取物和林蛙油细粉重量配比的原料组成：林蛙油5份、平贝母3份。
3.根据权利要求1或2所述制备方法制得的林蛙油平贝母软胶囊。
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Publications (2)
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|---|---|
| CN105521256A CN105521256A (zh) | 2016-04-27 |
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| CN105919112B (zh) * | 2016-06-22 | 2021-01-12 | 延边大学 | 一种人参平贝母保健食品及其制备方法和用途 |
| CN111617110A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-09-04 | 黑龙江省四宝生物科技股份有限公司 | 一种林蛙油冻干粉补肾药理作用的研究方法 |
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| 人参蛤蟆油胶囊细胞免疫调节作用的实验研究;朱红秋;《中国卫生工程学》;20120430;第11卷(第2期);第112页右栏第3节"讨论" * |
| 平贝母醇提物对小鼠免疫功能的影响;于晓龙等;《延边大学学报（自然科学版）》;20150331;第41卷(第1期);第86页左栏第2.1节，第88页左栏第4节"讨论" * |
| 林蛙油软胶囊产品稳定性的研究;陈晓平等;《吉林农业大学学报》;20021231;第24卷(第5期);第104-106、118页 * |
| 蛤蟆油对机体细胞免疫调节作用的实验研究;边学武;《中国社区医师》;20081231;第10卷(第15期);第3页 * |
| 蛤蟆油调节小鼠细胞免疫功能的实验研究;顾红缨等;《吉林中医院》;20101231;第30卷(第12期);第1103-1104页 * |
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