CN103536925A - 强心苷化合物在非小细胞肺癌治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及强心苷化合物在非小细胞肺癌治疗中的应用。具体地,本发明涉及强心苷化合物在在制备用于治疗非小细胞肺癌的药物中的用途,所述非小细胞肺癌是酪氨酸激酶抑制剂耐药性的非小细胞肺癌。
Description
技术领域
本发明涉及强心苷化合物在非小细胞肺癌治疗中的应用的技术领域。具体地,本发明涉及强心苷化合物在制备用于治疗酪氨酸激酶抑制剂耐药性的非小细胞肺癌的药物中的用途。
背景技术
肺癌是肺组织内细胞生长失去控制而导致的一种疾病。在过去的半个多世纪中,肺癌的发病率和死亡率逐年增加,已经从20世纪初的一种罕见疾病发展为当今的全球头号癌症杀手。根据世界卫生组织(WHO)定期公布的资料,肺癌的发病率和死亡率在世界各国尤其是发达国家呈明显的上升趋势,已经成为许多发达国家最常见的肿瘤,位列男性常见恶性肿瘤第一位和女性常见恶性肿瘤第二位,并且成为恶性肿瘤中最常见的死亡原因。在我国,男性肺癌年龄标准化发病率为47.51/10万,女性肺癌年龄标准化发病率为22.69/10万,并且呈逐年增加的趋势,参见,She J,Yang P,Hong Q,等人Lung cancer inChina:challenges and interventions[J].Chest.2013,143(4):1117-1126。预计到2025年,我国每年仅死于肺癌的人数就将接近100万,成为世界第一肺癌大国。
根据肺癌细胞的分化程度和形态特征,临床上将其分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small lung cancer,NSCLC)两类,其中非小细胞肺癌占到85%左右。根据预后情况,几种非小细胞肺癌又可以归为三类:鳞状细胞癌、肺腺癌和大细胞肺癌。尽管诊断方法和治疗手段都有了很大的进步,70%的NSCLC患者在初次确诊时大多已处于ⅢB/Ⅳ期,其中约40%的患者失去手术治疗的机会,5年生存率往往低于5%,参见Molina J R,YangP,Cassivi S D,等人Non-small cell lung cancer:epidemiology,risk factors,treatment,andsurvivorship[J].Mayo Clin Proc.2008,83(5):584-594。因此,针对该疾病分子起源和疾病发生发展过程的研究,对其预防和治疗具有重要意义。
与其他类型的癌症相似,NSCLC的发病机制也是十分复杂的。尽管人们投入了大量的人力和财力尝试从不同角度去解释NSCLC的发生发展,但是到目前为止,NSCLC和其他肿瘤一样被认为没有一个单一的致病机理,它往往是遗传和环境等多个因素复杂作用的结果。目前对于NSCLC的研究以遗传层面最为深入。人们对NSCLC的致病机理在分子和细胞层面上进行了大量的研究,逐步阐明了该疾病的分子起源和发生发展过程。总结起来,NSCLC的发生主要是由于一些细胞信号通路的改变,包括细胞生长促进基因的过度激活和细胞生长抑制基因的失活。NSCLC的四种主要致病突变为,EGFR突变、K-RAS突变、p53突变、MET突变。
在错过手术治疗的机会后,化疗成为NSCLC治疗的一种传统方法。然而化疗不仅给患者带来很大的痛苦,更重要的是它并不能从实质上改变大多数NSCLC患者的最终结局。近年来,随着对NSCLC致病机理研究的深入,人们开始发展以细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的分子靶向治疗。目前,全球有80余种靶向治疗的药物正在研究中,其中以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和肿瘤血管内皮生成因子受体(vascular endothelial growth factor,VEGFR)为作用靶点的药物占60%以上。
EGFR是Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体,定位于细胞膜,分为胞外区、跨膜区、胞内区3个部分。胞外区为配体结合区,跨膜区为一个单独的螺旋,胞内区包括一个酪氨酸激酶区及几个酪氨酸磷酸化的羧基末端。EGFR与配体结合后,将它们的酪氨酸激酶区域紧密连接,介导羧基端磷酸化位点磷酸化,引发细胞内信号传导,从而促进细胞的增生、分化、粘附、血管生成和抑制细胞凋亡。目前以EGFR为靶点的药物分为2类:一类为小分子的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI),其通过竞争性结合酪氨酸激酶区的磷酸化位点来抑制该位点的磷酸化以实现阻断EGFR信号传导;另一类为单克隆抗体,通过阻断胞膜外配体结合区而抑制EGFR活化。TKI类药物主要有吉非替尼和厄罗替尼。吉非替尼是首个针对EGFR酪氨酸激酶的口服药物,从2003年开始被FDA批准用于I临床治疗肺癌。它能特异性作用于EGFR酪氨酸激酶,阻断EGFR信号传导系统,切断恶性肿瘤的形成过程中最重要的环节,从而起到抗肿瘤的作用,同时具有非细胞毒性和靶向性,对免疫系统无抑制作用,参见罗湘江,马涛,尹清云.吉非替尼分子靶向治疗晚期肺腺癌23例临床观察[J]中国肿瘤临床.2009(12):672-674。厄罗替尼属于新型低相对分子质量的李哪唑啉复合化物,可与细胞质内位于酪氨酸激酶结构区的三磷腺苷特异性结合,有效抑制酪氨酸激酶活性及下游信号传导,从而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移,降低肿瘤细胞黏附能力,促进肿瘤细胞凋亡,参见Bareschino M A,SchettinoC,Troiani T,等人Erlotinib in cancer treatment[J].Ann Oncol.2007,18Suppl6:i35-i41。厄罗替尼还可诱导细胞周期抑制蛋白P27的表达,使癌细胞阻滞于G1期,体外实验观察到用药后可诱导癌细胞凋亡的发生。除了TKI类药物,目前临床上以EGFR为靶点的药物还有西妥昔单抗,它是第1个获准上市的特异性针对EGFR的IgG1单克隆抗体,能与EGFR的胞外配体结合域结合,从而阻断下游信号传导通路。研究证实,将西妥昔单抗联合含铂化疗方案作为表达EGFR的NSCLC患者的一线治疗,有明显疗效。
此外,VEGFR也是NSCLC分子靶向治疗的一个主要作用点。血管的生成在肺癌形成、生长和转移过程中发挥着重要作用,而在促进血管生成的多种细胞因子和生长因子中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体尤为重要。抑制血管生长因子可拮抗肿瘤血管生长,达到抑制肿瘤的目的。目前以VEGFR为靶点的药物包括:贝伐单抗和重组人血管内皮抑制素。贝伐单抗是一种重组人源化的抗VEGF抗体,是首个进入临床的抑制血管生长的药物。它通过与VEGF结合,阻止和减弱VEGF与血管内皮细胞表面受体结合,从而抑制内皮细胞增殖和新生血管生长,起到抗肿瘤作用。作为VEGFR,贝伐单抗的优势有:靶点直接暴于血液中,便于药物直接作用;靶点基因表达稳定,不易产生抗药性;
无需考虑肿瘤组织学特性;可抑制肿瘤转移;有下游放大效应[38]。重组人血管内皮抑制素(recombinant human endostatin,rh-ET)的作用机制是与VEGFR结合阻止VEGF引发的促血管生成活性,特异性地抑制血管内皮细胞生长增殖,从而阻断肺癌细胞的营养供应。目前,临床应用较多的内皮抑素抗肿瘤血管生长药物是恩度。但其成本较高,临床应用受限。
如前文所述,EGFR-TKI是用于NSCLC分子靶向治疗的一类重要药物,其中以吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)为代表的EGFR-TKI目前被广泛用于NSCLC的临床治疗,并且取得了非常好的疗效。但是在临床应用中,大部分患者对EGFR-TKI的治疗并不敏感,或开始对该类药物高度敏感但经过约10-14个月的中位无疾病进展生存期(progression free survival,PFS)后最终产生耐药参见Paz-Ares L,Moecks J,Klughammer B.Reply to Watkins and Rukazenkov(J Cell Mol Med2010),re-Letter of Response tomanuscript entitled'Clinical outcomes in NSCLC patients with EGFR mutations:pooledanalysis'(Paz-Ares等人.,J Cell Mol Med.2010;14(1-2):51-69)[J].J Cell Mol Med.2011,15(5):1225.,使该类药物的临床应用受到一定限制。因此,关于NSCLC EGFR-TKI耐药机制的研究对于选择性个体化治疗、克服或逆转耐药具有重要意义。目前认为NSCLC对EGFR-TKI的耐药性可以分为原发性耐药和获得性耐药。
原发性耐药是指TKI在治疗初期就对肿瘤细胞无明显作用,应用该药物治疗后病情未得到缓解,临床治疗未取得明显疗效。EGFR基因在不同种群中表现出不同的突变率,在亚洲NSCLC患者中其突变率为20%-30%,而在高加索NSCLC患者中为10%-15%参见Sequist L V,Bell D W,Lynch T J,et al.Molecular predictors of response to epidermal growthfactor receptor antagonists in non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol.2007,25(5):587-595。研究表明,吉非替尼或厄洛替尼对EGFR突变的NSCLC患者的治疗有效率为70%-80%,而对野生型患者的有效率仅10%-20%参见Mitsudomi T,Yatabe Y.Mutations ofthe epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermalgrowth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer[J].Cancer Sci.2007,98(12):1817-1824。显然,NSCLC患者对EGFR-TKI具有原发性耐药。研究显示某些EGFR突变可以引起NSCLC对EGFR-TKI耐药,如治疗前存在EGFR20外显子插入突变可导致原发性耐药参见Greulich H,Chen T H,Feng W,et al.Oncogenic transformation byinhibitor-sensitive and-resistant EGFR mutants[J].PLoS Med.2005,2(11):e313。其机制可能是由于突变形成了空间位阻,使吉非替尼及厄洛替尼无法与TKs区结合,大大地降低了药物的敏感性。此外,K-Ras突变也可能与这种原发性耐药有关。BR.21安慰剂对照试验对K-Ras与EGFR基因型厄洛替尼治疗效果的影响进行了评估。结果显示,K-Ras野生型患者(HR=0.69,P=0.03)可从厄洛替尼治疗中获得统计学意义上的生存益处,而KRAS突变型(HR=1.67,P=0.31)则没有,参见Zhu C Q,Da C S G,Ding K,et al.Role of KRAS andEGFR as biomarkers of response to erlotinib in National Cancer Institute of Canada ClinicalTrials Group Study BR.21[J].J Clin Oncol.2008,26(26):4268-4275.。此外,有数据表明Met激活与EGFR-TKI原发性耐药有关,与MET原癌基因扩增是相互独立的。
EGFR-TKI获得性耐药产生的机制主要包括EGFR基因的二次突变和MET基因的扩增。2005年Kobayashi等提出EGFR二次突变可能是引起EGFR-TKI获得性耐药的主要原因,参见Kobayashi S,Boggon T J,Dayaram T,et al.EGFR mutation and resistance ofnon-small-cell lung cancer to gefitinib[J].N Engl J Med.2005,352(8):786-792。这一理论目前在国际上已经被广泛认可。该研究发现,EGFR基因的第二次突变发生在20号外显子,为T790M突变,即酪氨酸激酶活性结构域上790位的苏氨酸残基被甲硫氨酸取代,从而形成空间位阻,增加了EGFR与ATP之间的亲和力,同时减弱了与EGFR-TKI的亲和力,致使吉非替尼和厄洛替尼不能有效抑制EGFR。原癌基因MET扩增也是导致EGFR-TKI获得性耐药性的一个重要原因。MET是肝细胞生长因子(HGF)/分散因子的一种高亲和力的酪氨酸激酶受体,被激活后发生自身磷酸化,引起多种底物蛋白磷化和细胞内一系列信号传导,激活MAPK-ERK1/2及P13K-Akt等信号通路,促进多种瘤细胞的生长、侵袭和转移。2007年Engelman等发现MET扩增可以通过ErbB3使PI3K通路持续激活,从而绕过受抑制的EGFR靶点而产生耐药性,参见Engelman J A,Zejnullahu K,Mitsudomi T,et al.METamplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3signaling[J].Science.2007,316(5827):1039-104.。TKI获得性耐药的NSCLC患者中,约30%-40%既无继发突变,也无MET扩增,这部分患者的耐药机制正在进一步研究。可能的机制包括:EGFR-TKI诱导NSCLC细胞膜表面EGFR/IGF1R异源二聚体化进而激活胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor1receptor,IGF-1R)及其下游信号通路MAPK和P13K/AKT的转导,并能刺激mTOR介导的survivin蛋白合成引发抗凋亡效应,从而引起肺癌患者对TKI耐药,参见Morgillo F,Kim W Y,Kim E S,等人.Implication of the insulin-likegrowth factor-IR pathway in the resistance of non-small cell lung cancer cells to treatment withgefitinib[J].Clin Cancer Res.2007,13(9):2795-2803;PTEN基因表达丧失可活化PI3K/Akt/mTOR信号通路,导致凋亡抵抗,促进癌症的发生,进而对EGFR-TKI产生耐药,参见Sos M L,Koker M,Weir B A,等人.PTEN loss contributes to erlotinib resistance inEGFR-mutant lung cancer by activation of Akt and EGFR[J].Cancer Res.2009,69(8):3256-3261。
NSCLC治疗过程中EGFR-TKI的原发与获得性耐药问题已经极大地限制了其在该疾病治疗中的应用。因此对其耐药机制的深入研究,寻找克服耐药的治疗方法,已经成为NSCLC研究领域的迫切任务。随着基础研究和临床实验的不断深入,EGFR-TKI药物耐药机制逐渐清晰,越来越多的针对肿瘤耐药机制或作用于其它相关信号通路的靶向药物逐渐进入临床,并取得一定疗效。
目前,用于克服EGFR-TKI耐药的策略主要有2种:一是研发第二代TKI,如不可逆的EGFR抑制剂;二是联合应用或者单用多靶点药物,同时阻断多种信号通路。
EGFR-TKI耐药性NSCLC患者的临床治疗应该采取多种治疗方案相结合,以求达到最优的治疗效果。例如,随着对EGFR-TKI原发性和获得性耐药机制的不断深入探讨,与EGFR-TKI疗效有关的分子生物标记及其之间的相互关系已经越来越明了,临床上可以根据这些分子标记物选择适合的患者接受TKI治疗,进一步提高NSCLC的疗效和生存,最大限度地避免无效的治疗。
强心苷是一类从被子植物中提取的有机化合物。早在1500多年前,富含该类化合物的植物就被人们用于堕胎、催吐、利尿、心脏滋补等医疗目的。1775年,英国生理学家William Withering发现毛地黄的提取物可以显著改善充血性心力衰竭病人的症状,并证明该提取物中所含的强心苷如欧夹竹桃苷和地高辛可以提高心脏收缩并控制心房颤抖。从此,强心苷作为一种药物正式用于现代医疗。
实际上,强心苷的抗肿瘤作用在体内也得到证实。早在十几年前,Inada就首先在DMBA与TPA诱导的小鼠皮肤瘤和4NQO与甘油诱导的小鼠肺癌中证明,洋地黄毒苷可以抑制肿瘤的形成,参见Inada A,Nakanishi T,Konoshima T,et al.Anti-tumor promotingactivities of natural products.II.Inhibitory effects of digitoxin on two-stage carcinogenesis ofmouse skin tumors and mouse pulmonary tumors[J].Biol Pharm Bull.1993,16(9):930-931。与此同时,在Afaq等人关于夹竹桃苷对皮肤瘤抑制作用的研究中,夹竹桃苷在TPA诱导前半小时使用可以时间依赖型地抑制肿瘤的生成,参见Prassas I,Diamandis E P.Noveltherapeutic applications of cardiac glycosides[J].Nat Rev Drug Discov.2008,7(11):926-935。Svensson证明地高辛是SH-SY5Y和Neuro-2a细胞系小鼠移植瘤的特异抑制剂。Han等人研究了蟾毒灵在人肝癌细胞裸鼠移植瘤上的作用,发现无毒性浓度的蟾毒灵可以诱导移植肿瘤细胞的凋亡。这些体内研究不断增强着我们将强心苷用于癌症治疗的信心。令人鼓舞的是,基于强心苷的抗癌药物也已经开始临床试验。
本实验室采取药物筛选的策略,对一个所含药物大部分已获FDA批准的药物文库进行筛选,希望得到可以提高NSCLC吉非替尼敏感性的药物。这不仅避免了现有联合应用多靶点药物的偏向性,更重要的是,由于筛选出的药物在安全性、毒理和作用机制方面都比较清楚,将可以大大减少研发投入和研发时间。经过前期筛选,初步确定强心苷药物吉妥辛可以提高NSCLC耐药性细胞系H1975的吉非替尼敏感性。
本研究首先对前期的筛选结果在多个耐药性NSCLC细胞系中进行了验证。同时,考虑到强心苷药物在肿瘤抑制方面的作用,本研究还评价了强心苷中的其他化合物对NSCLC细胞吉非替尼敏感性的影响。结果显示,强心苷中的吉妥辛(Gitoxin)和洋地黄毒苷(Digitoxin)可以显著提高NSCLC的吉非替尼敏感性。同时,我们对吉妥辛/洋地黄毒苷与吉非替尼在H1975和H1650中的药物相互作用进行了评价,发现这两种药物都可以和吉非替尼协同性地抑制耐药性NSCLC细胞的生长,并促进其凋亡。此外,我们对其分子机制进行了初步研究,发现吉妥辛/洋地黄毒苷与吉非替尼对NSCLC的协同性抑制可能是通过协同性抑制Erk信号通路实现的。
最后,在研究中,我们发现相同浓度强心苷药物吉妥辛可以比吉非替尼更有效地抑制NSCLC耐药细胞的生长并促进其凋亡。而且,小鼠移植瘤实验显示,吉妥辛可以有效抑制小鼠移植瘤的生长。由于强心苷是目前临床上用于治疗心脏病的药物,而且其抑癌作用的浓度在治疗心脏病生理浓度范围内,因此,该药物很有可能作为治疗耐药性NSCLC的替代药物。
发明内容
本发明提供了一种强心苷化合物在制备用于治疗非小细胞肺癌的药物中的用途。
具体地,根据本发明的非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、肺腺癌和大细胞肺癌。进一
步地,本发明提供了强心苷化合物在制备用于治疗酪氨酸激酶抑制剂耐药性的非小
细胞肺癌。
具体地,根据本发明的酪氨酸激酶抑制剂选自吉非替尼或厄洛替尼。
更具体地,根据本发明的用途中所述的强心苷化合物选自吉妥辛、洋地黄毒苷、地高辛、哇巴因或前海葱苷原A。
进一步地,本发明提供了强心苷化合物联合酪氨酸激酶抑制剂在制备用于治疗非小细胞肺癌的药物中的用途。
具体地,根据本发明的用途,其中所述非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、肺腺癌和大细胞肺癌。
具体地,根据本发明的用途,其中所述非小细胞肺癌是酪氨酸激酶抑制剂耐药性的非小细胞肺癌。
更具体地,根据本发明的用途,其中酪氨酸激酶抑制剂选自吉非替尼或厄洛替尼。
更具体地,根据本发明的用途,其中所述的强心苷化合物选自吉妥辛、洋地黄毒苷、地高辛、哇巴因或前海葱苷原A。
进一步地,本发明提供了治疗酪氨酸激酶抑制剂耐药性的非小细胞肺癌的治疗方法,其中包括向有需要的受试者施用治疗有效量的强心苷化合物和酪氨酸激酶抑制剂。
具体地,根据本发明的用途,其中酪氨酸激酶抑制剂选自吉非替尼或厄洛替尼;所述强心苷化合物选自吉妥辛、洋地黄毒苷、地高辛、哇巴因或前海葱苷原A。
附图说明
图1A至图1D:吉妥辛对H1975、H1650、PC9/G和A549细胞吉非替尼敏感性的影响。图1A、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1μM吉非替尼处理48小时的H1975生存曲线;图1B、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1μM吉非替尼处理48小时的H1650生存曲线;图1C、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1μM吉非替尼处理48小时的PC9/G生存曲线;图1D、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1μM吉非替尼处理48小时的A549生存曲线。
图2A至图2D:其他几种强心苷药物对H1975细胞吉非替尼敏感性的影响。图2A、用吉非替尼、洋地黄毒苷和洋地黄毒苷+1μM吉非替尼处理48小时的H1975的生存曲线;图2B、用吉非替尼、地高辛和地高辛+1μM吉非替尼处理48小时的H1975的生存曲线;图2C、用吉非替尼、哇巴因和哇巴因+1μM吉非替尼处理48小时的H1975的生存曲线;图2D、用吉非替尼,前海葱苷原A和前海葱苷原A处理48小时的H1975的生存曲线。
图3A至图3D:吉妥辛和吉非替尼在H1975和H1650细胞中的相互作用方式。图3A、用吉非替尼、吉妥辛和吉非替尼+吉妥辛以如所示浓度处理48小时的H1975的生存曲线;图3B、基于A的CI值;图3C、用吉非替尼、吉妥辛和吉非替尼+吉妥辛以如所示浓度处理48小时的H1650的生存曲线;图3D、基于C的CI值。
图4A至图4D:、洋地黄毒苷和吉非替尼在H1975和H1650细胞中的相互作用方式。图4A、用吉非替尼、洋地黄毒苷和吉非替尼+洋地黄毒苷以如所示浓度处理48小时的H1975的生存曲线;图4B、基于A的CI值;图4C、用吉非替尼,洋地黄毒苷和吉非替尼+洋地黄毒苷以如所示浓度处理48小时的H1650的生存曲线;图4D、基于C的CI值。
图5A至图5F:其他几种强心苷与吉非替尼在H1975细胞中的相互作用方式。图5A、用吉非替尼,地高辛和吉非替尼+地高辛以如所示浓度处理48小时的H1975的生存曲线;图5B、基于A的CI值;图5C、用吉非替尼,哇巴因和吉非替尼+哇巴因以如所示浓度处理48小时的H1975的生存曲线;图5D、基于C的CI值;E、用吉非替尼、前海葱苷原A和吉非替尼+前海葱苷原A以如所示浓度处理48小时的H1975的生存曲线;图5F、基于E的CI值。
图6A至图6D:吉妥辛和吉非替尼联合使用对H1975和H1650细胞凋亡的影响。图6A、用DMSO,9μM吉非替尼,300nM吉妥辛和9μM吉非替尼+300nM吉妥辛处理后由流式细胞仪分析H1975的凋亡;图6B、基于A计算的凋亡比率;图6C、用DMSO,4μM吉非替尼,1μM吉妥辛和4μM吉非替尼+1μM吉妥辛处理后由流式细胞仪分析H1650的凋亡;图6D、基于C计算的凋亡比率。*P<0.01,与吉非替尼或吉妥辛组比较。
图7A至图7D:洋地黄毒苷和吉非替尼联合使用对H1975和H1650细胞凋亡的影响。图7A、用DMSO,9μM吉非替尼,40nM洋地黄毒苷和9μM吉非替尼+40nM洋地黄毒苷处理后由流式细胞仪分析H1975的凋亡;图7B、基于A计算的凋亡比率;图7C、用DMSO,4μM吉非替尼,30nM洋地黄毒苷和4μM吉非替尼+30nM洋地黄毒苷处理后由流式细胞仪分析H1650的凋亡;图7D、基于C计算的凋亡比率。*P<0.01,与吉非替尼或洋地黄毒苷组比较,**P<0.05,与吉非替尼或洋地黄毒苷组比较。
图8A至图8D:吉妥辛、洋地黄毒苷和吉非替尼联合使用对H1975和H1650细胞中PARP表达量的影响。图8A、在用DMSO,9μM吉非替尼,300nM吉妥辛和9μM吉非替尼+300nM吉妥辛处理后使用蛋白印记杂交测量H1975中的PARP;图8B、在用DMSO,4μM吉非替尼,1μM吉妥辛和4μM吉非替尼+1μM吉妥辛处理后使用蛋白印记杂交测量H1650中的PARP;图8C、在用DMSO,9μM吉非替尼,40nM洋地黄毒苷和9μM吉非替尼+40nM洋地黄毒苷处理后使用蛋白印记杂交测量H1975中的PARP;图8D、在用DMSO,4μM吉非替尼,30nM洋地黄毒苷和4μM吉非替尼+30nM洋地黄毒苷处理后使用蛋白印记杂交测量H1650中的PARP。
图9A至图9C:吉非替尼和吉妥辛/洋地黄毒苷/地高辛联合用药对H1975和H1650细胞信号通路的影响。图9A、用如所示的2.25μM吉非替尼和75nM吉妥辛处理H1975细胞12小时;图9B、用如所示的1μM吉非替尼和250nM吉妥辛处理H1650细胞12小时;图9C.用如所示的2.25μM吉非替尼,10nM洋地黄毒苷和10nM地高辛处理H1975细胞12小时。通过蛋白印记杂交检测信号分子。
图10A至图10F:Erk信号通路与耐药性。用如所示浓度的吉非替尼处理。图10A、HCC827;图10B、PC9;图10C、H1975;图10D、H1650细胞后,通过蛋白印记杂交检测Erk。如所示处理图10E、H1975;图10F、H1650细胞并通过MST分析测量生存率。
图11A至图11B:联合用药对肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞的影响。图11A、用所示浓度DMSO、吉非替尼、地高辛和吉非替尼+地高辛处理48小时的癌干细胞和非癌干细胞的生存率。图11B、侧群细胞的百分比。
图12A至图12B、洋地黄毒苷与吉非替尼联合用药对小鼠移植瘤生长的影响。图12A、记录4周的肿瘤体积。n=7,*P<0.05,与吉非替尼或洋地黄毒苷组比较。图12B、如所示各组中肿瘤的照片。
图13A至图13C:H1975对吉非替尼和吉妥辛的敏感性。图13A、用吉非替尼和吉妥辛处理48小时的H1975的生存曲线;图13B、用相同浓度的DMSO,300nM吉非替尼和300nM吉妥辛处理后通过流式细胞仪分析H1975的凋亡;图13C:计算凋亡,*P<0.01,与吉非替尼组比较。
图14A至图14B:吉妥辛对肿瘤生长的影响。图14A、PBS或吉妥辛处理的肿瘤生长曲线;图14B、在终止点的小鼠图片,*P<0.05,与对照比较。
图15A至图15B:吉妥辛对H1975细胞中Erk1/2磷酸化的影响。图15A、用不同浓度的吉妥辛处理的H1975的Erk1/2磷酸化模式;图15B、在用吉妥辛处理的不同时间点的H1975的Erk1/2磷酸化模式。
具体实施方式
材料与方法
一、实验材料
1.细胞
NCI-H1975(人非小细胞肺腺癌细胞,EGFR exon20T790M-L858R)、NCI-H1650(人肺支气管癌细胞,EGFR exon19Del E746-A750)、HCC827(人非小细胞肺癌细胞,EGFRexon19Del E746-A750);购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。
PC9(人非小细胞肺癌细胞),由上海市瑞金医院赠送。
2.实验动物
BALB/c Nude型免疫缺陷小鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号为:SCXK(京)2012-0001。
3.主要试剂
(1)细胞培养用试剂
改良型RPMI-1640培养基(SH30809.18,Hyclone);
DMEM-高糖培养基(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心);
胰酶消化液(0.05%和0.25%,中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心);
磷酸缓冲液PBS(SH30256.01,Hyclone);
胎牛血清FBS(10099-141,gibico)
青-链霉素(SH40003-12,Hyclone)
动物细胞冷冻保存液(CSM-100,大连普肽生物科技有限公司)
(2)试剂盒
Alexa Fluor488Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(V13245,Invitrogen);
BCA蛋白质定量试剂盒(PA115-01,TianGen)
(3)抗体
本研究所用抗体均来自Cell Signaling Tech公司。
4.软件及统计学分析
细胞凋亡分析软件CFlow Plus;图标制作软件Excel;用SPSS16.0软件对结果进行统计学分析,多个独立样本均数比较采用单因素方差分析。
二、实验方法
1.细胞培养
遵循本领域技术人员熟知的方法进行细胞培养、复苏、传代、冻存以及计数。
2.MTS法检测细胞生存率
原理:MTS/PMS法是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的检测试剂。MTS是一种新型四唑化合物,PMS是一种电子偶联剂。PMS具有增强的化学稳定性,这使它可与MTS混合形成稳定的溶液。MTS(Owen’s reagent)被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物,可直接溶解于培养基中。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的NADPH或NADH的作用下完成的。在490nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。MTS与MTT法相比,操作步骤更少,无需挥发性溶剂来溶解结晶沉淀甲臜产物。
实验步骤:
(1)接种细胞:用含10%胎牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔5000-7000个细胞接种到96孔板,每孔体积150ul;
(2)培养细胞:培养24h,待细胞贴壁后更换为含1%胎牛血清的培养基饥饿培养,24h后换为含不同浓度的药物的RPMI-1640培养基进行处理,每孔100μl,每个浓度4个重复。继续培养48h;
(3)MTS/PMS溶液的配制:分别融化MTS和PMS,37℃水浴10分钟。按7ml培养基:1336.4μl MTS:63.6μl PMS比例配制;
(4)呈色:弃去培养基,每孔加MTS/PMS溶液120ul,继续孵育1.5-2h。
(5)用酶标仪检测490nm波长下的吸光度A,并根据吸光度A计算细胞的生存率。计算公式如下:细胞生存率=(实验组A/对照组A)×100%。
3.Annexin V/PI细胞凋亡检测法
原理:在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧,细胞发生凋亡早期,膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此,Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。在细胞发生凋亡时,膜磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的变化。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻,所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI)合并使用,来区分凋亡细胞与死亡细胞。
实验步骤:
(1)细胞按实验要求接种于12孔板,每孔约1×105个细胞。24h后换为含1%胎牛血清的RPMI-1640培养基对细胞进行饥饿培养24h。
(2)设置相应对照:正常对照,什么染料也不加;凋亡细胞(处理组),只染AnnexinV;死亡细胞,可用高浓度的吉非替尼处理正常细胞,只用PI染色;另外有处理对照和各处理组,用Annexin V和PI同时染色。细胞按实验要求,用不同药物处理。对不同时间点实验,在不同时间加药,同时收集细胞。
(3)吸出培养液,由于有死亡的细胞已经悬起,培养液不能扔掉,一并转入离心管中(如吸出培养液体积较大,可用离心管保存。离心后同胰酶消化的细胞合并)。
(4)每孔加入200μL0.05%胰酶消化,镜下观察,当细胞突起开始收缩、细胞开始变圆时,吸出胰酶。
(5)加新完全培养液终止消化,吹打下细胞,转入离心管,200g离心5min收集细胞,PBS洗两次,重悬细胞于100ul的结合缓冲液中。
(6)加入5μl的Annexin V和1μl的PI轻轻混匀,避光染色15min。用400目细胞筛过滤后上机检测。使用Accuri6软件对结果进行分析,得到细胞的凋亡率。
4.细胞总蛋白提取
(1)用PBS将要收集的细胞洗一遍,加入含有cocktail的RIPA蛋白裂解液,放在冰上,用细胞刮将培养板上的细胞迅速刮下,转移至1.5ml离心管。
(2)在混匀器上于4℃旋转混匀45min,4℃,12000rpm离心10min,将上清转移至新的离心管保存于-80℃冰箱。
(3)蛋白总浓度测定(BCA蛋白质定量试剂盒法):
1)配制BCA工作液:依据样品数量,将试剂A和试剂B按体积比50:1配制BCA工作液,并充分混匀。
2)分别取25μl表格中新鲜配置的BSA标准液和待测样品,加入到96孔板中;每孔中加入200μl BCA工作液,并充分混匀;加盖,37℃孵育30min后冷却至室温或室温放置2h;用酶标仪于562nm波长处检测其吸光度;根据标准曲线计算出样品中的蛋白含量。
5.蛋白印记杂交(Western blot)
(1)SDS-PAGE:
1)根据本领域技术人员熟知的方法制备分离凝胶;
2)灌浓缩胶前要将分离胶上的ddH2O倒掉,浓缩胶凝胶速度更快,加入TEMED后要快速混匀后灌胶,再插入适当的梳子,一般用0.75mm厚度。
3)样品加入适量的4×loading buffer,沸水浴10分钟,短暂离心上样。
4)70-90V电泳,大约需要2.5小时。
(2)蛋白印记杂交检测:
1)将合适大小的PVDF膜首先置于甲醇中浸润5min,然后在1×Transfer Buffer中平衡(即用镊子夹住膜在Transfer Buffer中反复涮洗30s)后方可应用,如果使用尼龙膜,则直接在1×Transfer Buffer中平衡后即可使用。取下电泳后的胶置于1×Transfer Buffer中平衡。
2)安装转膜设备:将转膜用的塑料夹子的黑色面向下打开后平放于桌上,首先放置一片在1×Transfer Buffer中浸润过的海面垫,然后放置2层浸润过的3M滤纸,之后将平衡过的PAGE胶平铺于滤纸上,再在其上放置平衡过的PVDF膜并用一玻璃试管赶压所有气泡,接着再向其上放置2层浸润过的3M滤纸和另一片在1×Transfer Buffer中浸润过的海面垫,最后合上塑料夹子并放置于装满转膜液的转膜槽中(注意电极方向)。
3)电转移:对于转印120KD以下的蛋白质,通常按如下参数设置,1安培恒定电流需要1h;500mA2h;250mA4h;或150mA过夜。
4)抗原抗体反应:
Blocking(封闭):将转印好的膜卸下(观察有色Marker是否完全从胶上转移到膜上),标记好正面(即蛋白面),置于Blocking Buffer中室温摇晃孵育1h,或37℃30min,或4℃过夜。
一抗孵育:将特定的抗体稀释于Primary Antibody Dillution Buffer中,通常的稀释比例为1:1000。将膜从Blocking Buffer中取出,稍稍空干一下液体后直接放于稀释的一抗溶液中,室温摇晃孵育1h,或37℃30min,或4℃过夜(对于一些信号较弱的抗体采用4℃过夜效果较好)。
二抗孵育:将膜取出沥干液体后放于1×TBS中摇晃孵育30min(每隔约5min更换一次液体)。将洗过的膜置于稀释后的二抗中(通常1:1000倍稀释)室温摇晃孵育1h。
洗膜:将膜从二抗稀释液中取出,沥干液体后放于1×TBS中摇晃孵育30min(每隔约5min更换一次液体)。
5)显色反应(辣根过氧化物酶化学发光法):各取等体积ECL试剂A液、B液混合(按每平方厘米转印膜0.125mL ECL混合液计算)。将转印膜轻轻接触3MM滤纸吸干液体。将膜放入事先混匀的ECL混合液中反应1min,提起转印膜,轻轻在3MM滤纸上吸干液体。在Image Quant LAS4000mini荧光成像仪上成像。
6.测定细胞内pH值
原理:BCECF AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。BCECF AM没有荧光,进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成BCECF,从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。最大激发波长和发射波长因pH的不同而有所不同,最大激发波长大致在503nm左右,最大发射波长大致在520nm左右,实际检测时推荐使用的激发波长为488nm,发射波长为535nm。
实验步骤:
(1)接种细胞到12孔板并按实验要求进行相应处理,收集细胞时,每孔加入200μL0.05%胰酶消化,镜下观察,当细胞突起开始收缩、细胞开始变圆时,吸出胰酶,完全培养基终止消化并制成细胞悬液。
(2)用HBSS稀释BCECF AM至5μM,取100μ重悬细胞,在室温避光孵育60min。
(3)用PBS洗细胞两次,在C6流式细胞仪上检测荧光强度。
7.肿瘤干细胞分选
原理:Hoechst33342是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。当用这种染料给细胞染色时,正常细胞会大量摄取。但是在肿瘤干细胞中存在一种ATP结合转运体,它可以将肿瘤干细胞摄取的染料重新排出细胞外。因此,一个细胞系中的肿瘤干细胞在染色后往往呈现较低的荧光信号。根据这个原理,我们可以用流式细胞仪将肿瘤干细胞分选出来。同时,在染色时,还需要加入PI以排除凋亡的细胞。维拉帕米可以特异性地抑制ATP结合转运体,通常用做对照。
实验步骤:
(1)Hoechst33342的配制
储存液:将25mg Hoechst33342粉末,加入25ml蒸馏水,制成1mg/ml的储存液,零下20度保存。工作液:取1ml储存液加入9ml蒸馏水,配制成0.1mg/ml的工作液,过滤除菌,4度避光保存.
(2)PI的配制
储存液:将10mgPI粉末加入10ml蒸馏水,制成1mg/ml储存液,零下20度避光保存。工作液:取1ml储存液,加入49mlPBS,制成20μg/ml工作液,过滤除菌,4度避光保存,最多可使用8周
(3)分选分成三组,分别为药物组、对照组和维拉帕米组,三组细胞用PBS洗2次,胰酶消化细胞,加入完全培养基,1000r/分钟离心10分钟。然后将其重悬于含2%的胎牛血清1640中,调整细胞浓度成1×106个/ml,对照组和药物组加入Hoechst33342,调整浓度至5μg/mL,维拉帕米组同时加入维拉帕米100μg/mL,避光37度水浴内孵育70分钟,在期间每15到20分钟震荡一次,最后加入2mL冰磷酸缓冲液(PBS)终止反应,1500r/min离心10min后弃上清,再用含2%的胎牛血清的PBS洗1次,用2%的胎牛血清的PBS重悬,PI加入至终浓度1μg/mL的,在进行流式细胞分选、鉴定前细胞4度避光保存。
(4)流式细胞仪检测分选,350nm(375)波长紫外光激发Hoechst染色,于450/20nm带通下收集测定蓝光,675nm带通下收集测定红光。选取线性信号,做Hoechst Red(X轴)和Hoechst Blue(Y轴)二维散点图,将Hoechst Red及Hoechst Blue弱信号且维拉帕米对照组缺失的区域设定为SP细胞的门,计算百分比。检测分选参数如下:1)激光器:大功率、488nm紫外激光;2)光电倍增管(PMT)光谱检测范围:300——1100nm、电压:150一990V;3)检测灵敏度:小于200MESF、CV小于1.5%(2μm Beads)CV小于3%;4)样本获取速度:25000个/秒(细胞);5)分选速度:5000个/秒或以上;6)分选纯度:99%7)分选模式:二路采集
8.动物实验
(1)动物饲养条件
所有实验用小鼠均在SPF级动物房饲养,每5只一笼。室内温度控制在19-24℃,湿度50%-60%,12小时明暗交替。小鼠饲料、垫料均经高温消毒处理,饮水经高温高压灭菌处理。饲养过程中,密切观察小鼠生长情况,垫料每周换一次,饲料和饮水每日补充。
(2)小鼠灌胃
准备灌胃针头,本研究采用特制8号小鼠灌胃针头;抓住小鼠,使其头、颈和身体呈一直线。左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴,另外三个手指抓住小鼠的颈部即可。若小鼠始终在活动中,可放开重新抓,避免强行操作损害小鼠;用1ml的注射器配灌胃针头。灌胃针头从小鼠的嘴角进入,压住舌头,抵住上颚,轻轻向内推进,进入食管后会有一个刺空感,待针头全部没入后,轻推注射器给药液;灌胃容积一般是0.1~0.2ml/10g,最大0.35ml/10g,每只小鼠的灌胃最大容积不超过0.8ml。
(3)小鼠移植瘤模型的建立
SPF级4周BALB/c裸鼠购自维通利华公司,合格证号:SCXK(京)2012-0001,饲养于中国医学科院基础医学研究实验动物中心。1周后,待小鼠适应环境后开始相关实验。首先,对每只小鼠右侧皮下注射0.2ml含有8×106个H1975细胞的RPMI-1640悬液。10天后,当移植的肿瘤长到50~70mm3时,将小鼠随机分为四组,每组5只。肿瘤体积V的计算公式为V=0.52×L×W2(长和宽)。将药物溶于含有0.05%羧甲基纤维素钠的PBS中,以相应剂量对实验组小鼠口服灌胃给药,对照组小鼠口服溶剂,肿瘤体积每四天测量1次。服药三周后,根据记录的测量数据制作肿瘤生长曲线。
实验结果
一、强心苷与吉非替尼联合用药对耐药性NSCLC细胞的抑制应用
1、吉妥辛及其他强心苷对耐药性NSCLC细胞系吉非替尼敏感性的影响
首先,对本实验室前期的药物筛选结果进行验证。选取与药物筛选相一致的细胞系H1975,分别以不同浓度吉非替尼、不同浓度吉妥辛和不同浓度吉妥辛+1μM吉非替尼处理48h,用MTS法检测细胞的生存率,并做出细胞生存曲线。结果显示,吉妥辛可以在多个浓度点提高H1975细胞对1μM吉非替尼的敏感性(图1-A)。同时,我们在其他几种耐药性NSCLC细胞系H1650、PC9/G和A549中对这一结论进行了验证。结果显示,吉妥辛可以在多个浓度点提高H1650细胞对1μM吉非替尼的敏感性(图1B),但是不能改变PC9/G和A549细胞对1μM吉非替尼的敏感性(图1C-1D)。
强心苷药物包括一大类结构和化学性质相似的化合物,其中多种已是目前的临床用药。考虑到近年来越来越多的关于强心苷抗癌作用的报道,我们也评价了该类药物中其他几种化合物对H1975吉非替尼敏感性的影响。结果显示洋地黄毒苷可以在多个浓度点提高H1975细胞对1μM吉非替尼的敏感性(图2A)。而该类药物中的其他几种如地高辛、哇巴因和前海葱苷原A并不改变H1975细胞对1μM吉非替尼的敏感性(图2B-2D)。
2、强心苷药物与吉非替尼在耐药性NSCLC细胞中的相互作用
上结果表明吉妥辛和洋地黄毒苷可以提高耐药性细胞系H1975和H1650的吉非替尼敏感性。为了了解这两种强心苷与吉非替尼的相互作用,我们采用了目前药物研究领域广泛用于评价药物相互作用的Chou-Talalay模型。根据该模型,我们首先确定了各种药物在H1975和H1650中的半数抑制浓度IC50(表1)。其次,根据固定的IC50比设计下列三组浓度,吉妥辛组:IC50/16、IC50/8、IC50/4、IC50/2、IC50、2×IC50、4×IC50、8×IC50、16×IC50;吉非替尼组:IC50/16、IC50/8、IC50/4、IC50/2、IC50、2×IC50、4×IC50、8×IC50、16×IC50;联合用药组:各个浓度两种药物对应联合。
表1各药物在H1975和H1650中的IC50
用以上浓度药物处理处理H1975细胞48小时,MTS法检测细胞生存率并作出生存曲线(图3A)。然后,根据生存曲线计算两种药物在不同浓度的联合指数(combine index,CI),并做出CI值分布图(图3-B)。通常认为:当CI>1.1时,两种药物的相互作用为拮抗作用;当CI=0.9~1.1时,两种药物的相互作用为加和作用;当CI<0.9时,两种药物的相互作用为协同作用。因此,不难发现吉妥辛和吉非替尼对H1975生长的抑制是协同性的。此外,用同样的方法评价了吉妥辛和吉非替尼在H1650中的相互作用。结果显示,这两种药物对H1650生长的抑制也具有协同效应(图3C,3D)。
接着,我们评价了洋地黄毒苷与吉非替尼在上述两种细胞系中的相互作用。结果显示,洋地黄毒苷与吉非替尼之间也存在协同作用(图4A-4D)。
此外,我们还评价了地高辛、哇巴因和前海葱苷原A与吉非替尼在H1975中的相互作用,结果表明,地高辛和吉非替尼有较弱的协同性(图5A-5B),而哇巴因和前海葱苷原A与吉非替尼则没有协同性(图5C-5F)。这与我们之前关于地高辛、哇巴因和前海葱苷原A对H1975吉非替尼敏感性的影响的结果也是一致的。
3、吉妥辛/洋地黄毒苷与吉非替尼联合用药对H1975和H1650凋亡的影响
以上结果表明,吉妥辛/洋地黄毒苷可以通过与吉非替尼协同性抑制H1975、H1650的生长来提高这两种细胞的吉非替尼敏感性。下面,我们将以吉妥辛和洋地黄毒苷为主,研究强心苷在吉非替尼耐药性NSCLC中的潜在应用价值。为了进一步确定联合用药对H1975和H1650的影响,我们分别探究了吉妥辛/洋地黄毒苷与吉非替尼联合用药对这两种细胞凋亡的影响。
首先,用DMSO、吉妥辛IC50浓度、吉非替尼IC50浓度、吉妥辛IC50浓度+吉非替尼IC50浓度处理H1975细胞48h,然后用Annexin V/PI细胞凋亡检测法检测细胞的凋亡状态。结果显示,吉妥辛和吉非替尼联合用药能够比单独用药更明显地诱导H1975细胞的凋亡(图6A,6B)。同样,在H1650中,吉妥辛和吉非替尼联合用药能够比单独用药更明显地诱导细胞的凋亡(图6C-6D)。
其次,我们用相同的方法评价了洋地黄毒苷和吉非替尼联合用药对H1975和H1650细胞凋亡的影响。结果显示,这两种药物联合使用能够比单独用药更明显地诱导H1975和H1650细胞的凋亡(图7A-7D)。
同时,我们还用蛋白印记杂交法检测了上述药物处理对各个细胞系凋亡分子PAPR的影响。结果显示,吉妥辛和吉非替尼联合用药能够比单独用药更明显促进H1975和H1650细胞中PARP蛋白的表达(图8A-8B)。同样,洋地黄毒苷和吉非替尼联合用药也能够比单独用药更明显促进H1975和H1650细胞中PARP蛋白的表达(图8C-8D)。这表明吉妥辛和洋地黄毒苷与吉非替尼联合用药能更加有效的促进细胞凋亡,与之前用流式细胞法分析的结果相一致。
4、吉妥辛/洋地黄毒苷提高NSCLC细胞吉非替尼敏感性的机制探索
以上结果表明强心苷药物吉妥辛和洋地黄毒苷可以显著提高NSCLC细胞系H1975和H1650的吉非替尼敏感性。那么在这里,它们的耐药性是如何被克服的?其分子机制又是什么?下面,我们尝试从三个角度去解释这种现象。
吉妥辛/洋地黄毒苷可能是通过协同性地抑制Erk通路来提高H1975和H1650的吉非替尼敏感性的
H1975和H1650之所以会产生吉非替尼耐药性,主要是由于EGFR在发生二次突变后,TKI不能够有效抑制EGFR而使其下游的信号通路如Akt、Erk1/2、mTOR等过度激活而导致的。因此,在探索吉妥辛/洋地黄毒苷克服NSCLC细胞吉非替尼耐药性时,我们首先分析了这种联合用药策略对EGFR及其下游各信号通路的影响。
首先,在H1975细胞中,我们分别用DMSO、2.25μM吉非替尼、75nM吉妥辛、和2.25μM吉非替尼+75nM吉妥辛处理细胞12h,提取细胞蛋白,用蛋白印记杂交检测相关信号通路的活性。结果显示,联合使用吉妥辛和吉非替尼可以比单独用药更好地抑制Erk1/2的磷酸化,而对其他信号通路则没有这种作用(图9A)。
同样,我们检测了联合用药对H1650细胞对Erk的影响。与H1975中观察到的结果类似,联合使用吉妥辛和吉非替尼可以比单独用药更好地抑制Erk1/2的磷酸化(图9B)。此后,我们检测了强心苷药物洋地黄毒苷/地高辛与吉非替尼联合用药对H1975细胞Erk1/2磷酸化的影响。结果显示,与吉妥辛相同,洋地黄毒苷也可以与吉非替尼协同性地抑制Erk1/2的磷酸化,但地高辛与吉非替尼联合则与单独使用吉非替尼对Erk1/2磷酸化影响相似,没有表现出协同性(图9C-9D),这与我们前面关于药物相互作用的结果也是一致的。
Erk信号通路参与一系列重要的细胞生命活动过程。有研究表明,Erk可以通过调节其下游的转录因子而参与细胞周期的调控,它还可以通过调节一些凋亡相关蛋白影响细胞的凋亡程序。而且,在多种肿瘤中,Erk通路过度激活,这也被认为是肿瘤发生的一个重要因素。此外,作为EGFR下游的一个重要分支通路,研究发现,Erk很可能与NSCLC的耐药性有一定关系。本研究比较了吉非替尼耐药性细胞系H1975、H1650与敏感性细胞系HCC827、PC9中Erk磷酸化水平对吉非替尼的敏感性。结果显示,相同浓度的吉非替尼可以非常显著地抑制敏感性细胞系HCC827和PC9中Erk的磷酸化(图10A-10B),但是对耐药性细胞系H1975和H1650影响并不明显(图10C-10D)。这提示,Erk的磷酸化水平与吉非替尼敏感性之间有一定关系。
为了证明这种关系,我们用吉非替尼、吉非替尼+PD98059处理H1975细胞,其中PD98059为Erk通路的抑制剂。结果显示,加入PD98059后,细胞的生长受到明显抑制(图10E)。同样,在H1650中我们观察到了同样的现象(图10F)。这表明,抑制Erk通路可以提高耐药性NSCLC对吉非替尼的敏感性。而我们筛选到的药物吉妥辛和洋地黄毒苷与吉非替尼联合使用都可以协同性地抑制Erk,因此,吉妥辛/洋地黄毒苷对H1975和H1650的吉非替尼敏感性的提高至少部分是通过抑制Erk实现的。
吉妥辛对NSCLC细胞吉非替尼敏感性的提高与肿瘤干细胞的关系
2010年,Raffaella Sordella团队发现,即使在吉非替尼敏感的NSCLC细胞中也存在一群对TKI耐药的细胞,参见Yao Z,Fenoglio S,Gao D C,et al.TGF-beta IL-6axismediates selective and adaptive mechanisms of resistance to molecular targeted therapy in lungcancer[J].Proc Natl Acad Sci U S A.2010,107(35):15535-15540,该类细胞具有与干细胞相类似的特性,称为肿瘤干细胞。2012年Chi-Tai Yeh利用针对肿瘤干细胞的方法筛选到一种药物Trifluoperazine,它可以有效抑制NSCLC中的肿瘤干细胞,并因此克服NSCLC的吉非替尼耐药性,参见,Yeh C T,Wu A T,Chang P M,et al.Trifluoperazine,anantipsychotic agent,inhibits cancer stem cell growth and overcomes drug resistance of lungcancer[J].Am J Respir Crit Care Med.2012,186(11):1180-1188。这些研究结果表明,肿瘤干细胞的存在与NSCLC耐药性之间有一定关系。为了探索吉妥辛/洋地黄毒苷对NSCLC细胞吉非替尼敏感性提高的机制,我们比较了联合用药对肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞的药效。
首先,利用Hoechest染色的方法将H1975中的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞分开。用DMSO、4.5μM吉非替尼、150nM吉妥辛和4.5μM吉非替尼+150nM吉妥辛分别处理这两群细胞48h,用MTS法检测其生存率。结果显示,在这两群细胞中,吉妥辛与吉非替尼联合使用都比单独用药能更好地抑制细胞的生长。但是,这两群细胞对于联合用药并没有表现出明显的差异(图11A)。这表明,联合用药对肿瘤干细胞并没有表现出特异性,吉妥辛对H1975吉非替尼敏感性的提高很可能不是通过抑制肿瘤干细胞实现的。此外,我们用DMSO、4.5μM吉非替尼、20nM洋地黄毒苷和4.5μM吉非替尼+20nM洋地黄毒苷分别处理H1975细胞48h,用Hoechest染色的方法分析侧群细胞比例。结果显示,吉非替尼组和4.5μM吉非替尼+20nM洋地黄毒苷组侧群细胞比例显著降低,但是20nM洋地黄毒苷组没有明显变化(图11B)。这表明联合作用不是通过抑制侧群细胞实现的。
5、洋地黄毒苷和吉非替尼联合用药对小鼠移植瘤生长的影响
除了探索强心苷与吉非替尼联合用药对耐药性NSCLC细胞系的影响,我们还在小鼠体内评价了这种联合用药方式对移植瘤生长的影响。首先,我们选取6周大小的免疫缺陷小鼠,并对其皮下注射H1975细胞。当小鼠肿瘤长到50mm3时,将小鼠随机分为4组,每组7只。每天对小鼠进行如下剂量的给药:对照、50mg/kg/d吉非替尼、0.6mg/kg/d洋地黄毒苷和50mg/kg/d吉非替尼+0.6mg/kg/d洋地黄毒苷。每3天测量一次小鼠肿瘤体积,为期4周,根据数据做出肿瘤生长曲线。结果显示,吉非替尼和洋地黄毒苷联合用药组的肿瘤生长明显比单独用药组慢(图12A)。最后,对小鼠进行解剖,发现吉非替尼和洋地黄毒苷联合用药组的肿瘤大小明显小于单独用药组(图12B)。
二、吉妥辛单独用药对耐药性NSCLC的抑制作用
NSCLC吉非替尼耐药性的产生使得TKI的临床效果变得十分有限,因此,我们急需寻找解决这一问题的方法。除了上述的联合用药策略,筛选开发吉非替尼的替代药物也成为一个研究热点。强心苷作为一类可以抑制Na+/K+-ATP酶的化合物多年来被广泛用于治疗心脏衰竭和心率失调。近期研究表明,该类药物还可以通过影响信号通路参与调节一系列重要的细胞功能。其中,关于强心苷抗肿瘤作用的报道越来越多,并且基于此类化合物的抗肿瘤药物也已经进入临床试验阶段。因此,在本研究中,除了评价强心苷与吉非替尼联合用药对耐药性NSCLC的治疗效果,我们还比较了强心苷药物吉妥辛与吉非替尼对NSCLC的作用,初步探讨强心苷作为吉非替尼替代药物的可能性。
1、比较H1975细胞对吉非替尼和吉妥辛的敏感性
首先我们比较了NSCLC耐药性细胞系H1975对吉非替尼和吉妥辛的敏感性。不同浓度的吉非替尼和吉妥辛处理H1975细胞48h后,根据细胞存活率做出其生存曲线(图13A),并计算两种药物的IC50。结果显示,相同浓度的吉妥辛比吉非替尼能更有效地抑制H1975的生长,其IC50为0.24±0.04μM,也远远低于吉非替尼的6.07±0.38μM。用300nM的吉妥辛和300nM的吉非替尼处理H1975细胞48h后,对其凋亡率进行流式分析(图13-B),观察到吉妥辛处理组的细胞凋亡显著高于吉非替尼组(图13C)。
2、吉妥辛对小鼠移植瘤生长的影响
为了进一步评价吉妥辛对NSCLC的影响,我们进行了动物移植瘤实验。利用对吉非替尼耐药的H1975细胞系建立小鼠移植瘤模型,模拟体内抗药性NSCLC。接种第10天,当瘤体长到50~75mm3时,将小鼠随机分为两组,分别为对照组和吉妥辛组。小鼠每天分别口服PBS和吉妥辛(1mg/kg·d),并定期测量肿瘤大小,做出肿瘤生长曲线(图14A)。结果显示,吉妥辛处理组小鼠的肿瘤生长明显比对照组慢。最后一个时间点,其肿瘤体积也明显小于对照组(图14B)。而根据现有文献,基于H1975的小鼠移植瘤通常对50-100mg/kg·d的给药量耐受。这提示我们,与对吉非替尼相比,NSCLC耐药性移植瘤可能对吉妥辛更加敏感。但是,这一现象还有待更多实验的验证。
3、吉妥辛可能通过影响Erk1/2信号通路抑制H1975细胞的生长
研究表明,包括吉妥辛在内的强心苷通常可以抑制Na+/K+-ATP酶活性,后者作为信号分子影响下游一系列信号通路来发挥其抗癌作用。为了阐明吉妥辛对NSCLC的抑制机制,本研究对Na+/K+-ATP酶下游的常见信号通路进行了检测。结果表明,吉妥辛可以剂量依赖性和时间依赖性地抑制Erk1/2的磷酸化(图15A-15B)。考虑到Erk1/2在肿瘤细胞增殖和凋亡中的重要作用,我们初步推测吉妥辛对耐药性NSCLC的抑制可能部分是通过抑制Erk1/2信号通路实现的。
结论
1、强心苷中的吉妥辛/洋地黄毒苷可以协同性地提高H1975和H1650对吉非替尼的敏感性;
2、这种吉非替尼敏感性的提高部分是由于吉妥辛/洋地黄毒苷与吉非替尼联合使用对Erk信号通路的协同性抑制;
3、洋地黄毒苷与吉非替尼联合用药可以比单独用药更有效地抑制H1975小鼠移植瘤的生长;
4、强心苷药物吉妥辛对耐药性NSCLC的抑制可能强于吉非替尼,可作为吉非替尼的潜在替代药物进一步研究。
5、强心苷中的吉妥辛/洋地黄毒苷可单独用于治疗NSCLC。
Claims (10)
1.强心苷化合物在制备用于治疗非小细胞肺癌的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、肺腺癌和大细胞肺癌。
3.根据权利要求1所述的用途,其中所述非小细胞肺癌是酪氨酸激酶抑制剂耐药性的非小细胞肺癌。
4.根据权利要求3所述的用途,其中酪氨酸激酶抑制剂选自吉非替尼或厄洛替尼。
5.根据权利要求1至4任一项所述的用途,其中所述的强心苷化合物选自吉妥辛、洋地黄毒苷、地高辛、哇巴因或前海葱苷原A。
6.强心苷化合物联合酪氨酸激酶抑制剂在制备用于治疗非小细胞肺癌的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途,其中所述非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、肺腺癌和大细胞肺癌。
8.根据权利要求6所述的用途,其中所述非小细胞肺癌是酪氨酸激酶抑制剂耐药性的非小细胞肺癌。
9.根据权利要求8所述的用途,其中酪氨酸激酶抑制剂选自吉非替尼或厄洛替尼。
10.根据权利要求6至9任一项所述的用途,其中所述的强心苷化合物选自吉妥辛、洋地黄毒苷、地高辛、哇巴因或前海葱苷原A。
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