CN110354118A - 青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用。青蒿素具有广泛的生物和药理作用，其中有效的抗肿瘤作用近年来引起了广泛的关注。青蒿素发挥特定抗癌活性的机制仍不清楚，这可能限制其在临床前和临床环境中的进一步发展。本发明探索了青蒿素对肝癌细胞HepG2具有抑制作用；及发现了其抗肝癌的作用机制，为肝癌患者的治疗和诊断提供新方法，为青蒿素在临床肝癌治疗中的应用奠定理论基础。因此，青蒿素可作为诱导人肝癌细胞凋亡候选药物进行研究和开发。

Description

青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的 应用

技术领域

本发明涉及一种肝癌治疗药物，属于生物制药技术领域，具体涉及一种青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用。

背景技术

肝癌(HCC)是全球癌症相关死亡的主要原因之一，超过80％的肝癌病例发生在中国和非洲等发展中国家。HCC具有长潜伏期，但发展迅速通常到晚期时才被诊断出来。这些特征加上其高度入侵的可能性，导致患有该疾病的患者不能得到有效的治疗。非手术方法是必要的，因为患有大肿瘤(直径>5cm)或多个病灶(>3)的患者通常不适合肝切除术。不幸的是，单一化学治疗剂的活性是有限的，具有非常低的治疗率。

青蒿素(ART)是一种从植物青蒿(Artemesiaannua L)中分离出来的天然产物，被广泛用作抗疟疾药物。近年来，ART及其衍生物也已经显示出具有抗癌作用，其抗癌活性的主要机制是诱导细胞凋亡。青蒿素及其衍生物的选择性抗癌潜力与c-MYC， cdc25A，EGFR，γ-谷氨酰胺合成酶(GLCLR)等不同分子的表达有关。ART还在多种癌症类型及体内发挥抗癌作用。

ART还调节u-PA，MMP2，MMP7和MMP9的水平，所有这些都与转移相关。但青蒿素在肝癌细胞中的应用和作用机制研究尚少，虽然详细的机制仍有待阐明。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种生物治疗肿瘤候选药物青蒿素在制备抗肿瘤中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明公开一种青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用，含有药学上的治疗有效剂量的青蒿素，所述青蒿素能够通过抑制肝癌细胞HepG2 中Beta-catenin蛋白细胞质向细胞浆的转换，进而抑制EMT的发生，从而抑制HepG2 的增殖。

本发明所述的应用，所述青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体，分子式为C₁₅H₂₂O₅，属倍半萜内酯，制备熔点为 156-157℃，[a]_D17＝+66.3°(C＝1.64氯仿)。

本发明所述的应用，所述青蒿素的浓度≥100μM，所述候选药物可制成片剂，其制备方法为：

1)将青蒿素和淀粉过80目筛；

2)10％淀粉浆的制备：将0.3g枸橼酸溶解于20ml蒸馏水中，再加入2g淀粉分散均匀，加热约80℃使淀粉糊化，冷却至温浆后使用；

3)称取30g青蒿素的细粉于乳钵中，等量分次加入2g淀粉进行研磨，混合均匀，加入适量淀粉浆制备软材；

4)将20目尼龙筛制备湿颗粒，将湿颗粒与50～60℃烘箱干燥30min，用20目筛进行整粒，整粒后颗粒与1.5g滑石粉和1g淀粉混合均匀，以8mm冲模进行冲模压片；即得青蒿素片剂。

本发明所述的应用，所述药物可制成混悬注射液，其制备方法为：

1)取注射用油加热至115～125℃，保温1～2小时，加入助悬剂，搅拌溶解，降温到50℃以下，备用；

2)将步骤1)的物质置于高速胶体磨中，加入青蒿素0.5～10.0g，以4000r/min的速度，高速剪切30min，制成混悬液，备用；

3)将步骤2)的液体，依次加入助悬剂0.1～5.0g、抗氧化剂0.05～0.5g、湿润剂1.0～3.0g、絮凝剂0.2～2.0g，边加边搅拌，直至完全均匀，再连续研磨10min，备用；

4)将步骤3)的研磨后的液体，置于高压均质机中，以压力50-55兆帕，进行高压均质，然后，灌装封口，包装，即得100mL青蒿混悬注射液。

本发明具有如下优点和有益技术效果：

1)发现青蒿素对人肝癌HepG2细胞具有抑制作用，并呈现良好的时间和浓度依赖性；

2)青蒿素可诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡；

3)青蒿素可抑制Beta-catenin从细胞质向细胞核的转运，进而抑制EMT的发生，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移；

本发明为研制新的抗肿瘤候选药物提供了科学依据，对开发中药新药具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施列1中细胞活力实验检测青蒿素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。

图2为本发明实施列1中细胞克隆形成实验检测青蒿素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。

图3为本发明实施列2中细胞流式实验检测青蒿素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用。

图4为本发明实施列3中Western blot检测青蒿素对HepG2细胞内PARP蛋白的表达量。

图5为本发明实施列4中Western blot检测青蒿素对HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施列和图表详细说明本发明的技术方案，但本发明并不仅限于以下的实施例。

本发明提供一种生物治疗肿瘤候选药物青蒿素在制备抗肿瘤中的应用。具体涉及一种青蒿素抑制细胞质内Beta-catenin蛋白向细胞核的转换进而诱导肝癌HepG2细胞凋亡；所述的体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞(HepG2)。

青蒿素的低宿主毒性，是开发青蒿素作为抗癌剂的主要动力。故本发明人发现青蒿素在人肝癌HepG2细胞中具有抗肝癌作用，可以作为抗肝癌候选药物开发的潜在价值。

本发明通过细胞活力测试、细胞克隆形成实验、细胞流式实验、Western blot实验、免疫荧光实验等研究证实了青蒿素具有诱导肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制。

以下实验所用的青蒿素是购买于美国sigma公司。

各种试验仪器与试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。其中，青蒿素由传统中草药黄花蒿中提取有效成分制得，购买于美国sigma公司，产品型号为361593，青蒿素含量为98％，体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞(HepG2)，来源于美国ATCC 细胞库。

实施例1：

将青蒿素药物制成片剂，其制备方法为：

1)将青蒿素和淀粉过80目筛；

2)10％淀粉浆的制备：将0.3g枸橼酸溶解于20ml蒸馏水中，再加入2g淀粉分散均匀，加热约80℃使淀粉糊化，冷却至温浆后使用；

3)称取30g青蒿素的细粉于乳钵中，等量分次加入2g淀粉进行研磨，混合均匀，加入适量淀粉浆制备软材；

4)将20目尼龙筛制备湿颗粒，将湿颗粒与50～60℃烘箱干燥30min，用20目筛进行整粒，整粒后颗粒与1.5g滑石粉和1g淀粉混合均匀，以8mm冲模进行冲模压片；即得青蒿素片剂。

给药方法：

成人常用量：口服给药，先服1g，6～8小时再服0.5g，第2、3日各服0.5g，疗程3日，总量为2.5g。小儿15mg/kg，按上述方法3日内服完。

注意事项：妊娠早期慎用。

实施例2：

将青蒿素药物制成混悬注射液，其制备方法为：

1)取注射用油加热至115～125℃，保温1～2小时，加入助悬剂，搅拌溶解，降温到50℃以下，备用；

2)将步骤1)的物质置于高速胶体磨中，加入青蒿素0.5～10.0g，以4000r/min的速度，高速剪切30min，制成混悬液，备用；

3)将步骤2)的液体，依次加入助悬剂0.1～5.0g、抗氧化剂0.05～0.5g、湿润剂1.0～3.0g、絮凝剂0.2～2.0g，边加边搅拌，直至完全均匀，再连续研磨10min，备用；

4)将步骤3)的研磨后的液体，置于高压均质机中，以压力50-55兆帕，进行高压均质，然后，灌装封口，包装，即得100mL青蒿混悬注射液。

给药方法：深部肌注：第1次200mg，6～8小时后再给100mg，第2、3日各肌注100mg，总剂量500mg(别重症第4天再给100mg)。连用3日，每日肌注300mg，总量900mg。小儿15mg/kg，按上述方法3日内注完。

注意事项：妊娠早期慎用。

效果验证试验例

试验例1-1(青蒿素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用)

1、Cell Viability Assay法测定细胞增殖

1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2细胞，用DMEM(含有10％FBS 和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到3*10⁴个/ml，接种到96孔板，每孔 100μL细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO₂培养过夜。

2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、50μM、100μM、150μM、200μM，每种浓度设置6个重复。阴性对照组加等量的DMEM。放入培养箱分别培养24h、48h和72h。

3)待药物作用到相应时间点后，从培养箱中取出96孔板，分别加入 20μLCellTiter-Luminescent Cell Viability Assay，注意避光，放入培养箱孵育10分钟后，使用Bio-Rad细胞城乡检测仪测量Luminescent的吸光度。

4)细胞存活率(cell viability％)＝(加药组/阴性对照组)×100％。

实验重复三次，分别计算不同时间下青蒿素对人肝癌HepG2细胞的抑制情况。

试验例1-2(细胞克隆形成实验)

1)制备细胞悬液：弃旧培养基，PBS洗一遍后加1mL 0.25％的胰酶消化3min，显微镜下观察大部分细胞变圆时，弃胰酶，加2倍所加胰酶量的完全培养基终止消化，将瓶内细胞轻轻吹下，并转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min。

2)弃上清，加入新鲜培养基，1/3的细胞悬液留种，其余备用。

3)细胞计数和铺板：细胞悬液吹打混匀后，吸取10μL加入血球计数板在显微镜下计数。向12孔板的每孔加入2ml浓度调整过的细胞悬液，细胞数为2000个/孔，置于 37℃，5％CO₂培养箱中培养，使其过夜贴壁。

4)加药：弃去旧培养基，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、 50μM、100μM、150μM，每种浓度设置3个重复。

5)将平板在37℃，5％CO₂下孵育7天以允许菌落生长。在长期孵育期间，每三天更换含有不同浓度的青蒿素(0μM、50μM、100μM、150μM)的新鲜完全培养基。用 1X PBS洗涤细胞两次，0.01％结晶紫溶液染色。Gel Doc TM XR+Imager(Bio-Rad)捕获图像。为了量化集落形成的速率，将集落形式的染色细胞溶解在10％(v/v)乙酸中，在540nm处定量吸光度。

6)数据统计：细胞克隆形成率＝(加药组/阴性对照组)×100％。

细胞活力结果显示：分别作用24h、48h、72h后，青蒿素能剂量依赖和时间依赖性抑制HepG2细胞的增殖。

由图1A可见，在同一作用时间的药物浓度越高，与空白对照相比细胞增殖抑制率也随着增高。

由图1B可见，在青蒿素浓度为100μM时，对人肝癌HepG2细胞的抑制有差异统计学意义。

细胞克隆形成实验结果显示：与空白对照组相比较，青蒿素对人肝癌HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用。且在青蒿素浓度为100μM时，肝癌细胞的集落形成抑制在 50％以下，且随着青蒿素浓度增大，抑制效果越好。故后续实验我们选取青蒿素浓度为 100μM。如图2所示。

试验例2

细胞流式实验检测青蒿素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的影响。

1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2细胞，用DMEM(含有10％FBS 和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到5*10⁶个/ml，接种到6孔板，每孔100μL 细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO₂培养过夜。

2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、100μM，每种浓度设置3个重复。阴性对照组加等量的DMEM。放入培养箱培养24h。

3)将细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。

4)加入步骤2a中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意：加入步骤1中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-PE导致染色失败。

5)取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-PE 结合液轻轻重悬细胞。

6)加入5μl Annexin V-PE，轻轻混匀。注：由于细胞样品的差异、凋亡和坏死程度的差异，可根据预实验结果优化Annexin V-PE的使用量。

7)室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善标记效果。

8)随即进行流式细胞仪检测。

9)数据统计。

以上实验重复三次。

实验结果显示：Annexin V-FITC/PI双染结果显示，在青蒿素药物浓度为100μM作用24h时，与空白对照相比较，实验组的细胞凋亡率增加。对照组HepG2细胞的凋亡率分别为13.36％，经100μM青蒿素处理24h后，实验组HepG2细胞的凋亡率为24.16％，其凋亡率明显升高(图3)。

试验例3

Western blot检测青蒿素对HepG2细胞内PARP蛋白表达的变化。

考察的相关蛋白有：PARP。

1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2细胞，用DMEM(含有10％FBS 和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到5*10⁶个/ml，接种到6孔板，每孔100μL 细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO₂培养过夜。

2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、100μM、200μM每种浓度设置3个重复。阴性对照组加等量的 DMEM。放入培养箱培养24h。

3)从培养箱中取出细胞，吸掉培养基，轻轻加入冰的PBS清洗一遍，弃掉残留液体。

4)用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

5)使用BCA试剂盒测蛋白浓度：用BSA作为标样做标准曲线，在96孔板中加入 2μl蛋白溶液和200ul BCA工作液(A：B＝50：1)37℃反应30min，用酶标仪在450nm 检测吸光度，利用吸光度浓度计算公式计算样本浓度。按其中浓度最低的样品为参照，将所有样品浓度调节一致。

6)加入v/2蛋白变性loading Buffer在金属浴中95℃变性10min，离心后可直接上样，或长期保存在-80℃冰箱。

7)上样：westernblotting上样，每孔上样20ul，根据样品数量选择孔数，电压200V，时间30min左右(预制胶)。

8)转膜：切一块长9cm、宽6cm的PVDF膜和两张相同大小的滤纸，将膜放在甲醇中浸泡，滤纸、膜、凝胶和滤纸“三明治”式放置湿转250mA、90min，胶面向黑的一测即负极，切勿放错位置，做好方向标记。

9)封闭：将膜放在TBST配制5％的牛奶中封闭1h后，TBST清洗4次，每次5min。

10)孵育一抗：一抗用5％的BSA+0.02％的叠氮钠1：1000稀释。4℃摇床孵育过夜，一抗稀释液可有放在-20℃保存多次使用。

11)清洗：用TBST清洗4次，放在摇床，低速摇晃，每次10min。

12)孵育二抗：二抗用TBST配制的5％牛奶按1：5000稀释，放置在摇床，室温孵育2h。二抗稀释液最好不要反复使用。

13)清洗：使用TBST摇晃清洗4次，每次5min。

14)曝光：显影液试剂盒A与B液按1：1配用，使用时，覆盖住膜反应1min左右放入蛋白成像系统中曝光。

以上实验重复三次。

结果显示：与空白对照相比较，加入青蒿素后，HepG2细胞内PARP蛋白表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)，青蒿素能过诱导HepG2细胞凋亡。如图4所示。

试验例4

4-1青蒿素对HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达的变化影响。

1.Western Blot实验检测HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达

1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2细胞，用DMEM(含有10％FBS 和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到5*10⁶个/ml，接种到6孔板，每孔100μL 细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO₂培养过夜。

2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、100μM、200μM每种浓度设置3个重复。阴性对照组加等量的 DMEM。放入培养箱培养24h。

3)从培养箱中取出细胞，吸掉培养基，轻轻加入冰的PBS清洗一遍，弃掉残留液体。

4)每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。

5)最高速剧烈Vortex 5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长vortex时间。)

6)冰浴10-15分钟。

7)加入细胞浆蛋白抽提试剂B10微升。最高速剧烈Vortex 5秒，冰浴1分钟。

8)最高速剧烈Vortex 5秒，4℃12,000-16,000g离心5分钟。

9)立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。每200万细胞用200微升本产品中的细胞浆蛋白抽提试剂A裂解后可获得的上清，其细胞浆蛋白浓度约为2-5mg/ml，不同细胞有所不同。)

10)对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)

11)最高速剧烈Vortex 15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒，共30分钟。

12)4℃12,000-16,000g离心10分钟。

13)立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。

14)加入100μl的RIPA细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂)，用细胞刮铲刮下细胞，吸到EP管中，插入冰里裂解1h，期间颠倒几次使细胞裂解充分。

15)将EP管放在4℃离心机中14000rpm离心20min，取上清。

16)使用BCA试剂盒测蛋白浓度：用BSA作为标样做标准曲线，在96孔板中加入2μl蛋白溶液和200ul BCA工作液(A:B＝50：1)37℃反应30min，用酶标仪在450nm 检测吸光度，利用吸光度浓度计算公式计算样本浓度。按其中浓度最低的样品为参照，将所有样品浓度调节一致。

17)加入v/2蛋白变性loading Buffer在金属浴中95℃变性10min，离心后可直接上样，或长期保存在-80℃冰箱。

18)上样：western blotting上样，每孔上样20ul，根据样品数量选择孔数，电压200V，时间30min左右(预制胶)。

19)转膜：切一块长9cm、宽6cm的PVDF膜和两张相同大小的滤纸，将膜放在甲醇中浸泡，滤纸、膜、凝胶和滤纸“三明治”式放置湿转250mA、90min，胶面向黑的一测即负极，切勿放错位置，做好方向标记。

20)封闭：将膜放在TBST配制5％的牛奶中封闭1h后，TBST清洗4次，每次5min。

21)孵育一抗：一抗用5％的BSA+0.02％的叠氮钠1：1000稀释。4℃摇床孵育过夜，一抗稀释液可有放在-20℃保存多次使用。

22)清洗：用TBST清洗4次，放在摇床，低速摇晃，每次10min。

23)孵育二抗：二抗用TBST配制的5％牛奶按1：5000稀释，放置在摇床，室温孵育2h。二抗稀释液最好不要反复使用。

24)清洗：使用TBST摇晃清洗4次，每次5min。

25)曝光：显影液试剂盒A与B液按1：1配用，使用时，覆盖住膜反应1min左右放入蛋白成像系统中曝光。

以上实验重复三次。

4-2免疫荧光实验检测HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达

1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2细胞，用DMEM(含有10％FBS 和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到5*10⁶个/ml，接种到6孔板，每孔100μL 细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO₂培养过夜。

2)24h后，换新鲜的DMEM培养基，实验组加入浓度为100μM的青蒿素，对照组加入等量的DMSO，培养24h。

3)吸干液体，随后在细胞上覆盖一层2-3mm用PBS稀释的4％甲醛。

4)室温下固定细胞15分钟。

5)吸干固定液，用PBS漂洗三次，每次5分钟。

6)在封闭缓冲液中封闭标本60分钟。

7)封闭标本时，按照说明书中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。

8)吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。

9)4℃温度下孵育过夜。

10)用PBS漂洗三次，每次5分钟。

11)用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后，室温下避光孵育标本1-2小时。

12)二抗Hoechst避光孵育1-2小时，PBS洗3遍,每次5分钟，5％甘油封片，在共聚焦显微镜下观察。实验重复三次。

结果显示：

Western blot实验结果显示，与空白对照相比较，加入青蒿素后，HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)，而细胞核内无趋势变化，青蒿素能过够抑制Beta-catenin从细胞质向细胞核的转运，进而抑制EMT的发生，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移(如图5A-5B所示)。免疫荧光结果与Western blot结果相符合(如图5C所示)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用，其特征在于：含有药学上的治疗有效剂量的青蒿素，所述青蒿素能够通过抑制肝癌细胞HepG2中Beta-catenin蛋白细胞质向细胞浆的转换，进而抑制EMT的发生，从而抑制HepG2的增殖。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体，分子式为C₁₅H₂₂O₅，属倍半萜内酯，制备熔点为156-157℃，[a]_D17＝+66.3°(C＝1.64氯仿)。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述青蒿素的浓度≥100μM。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述候选药物可制成片剂，其制备方法为：

1)将青蒿素和淀粉过80目筛；

2)10％淀粉浆的制备：将0.3g枸橼酸溶解于20ml蒸馏水中，再加入2g淀粉分散均匀，加热约80℃使淀粉糊化，冷却至温浆后使用；

3)称取30g青蒿素的细粉于乳钵中，等量分次加入2g淀粉进行研磨，混合均匀，加入适量淀粉浆制备软材；

4)将20目尼龙筛制备湿颗粒，将湿颗粒与50～60℃烘箱干燥30min，用20目筛进行整粒，整粒后颗粒与1.5g滑石粉和1g淀粉混合均匀，以8mm冲模进行冲模压片；即得青蒿素片剂。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述药物可制成混悬注射液，其制备方法为：

1)取注射用油加热至115～125℃，保温1～2小时，加入助悬剂，搅拌溶解，降温到50℃以下，备用；

2)将步骤1)的物质置于高速胶体磨中，加入青蒿素0.5～l0.0g，以4000r/min的速度，高速剪切30min，制成混悬液，备用；

3)将步骤2)的液体，依次加入助悬剂0.1～5.0g、抗氧化剂0.05～0.5g、湿润剂1.0～3.0g、絮凝剂0.2～2.0g，边加边搅拌，直至完全均匀，再连续研磨10min，备用；

4)将步骤3)的研磨后的液体，置于高压均质机中，以压力50-55兆帕，进行高压均质，然后，灌装封口，包装，即得100mL青蒿混悬注射液。