CN105503798B - 一类聚酮化合物的制备方法及其抗流感用途 - Google Patents

一类聚酮化合物的制备方法及其抗流感用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类聚酮化合物及其制备方法，本发明还披露了该类聚酮化合物的抗流感用途。

Description

一类聚酮化合物的制备方法及其抗流感用途
技术领域
本发明属于药学领域，本发明介绍了一类聚酮化合物及其制备方法，本发明还揭示了所述化合物的抗流感用途。
背景技术
流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，传染性强，发病率高，容易引起爆发流行或大流行。根据其内部核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原性不同，流感病毒可分为A型、B型和C型。A型(又称甲型)流感病毒大规模流行可引起极高的发病率和死亡率，严重威胁着人类的健康(W.H.O.2003；Coleman 2007)。A型流感病毒在二十世纪主要引起了三次大型流感，即1918年的H1N1，1957年的H2N2以及1968年的H3N2，共造成约5000万人死亡(Kilbourne 2006；Taubenberger,Hultin et al.2007)。2009年甲型流感也是由H1N1流感病毒引起(Dawood，Jain et al.2009；Zimmer and Burke 2009)，其传播之迅速，引起了世界的关注。据世界卫生组织统计，每年北半球有超过一亿人感染流感，并且有30-50万人死于流感，造成的经济损失超过百亿美元。目前，临床上应用的抗流感药物的主要作用靶点包括血凝素﹑RNA聚合酶﹑M2离子通道﹑核蛋白以及神经氨酸酶，如RNA聚合酶抑制剂T-705，M2离子通道阻断剂金刚烷胺以及神经氨酸酶抑制剂扎那米韦﹑奥斯他韦﹑帕拉米韦以及达菲等。由于流感病毒表面抗原能经常不断地发生变异，使本来有效的流感病毒疫苗很快失效。美国疾病预防控制中心抽样调查发现，2008/2009年的H3N2毒株和2009年大流行H1N1病毒中，100％的毒株对金刚烷类药物都具有耐药性；99.6％的季节性H1N1流感病毒对达菲具有耐药性(http://www.cdc.gov/flu/weekly/weeklyarchives 2008-2009/weekly35.htm)。我国人口基数大、密度高，流感的潜在威胁性极高。因此，新型多靶点抗流感病毒药物的研发，对于保障人民生命安全、提高国民生活质量具有重要的意义。
专利发明者通过前期研究，从一株深海真菌Spiromastix sp.发酵物中制备并鉴定了一系列结构新颖的聚酮化合物(式Ⅰ)，并通过抗流感病毒活性筛选，发现其具有显著的抗流感病毒活性。经过机制研究发现该类化合物有这独特的作用靶点和作用机制，即该类化合物通过靶向流感病毒的血凝素蛋白(HA)和核糖核蛋白复合体(RNP)，抑制了流感病毒进入宿主细胞和在细胞内的复制两个环节，从而发挥了显著地抗流感病毒活性。实验结果表明，式Ⅰ所示聚酮类化合物具有进一步开发成新型抗流感药物的潜力。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一类新的聚酮化合物。
本发明的目的之二在于提供该类聚酮化合物的制备方法。
本发明的目的之三在于揭示该类聚酮化合物在治疗流感方面的用途。
本发明第一方面提供式(Ⅰ)所示聚酮化合物：
式Ⅰ化合物，其中R1选自卤素(本发明中特指Cl)；R2选自羟基和甲氧基；R3选自卤素(本发明中特指Cl)；R4选自羟基和甲氧基。
本发明第二方面提供上述式Ⅰ化合物的制备方法，包括如下步骤：
1)利用深海真菌Spiromastix sp(F9).作为工程菌种，经过液体或固体发酵培养，获得含上述化合物的发酵物；
2)将发酵物通过硅胶﹑凝胶﹑ODS等色谱手段分离与纯化，从菌株发酵物中制备上述式Ⅰ化合物；
本发明第三方面本通过如下方法评价了上述式Ⅰ化合物抑制流感病毒进入细胞的生物活性：
1.细胞病变(CPE)抑制试验。
流感病毒感染细胞后会导致细胞病变，使得细胞活力降低。如果药物能够抑制流感病毒复制，则会降低细胞病变数量，提高细胞活力。具体来说：
1)将犬肾上皮细胞(MDCK)以1:3的比例传代到白色的96孔板中，在37℃细胞培养箱中用含10％FBS的DMEM培养基培养24h。
2)将流感病毒(A/WSN/33(H1N1)，感染复数(MOI)＝1)与一定浓度的待检化合物加入到100μL含有2μg/mL TPCK处理的胰酶、1％FBS的DMEM中，充分混匀。化合物的阴性对照为1％DMSO(稀释化合物所用的溶剂)。同时设立一组只加各化合物不加病毒实验组，用来检测化合物对细胞活力的影响。
3)将96孔板中的MDCK细胞的培养基吸出，将混合有病毒和化合物的培养基加入到MDCK细胞中，37℃细胞培养箱中培养48h。每个样品三个复孔。
4)用CellTiter-Glo荧光细胞活性检测试剂盒(Cat.G7571,Promega)检测细胞活力。首先将细胞和CellTiter-Glo检测试剂放于室温环境，待其温度平衡至室温，将100μL/孔的CellTiter-Glo检测试剂加入到细胞的培养上清中，震动2min后，避光静置10min。用仪器Tecan Infinite M2000 PROTM检测细胞活力。
5)EC50的计算方法：首先对化合物进行浓度系列稀释，然后利用上述方法测定出细胞活力。化合物对细胞病变的保护率＝100×(1-(Test compound–Median Virus1)/(Median Cells-Median Virus2)).其中Test compound表示只加待检化合物不加病毒组的细胞活力；Median Virus1表示加了待检化合物和病毒组的细胞活力；Median Cells表示只加入1％DMSO组的细胞活力；Median Virus2表示加入1％DMSO和病毒组的细胞活力。将化合物浓度和相应的保护率输入到软件Prism，即可计算EC50。此方法已被广泛应用于抗病毒药物筛选领域(Noah,Severson et al.2007)。
6)CC50的计算方法:CellTiter-Glo也可以用来检测化合物对细胞的毒性。首先对化合物进行浓度系列稀释，然后将其加入到细胞中，方法同2)--4)，但不加入病毒。培养48h后，测定细胞活力。然后将对照组细胞活力(1％DMSO)定义为100％，将其他各化合物组细胞活力标准化，除以对照组1％DMSO的细胞活力，再乘以100％。将化合物的浓度和相应的标准化的细胞活力输入到软件Prism，即可计算出CC50。
2.噬斑抑制实验。
利用噬斑抑制实验进一步印证化合物的抗病毒效果。具体方法如下：
1)将MDCK细胞传代到12孔板中，在37℃细胞培养箱中用含10％FBS的DMEM培养基培养24h。使细胞密度达到0.4×106细胞/孔。用PBS清洗细胞一次。
2)将A/WSN/33(H1N1)病毒(100PFU/孔)与系列稀释的化合物混合，稀释液为2μg/mL TPCK处理胰酶的DMEM。将混合液加入MDCK细胞中，置于37℃细胞培养箱中吸附1h。
3)将病毒液吸出，用PBS清洗细胞三次，除去未吸附的病毒。
4)用1mL含有1.5％低熔点琼脂糖、待检化合物、2μg/mL TPCK处理胰酶的无酚红DMEM覆盖细胞。注意温度不能过高，以免将细胞烫死。
5)待4℃琼脂糖凝固后(10-15min)倒置放于在37℃培养箱培养。3-4天后对噬斑进行计数，计算病毒滴度。如果化合物对病毒有抑制作用，则噬斑数量会减少。
3.加药时间点实验。
用以分析化合物作用于病毒感染细胞的哪一阶段。具体步骤：
1)将MDCK细胞传代到六孔板中，在37℃细胞培养箱中用含10％FBS的DMEM培养基培养24h。
2)将A/WSN/33(H1N1)病毒(MOI＝1)稀释到不含血清的DMEM中，感染MDCK细胞。
3)流感病毒从吸附到子代病毒粒子释放，其复制周期约为6-8h。故在以下时间段将药物加入到细胞培养基中：0–10、0–2、2–5、5–8或8–10h。
4)感染10h后，用冰预冷的PBS清洗细胞一次，用200μl/孔的PIPA裂解液裂解细胞。用细胞刮将细胞刮下，吸入1.5mL EP管中，置于冰上15min。以12,000rpm 4℃离心10min，将上清液转移到另一个1.5mL EP管中。
5)吸取30μl样品与等体积的2×蛋白上样缓冲液混合，100℃煮样10min。
6)将煮好的样品各20μL加入到12％的蛋白质凝胶加样孔中，进行SDS-PAGE电泳。
7)用免疫印迹法(Western blotting)检测流感病毒的NP蛋白的表达水平(以此来检测病毒在细胞内的复制情况)；同时以细胞蛋白GAPDH作为细胞内参(也可用于验证药物对细胞的毒性)
4.血凝抑制试验
此方法用来检测药物是否影响病毒与细胞受体之间的结合。具体方法：
1)制备1％(v/v)的鸡红细胞悬液。选1-2只健康鸡，将血液采集到等量抗凝液中混匀，置4℃冰箱保存。以800-1000rpm离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中800rpm离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4-5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液。放入4℃冰箱中可保存2-3d。使用时用1mL吸管吸取0.1mL红细胞，然后加入9.9mL的生理盐水，此即1％红细胞悬液。
2)确定病毒的血凝效价。将WSN流感病毒以2倍梯度做倍比稀释，稀释液为PBS。
3)将病毒液与1％红细胞悬液等体积(各50μL)混合加入到V底的96孔板中。置于微量振荡器上振荡1min，室温静置孵育30min。
4)将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，表明红细胞被病毒所凝集。在确定流感病毒的血凝效价后，确定合适的病毒使用量。
5)将药物、DMSO(阴性对照)或抗HA的特异性单克隆抗体(阳性对照)与病毒液混合后加入到细胞混悬液中。观察化合物对红细胞凝集有没有抑制效果。
5.表面等离子共振实验(SPR)
实验室新购置Biacore T200系统(GE Healthcare)，通过该体系对化合物和HA等进行结合力和动态动力学，计算出化合物和蛋白之间的结合力及动力学数据，包括Kd，Kon和Koff研究。具体步骤如下：首先将利用氨基偶联法将重组流感病毒HA蛋白偶联到CM5芯片上，此实验温度均在25℃下进行。HA最终的偶联量大约在16000RU左右。接下来，化合物作为分析物以不同的浓度流过芯片，系统缓冲液为PBS-P(10mM磷酸盐缓冲液含有2.7mM KCl，137mM NaCl和0.05％Surfactant P20，pH 4.5).对于结合实验，分析物的流速为30μL/min，结合时间60s，解离时间为60s。然后用系统缓冲液清洗，以及用50％的DMSO进行额外清洗。最后利用Biacore evaluation software(T200Version 1.0)以1:1结合的模式进行曲线模拟。
6.荧光素酶(Luciferase)实验
此试验方法是为了检测化合物是否对流感病毒的转录和复制有抑制效果。
1)转染293T细胞(12孔板)，质粒：PB1、PB2、PA和NP表达载体各100ng，fireflyluciferase和renilla luciferase各50ng。转染试剂：Megatrans1.0。转染6-8h换液。在转染的同时加入待测化合物。
2)测luciferase活性：利用Bright-Glo检测试剂盒检测luciferase的活性。操作方法见产品说明书。
7.qRT-PCR实验
该实验用于检测化合物是否抑制了流感病毒RNAs的水平。37℃用流感病毒WSN感染A549细胞(MOI＝1)1小时，用PBS洗掉没有吸附的病毒。然后在细胞培养基中加入化合物，37℃孵育7小时。用TRIzol法提取总RNA，然后用qRT-PCR检测流感病毒M1基因的vRNA，cRNA，mRNA的水平。详细操作方法参考AMV reverse transcriptase(Promega)试剂盒。
8.间接免疫荧光实验
用于检测化合物是否抑制流感病毒NP蛋白和dsRNA的水平。
1)6孔板中种A549细胞，37℃5％CO2孵箱孵育，待细胞长至合适密度，用流感病毒WSN感染细胞(MOI＝1)1h，PBS洗掉没吸附的病毒。加入化合物继续孵育6h。
2)用含4％多聚甲醛的PBS室温固定细胞30min以上(可4℃固定过夜)。
3)弃去多聚甲醛固定液，用PBST(含0.5％TritonX-100)洗3次。时间保持在15min以上。
4)用PBST配4％BSA 4℃封闭过夜或37℃1h，500μL/孔。
5)取出4℃封闭过夜的24孔板，加入一定浓度用BSA稀释的一抗。37℃1h。
6)PBST洗5次，500μL/孔，10min/次，慢摇。
7)选用相应的二抗荧光抗体，室温或37℃孵育1h，500μL/孔。
8)PBST洗5次，500μL/孔，10min/次，慢摇。
9)加入DAPI室温染色2～5min。PBST洗3次。
10)高内涵观察。
附图说明
图1：实施案例中聚酮化合物1-12的化学结构式；
图2：实施案例中聚酮化合物1的1H-NMR谱；
图3：实施案例中聚酮化合物1的APT谱；
图4：实施案例中聚酮化合物1的HSQC谱；
图5：实施案例中聚酮化合物1的COSY谱；
图6：实施案例中聚酮化合物1的HMBC谱；
图7：实施案例中聚酮化合物1的红外(IR)谱；
图8：实施案例中聚酮化合物1的高分辨质谱；
图9：实施案例中聚酮化合物1的X-ray单晶衍射晶体结构式；
图10：噬斑抑制实验图；
图11：加药时间点实验图；
图12：血凝抑制试验图；
图13：病毒融合实验图；
图14：利用SPR实验检测化合物与流感病毒HA蛋白的结合图；
图15：抑制流感病毒RNP实验图；
图16：抑制流感病毒RNAs实验图；
图17：抑制流感病毒NP蛋白和dsRNA实验图。
具体实施方案：
根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将更好的理解本专利实质，下述实施方案仅作示例。
实例1：深海真菌Spiromastix sp.的固体发酵培养
1.菌株背景
Spiromastix sp.分离自南大西洋水下2869米海底沉积物(西经13.7501°，南纬15.1668°)，菌种保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC：3A00308，GeneBank：KJ010057)。
2.固体培养基的制备：
将100mL人工海水与100g大米加入500mL三角瓶中，静置12h，后于121℃高压湿热灭菌30min，放凉待用。
3.菌株发酵：
在PDA(马铃薯﹑葡萄糖﹑琼脂)培养皿上挑取长有新鲜Spiromastix sp.的琼脂片(1～2cm2)，接种于大米培养基上，25℃下避光恒温培养30d，得到发酵产物。
实例2：聚酮化合物1-12的制备
化合物1-12的制备
发酵产物捣碎后用乙酸乙酯超声萃取3次，每次1.5h，减压浓缩得粗浸膏(52.4g)。浸膏用等比例硅胶(160～200目)拌样，利用减压硅胶柱色谱以石油醚/丙酮为流动相梯度洗脱。硅胶柱色谱石油醚/丙酮(10：1，v/v)洗脱组分(6.1g)用ODS柱色谱以甲醇/水为流动相(20％～100％，v/v)梯度洗脱，60％洗脱组分首先经Sephadex LH-20甲醇分离，然后硅胶柱色谱石油醚/丙酮(5：1，v/v)得到化合物12(10.4mg)。
石油醚/丙酮(8：1，v/v)洗脱组分(8.2g)用ODS柱色谱以甲醇/水为流动相(20％～100％，v/v)梯度洗脱，得到10个组分。55％洗脱组分首先经Sephadex LH-20以甲醇为流动相分离，然后用半制备高效液相色谱以63％乙腈/水为流动相等度洗脱，纯化得到化合物4(6.4mg)，化合物5(67.4mg)，化合物6(18.9mg)，化合物7(8.2mg)，化合物8(8.9mg)，化合物9(22.6mg)；60％洗脱组分首先经Sephadex LH-20甲醇洗脱，后用半制备高效液相色谱以68％乙腈/水为流动相等度洗脱，纯化得到化合物2(15.6mg)，化合物3(28.5mg)，化合物8(8.9mg)，化合物11(25.2mg)；70％洗脱组分用ODS柱色谱以甲醇/水为流动相(40％～100％，v/v)梯度洗脱，60％洗脱组分经半制备高效液相色谱以70％乙腈/水为流动相等度洗脱，纯化得到化合物10(16.1mg)。70％洗脱组分经Sephadex LH-20甲醇洗脱，纯化得到化合物1(14.7mg)化合物的理化性质及波谱数据如下：
化合物1，白色晶体，溶于甲醇。[α]25 D+12°(c 0.1，MeOH)；IR(KBr)νmax 3311,2967,2872,1751,1588,1439,1375,1311,1214,1119,1058cm-1；HRESIMS m/z 473.03404[M-H]-(calcd for C21H21Cl3O6,473.03309)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 6.67/6.68(1H,s,H-3),2.79(2H,m,H-7),1.57(2H,m,H-8),0.92(3H,J＝7.3,H-9),5.58(1H,m,H-8’),1.92(1H,m,H-9’),2.20(1H,m,H-9’),0.71/0.78(3H,t,J＝7.3,H-10’),3.49/3.53(3H,s,OMe-2),3.84(3H,s,OMe-4),11.56(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC 138.5/138.4(C-1),148.7/149.2(C-2),97.4/97.1(C-3),151.8/151.9(C-4),113.3(C-5),132.9/132.8(C-6),30.6/30.5(C-7),21.9(C-8),14.4(C-9),109.7/109.8(C-1’),156.1/156.3(C-2’),109.2/109.1(C-3’),152.3(C-4’),114.6/114.8(C-5’),147.0/147.2(C-6’),165.3/165.4(C-7’),79.7/80.0(C-8’),24.5/24.7(C-9’),7.8/8.5(C-10’),56.9/57.1(OMe-2),56.8(OMe-4).
化合物2，无色油状，溶于甲醇。[α]25 D+13.4(c 0.1,MeOH)；IR(KBr)νmax 3420,2965,2930,2873,1743,1592,1466,1370,1213,1112,1067cm-1；HRESIMS m/z 459.01816[M-H]-(calcd for C20H19Cl3O6,459.01744)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 6.40/6.39(1H,s,H-3),2.75(2H,m,H-7),1.55(2H,m,H-8),0.91/0.90(3H,t,J＝7.2,H-9),5.55/5.58(1H,dd,J＝3.0,6.2,H-8’),1.87(1H,m,H-9’),2.21(1H,m,H-9’),8.1/8.5(3H,t,J＝7.3,H-10’),9.46(1H,s,OH-2),3.73(3H,s,OMe-4),11.53(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC137.5/137.3(C-1),146.5/146.7(C-2),99.2/99.3(C-3),151.3/151.4(C-4),111.4(C-5),133.0/132.9(C-6),30.6(C-7),21.9(C-8),14.5(C-9),109.5/109.6(C-1’),156.0/156.2(C-2’),109.7(C-3’),152.4/152.5(C-4’),114.9/115.1(C-5’),146.9/147.0(C-6’),165.4(C-7’),79.7/79.9(C-8’),24.8(C-9’),8.1/8.5(C-10’),56.4(OMe-4).
化合物3，无色油状，溶于甲醇。[α]25 D+15.7(c 0.1,MeOH)；IR(KBr)νmax 3295,2969,2872,1742,1592,1465,1367,1216,1061cm-1；HRESIMS m/z 459.01810[M-H]-(calcdfor C20H19Cl3O6,459.01744)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 6.47/6.49(1H,s,H-3),2.73(2H,m,H-7),1.54(2H,m,H-8),0.91/0.89(3H,t,J＝7.3,H-9),5.57(1H,m,H-8’),1.92(1H,m,H-9’),2.19(1H,m,H-9’),0.69/0.78(3H,t,J＝7.3,H-10’),3.39/3.45(3H,s,OMe-2),9.85(1H,brs,0H-4),11.52(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC 137.5/137.4(C-1),148.6/149.3(C-2),99.3/99.6(C-3),150.1/150.3(C-4),112.0/111.9(C-5),132.6/132.5(C-6),30.7/30.5(C-7),21.9(C-8),14.5(C-9),109.2/109.1(C-1’),156.1/156.2(C-2’),109.5/109.6(C-3’),152.5/152.4(C-4’),114.4/114.5(C-5’),147.0/147.2(C-6’),165.3/165.4(C-7’),79.6/79.9(C-8’),24.5/24.8(C-9’),7.7/8.5(C-10’),56.3/56.6(OMe-2).
化合物4，无色油状，溶于甲醇。[α]25 D+25.4(c 0.1,MeOH)；IR(KBr)νmax 3400,2936,2872,1702,1587,1453,1414,1340,1179,1055cm-1；HRESIMS m/z 459.01853[M-H]-(calcd.for 459.01744)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 6.66/6.65(1H,s,H-5),2.57(2H,m,H-7),1.60(2H,m,H-8),0.92/0.91(3H,t,J＝7.3,H-9),5.58/5.63(1H,dd,J＝3.0,6.2,H-8’),1.90(1H,m,H-9’),2.24(1H,m,H-9’),0.77/0.79(3H,t,J＝7.4,H-10’),3.37/3.39(3H,s.OMe-2),9.98(1H,s,OH-4),11.67(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC141.5/141.4(C-1),146.5/146.7(C-2),111.9(C-3),150.3(C-4),112.5/112.4(C-5),133.1/133.0(C-6),32.6/32.5(C-7),22.4(C-8),14.3(C-9),109.9/111.0(C-1’),156.6/156.7(C-2’),109.1/108.9(C-3’),152.1/152.0(C-4’),114.3/114.4(C-5’),147.3/147.4(C-6’),165.7(C-7’),80.0/80.1(C-8’),24.7(C-9’),8.2/8.6(C-10’),60.9(OMe-2).
化合物5，无色油状，溶于甲醇。[α]25 D+14.6(c 0.1,MeOH)；IR(KBr)νmax 3410,2967,2873,1743,1594,1454,1367,1209,1063cm-1；HRESIMS m/z 445.00193[M-H]-(calcd.445.00179)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 6.33/6.32(1H,s,H-3),2.71(2H,m,H-7),1.54(2H,m,H-8),0.91/0.89(3H,t,J＝7.6,H-9),5.55/5.58(1H,dd,J＝3.2,6.0,H-8’),1.87(1H,m,H-9’),2.21(1H,m,H-9’),0.72/0.79(3H,t,J＝7.3,H＝10’),9.37(1H,s,OH-2),9.62/9.65(1H,s,OH-4),11.49(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC 136.7/136.6(C-1),146.3/146.5(C-2),102.1(C-3),149.7/149.8(C-4),110.3(C-5),132.5/132.4(C-6),30.7/30.6(C-7),21.9(C-8),14.5(C-9),109.3/109.4(C-1’),155.8/156.0(C-2’),109.8/109.7(C-3’),152.6/152.7(C-4’),114.6/114.8(C-5’),146.9/147.0(C-6’),165.4(C-7’),79.6/79.8(C-8’),24.7/24.8(C-9’),8.0/8.6(C-10’).
化合物6，无色油状，溶于甲醇。[α]25 D+25.3(c 0.1,MeOH)；IR(KBr)νmax 3388,2964,2871,1714,1587,1460,1364,1173,1071cm-1；HRESIMS m/z 445.00080[M-H]-(calcd.445.00179)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 6.30/6.31(1H,s,H-5),2.39(2H,m,H-7),1.48(2H,m,H-8),0.82/0.83(3H,t,J＝7.3,H-9),5.58/5.54(1H,dd,J＝3.0,6.2,H-8’),1.86(1H,m,H-9’),2.22(1H,m,H-9’),0.77/0.79(3H,t,J＝7.3,H-10’),9.10/9.15(1H,s,OH-2),9.68(1H,s,OH-4),11.47(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC 137.5/137.6(C-1),145.3/145.0(C-2),106.8/106.9(C-3),150.2/150.1(C-4),107.2/107.3(C-5),131.6/131.9(C-6),32.3/32.5(C-7),22.6(C-8),14.3(C-9),109.4(C-1’),156.2/156.4(C-2’),109.5/109.4(C-3’),152.8/152.7(C-4’),114.7/114.6(C-5’),147.2/147.3(C-6’),165.4/165.5(C-7’),79.9(C-8’),24.8/24.9(C-9’),8.4(C-10’).
化合物7，无色油状，溶于甲醇。[α]25 D+24.5(c 0.1,MeOH)；IR(KBr)νmax 3293,2968,2872,1740,1596,1461,1366,1215,1060cm-1；HRESIMS m/z 411.04038[M-H]-(calcd.411.04077)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 6.06(1H,s,H-3),6.06(1H,s,H-5),2.47(2H,m,H-7),1.55(2H,m,H-8),0.88/0.87(3H,t,J＝7.3,H-9),5.54/5,57(1H,dd,J＝3.3,6.5,H-8’),1.88(1H,m,H-9’),2.21(1H,m,
H-9’),0.73/0.78(3H,t,J＝7.4,H-10’),9.07(1H,s,OH-2),8.92(1H,brs,OH-4),11.40(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC 136.4/136.2(C-1),147.8/148.1(C-2),101.6/101.7(C-3),153.7/153.8(C-4),107.0(C-5),134.3/134.2(C-6),32.9/32.8(C-7),22.7(C-8),14.5/14.4(C-9),110.0/109.9(C-1’),155.8/156.0(C-2’),109.0/109.1(C-3’),153.3(C-4’),114.7/114.6(C-5’),147.0/146.9(C-6’),165.5(C-7’),79.4/79.6(C-8’),24.8(C-9’),8.5/8.0(C-10’).
化合物8，无色油状，溶于甲醇。[α]25 D+22.5(c 0.1,MeOH)；IR(KBr)νmax 3432,2962,2872,1718,1588,1466,1339,1189,1064cm-1；HRESIMS m/z 425.05540[M-H]-(calcd.425.05642)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 6.22(1H,m,H-3),6.22(1H,m,H-5),2.51(2H,m,H-7),1.55(2H,m,H-8),0.89/0.89(3H,t,J＝7.3,H-9),5.57(1H,m,H-8’),1.91(1H,m,H-9’),2.19(1H,m,H-9’),0.71/0.78(3H,t,J＝7.4,H-10’),3.37/3.43(3H,s,OMe-2),9.18(1H,brs,OH-4),11.49(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC 137.1/137.0(C-1),150.2/150.8(C-2),98.8/99.0(C-3),154.1/154.2(C-4),108.2/108.1(C-5),134.3/134.1(C-6),32.8/32.6(C-7),22.6/22.7(C-8),14.4(C-9),109.1/109.2(C-1’),156.0/156.2(C-2’),109.4/109.3(C-3’),153.1/153.0(C-4’),114.4(C-5’),146.9/147.2(C-6’),165.4/165.5(C-7’),79.4/79.7(C-8’),24.5/24.8(C-9’),7.8/8.5(C-10’),56.1/56.4(OMe-2).
化合物9，浅黄色油状，溶于甲醇。[α]25 D+14.4(c 0.1,MeOH)；IR(KBr)νmax 3434,2967,2873,1747,1590,1448,1368,1207,1062cm-1；HRESIMS m/z 478.96342[M-H]-(calcd.478.96282).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 2.64(2H,m,H-7),1.47(2H,m,H-8),0.86/0.85(3H,t,J＝7.1,H-9),5.59/5.56(1H,dd,J＝3.1,6.5,H-8’),1.85(1H,m,H-9’),2.22(1H,m,H-9’),0.78(3H,t,J＝7.1,H-10’),9.46/9.50(1H,s,OH-2),9.58(1H,s,OH-4),11.65(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC 138.4(C-1),144.0/143.8(C-2),109.6(C-3),146.4/146.3(C-4),113.0(C-5),130.6/130.3(C-6),30.6(C-7),21.9(C-8),14.4(C-9),109.3(C-1’),156.3/156.1(C-2’),109.8/109.9(C-3’),152.2(C-4’),114.9/114.6(C-5’),147.2/147.3(C-6’),165.4(C-7’),80.0/79.9(C-8’),24.9/24.8(C-9’),8.4/8.5(C-10’).
化合物10，无色油状，溶于甲醇。[α]25 D+4.5(c 0.1,MeOH)；IR(KBr)νmax 3292,2967,2873,1746,1587,1440,1214,1062cm-1；HRESIMS m/z 492.97914[M-H]-(calcd.492.97847)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 2.69(2H,m,H-7),1.50(2H,m,H-8),0.89/0.87(3H,t,J＝7.2,H-9),5.59/5.56(1H,dd,J＝2.9,6.5,H-8’),1.85(1H,m,H-9’),2.23(1H,m,H-9’),0.79(3H,t,J＝7.2,H-10’),9.75/9.77(1H,s,OH-2),3.77(3H,s,OMe-4),11.81(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC 141.8(C-1),144.2/144.0(C-2),115.2/114.9(C-3),148.8/148.7(C-4),118.8(C-5),131.1/131.0(C-6),30.6/30.5(C-7),21.8(C-8),14.4(C-9),110.3/110.1(C-1’),156.4/156.6(C-2’),109.2/109.1(C-3’),151.8/151.7(C-4’),115.3(C-5’),147.1/147.2(C-6’),165.5(C-7’),80.1(C-8’),24.8/24.9(C-9’),8.6/8.5(C-10’),60.7(OMe-4).
化合物11，无色油状，溶于甲醇。[α]25 D+22.0(c 0.1,MeOH)；IR(KBr)νmax 3325,2969,2873,1745,1587,1437,1372,1206,1064cm-1；HRESIMS m/z 492.97866[M-H]-(calcd.492.97847).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 2.79(2H,m,H-7),1.59(2H,m,H-8),0.94/0.93(3H,t,J＝7.3,H-9),5.59/5.63(1H,dd,J＝3.2,6.4,H-8’),1.89(1H,m,H-9’),2.22(1H,m,H-9’),0.75/0.77(3H,t,J＝7.4,H-10’),3.38/3.41(3H,s,OMe-2),9.88(1H,brs,OH-4),11.77(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC 142.2(C-1),145.2/145.4(C-2),109.0/108.8(C-3),146.7(C-4),118.7/118.6(C-5),131.6/131.5(C-6),30.8/30.7(C-7),21.7(C-8),14.4/14.3(C-9),110.3/110.4(C-1’),156.5/156.6(C-2’),114.6/114.4(C-3’),151.4(C-4’),114.7(C-5’),147.4/147.5(C-6’),165.6(C-7’),80.1/80.3(C-8’),24.7(C-9’),8.1/8.6(C-10’),61.2/61.3(OMe-2).
化合物12，无色油状，溶于甲醇。[α]25 D+17.1(c 0.1,MeOH)；R(KBr)νmax3200,2967,2872,1744,1587,1451,1405,1370,1215,1058cm-1；HRESIMS m/z 506.99419[M-H]-(calcd.506.99412)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH 2.81(2H,m,H-7),1.60(2H,m,H-8),0.95/0.94(3H,t,J＝7.2,H-9),5.60/5.65(1H,dd,J＝3.1,6.5,H-8’),1.89(1H,m,H-9’),2.22(1H,m,H-9’),0.75/0.79(3H,t,J＝7.2,H-10’),3.39/3.41(3H,s,OMe-2),3.81(3H,s,OMe-4),11.73(1H,brs,OH-4’)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC 145.6/145.7(C-1),145.3/145.5(C-2),120.8/120.7(C-3),148.9/149.0(C-4),124.4/124.5(C-5),132.1(C-6),30.7/30.6(C-7),21.7(C-8),14.4(C-9),110.7(C-1’),156.7/156.8(C-2’),108.8/108.6(C-3’),150.8/150.9(C-4’),114.6/114.8(C-5’),147.3/147.4(C-6’),165.6(C-7’),80.2/80.4(C-8’),24.7(C-9’),8.2/8.6(C-10’),61.5(OMe-2),61.0(OMe-4).
实例3：化合物1(NSW-19)的抗流感病毒作用机制研究：
1.化合物1能够有效抑制流感病毒的复制
通过CPE抑制试验和噬斑抑制实验证明化合物对流感病毒有着明显的抑制作用，强于阳性药物达菲。CPE抑制试验表明化合物1对流感病毒的EC50为10.1μM，而阳性药物达菲(磷酸奥司他韦，OSV-P)的EC50为46.5μM，利巴韦林(RBV)的EC50为42.7μM(见表1)。噬斑抑制实验表明化合物1对流感病毒的IC50为6μM，而阳性药物达菲(磷酸奥司他韦，OSV-P)的IC50约为15μM(见图10、表2)。而化合物1在MDCK、HepG2以及Hela细胞中的CC50均大于100μM，说明化合物1的细胞毒性很小。
表1.化合物1抑制流感病毒(WSN)的活性及其细胞毒性分析。
化合物1 OSV-P RBV
EC50(μM) 10.1 46.5 42.7
MDCK HepG2 Hela
CC50(μM) >100 >100 >100
CC50：半数细胞毒性浓度；EC50：半数有效浓度，即抑制一半细胞病变的化合物浓度。
利用细胞病变(CPE)抑制实验计算化合物1的EC50比利巴韦林和磷酸奥司他韦抗病毒EC50小，说明该化合物抗流感病毒效果明显优于利巴韦林和磷酸奥司他韦。
表2.噬斑抑制实验证明化合物1对于流感病毒有明显的抑制作用
化合物1浓度 100μM 50μM 25μM 5μM 0μM
噬斑数量 2.0±1.2 3.0±2.3 6.0±2.1 60.0±7.0 100
OSV-P浓度 100μM 50μM 25μM 5μM 0μM
噬斑数量 19.0±5.0 42.2±4.9 46.0±2.1 55.9±4.9 100
结果显示：流感病毒在MDCK细胞上可形成病毒噬斑，化合物1在低于10μM浓度时即可抑制一半以上的噬斑数量，IC50约为6μM；而达菲(磷酸奥司他韦，OSV-P)的IC50约为15μM，说明化合物1的抗流感效果明显优于阳性药物达菲。
2.化合物1能够抑制流感病毒进入细胞和细胞内的复制
通过上述加药时间点实验可以初步断定，化合物1作用于病毒进入细胞过程。(见图11)
结果显示，在全程给药(0-10h)以及0-2、2-5、5-8h加药均能够有效地抑制流感病毒的复制。说明药物在病毒感染后0-8h内发挥抑制作用，而在感染8h之后加药则无明显抑制效果。实验表明化合物1作用于病毒与细胞结合及病毒在细胞内复制阶段。
3.化合物1可以抑制流感病毒与宿主细胞间的吸附
为了进一步揭示化合物1作用的详细机理，采用了血凝抑制试验来检测化合物是否抑制病毒与细胞的结合。实验结果如图12显示，化合物1能够有效地抑制流感病毒产生的红细胞凝聚现象，即说明化合物1抑制了病毒和细胞的吸附。
为了检验化合物1是否抑制病毒的融合作用，采用了病毒融合实验。实验结果如图13表明，100μM的化合物1对于流感病毒HA引起的融合无抑制作用。这说明该化合物对于病毒与细胞的吸附有抑制作用，而对病毒与细胞的融合无抑制效果。
4.化合物1可以与流感病毒的HA蛋白结合
利用SPR的方法检测了一下化合物是否能够直接与HA蛋白发生结合。首先，将重组HA蛋白偶联到CM5芯片上，然后让化合物作为分析物流过芯片。用Biacore T200检测结合信号。如图14所示，化合物1能很好的与HA蛋白结合，结合常数kD值大约在10μM左右。相反，利巴韦林(RBV)则不能结合到HA上(数据未展示)。这些数据说明，流感病毒的HA蛋白能够与待检化合物以特异性的方式结合。即HA为化合物1的靶分子，该化合物通过与HA结合抑制了HA介导的流感病毒粒子与宿主细胞的吸附，从而抑制了病毒进入宿主细胞。
5.化合物1可以抑制流感病毒RNP的活性
将可以表达流感病毒NP、PA、PB1、PB2蛋白的质粒以及pHH21-cNS-Luc)and pRL-TK质粒转染进入293T细胞。6小时后加入化合物，孵育48h，检测luciferase的表达。结果发现化合物可以抑制firefly的表达(图15)，而没有影响renilla luciferase的表达，说明化合物1可以抑制RNP的活性。
6.化合物1可以抑制流感病毒RNAs的水平
由于RNP在流感病毒的复制和转录过程中起重要作用。而图15说明RNP活性被化合物1抑制，因此，我们检测了流感病毒的vRNA，cRNA，mRNA的水平，发现该化合物确实抑制了流感病毒RNAs的产生(图16)，从而验证了化合物可以通过抑制RNP影响病毒复制。
7.化合物1可以抑制流感病毒NP蛋白和dsRNA的水平
由于NP的dsRNA的存在是流感病毒进行复制的标志。我们用间接免疫荧光的方法检测了化合物1是否可以抑制NP的dsRNA的水平，结果发现，该化合物确实抑制了NP蛋白的表达和dsRNA的水平(图17)。

Claims (3)

1.
一种式Ⅰ所示的聚酮化合物，其中：R1为Cl；R2选自羟基和甲氧基；R3为Cl；R4选自羟基和甲氧基。
2.权利要求1所述的聚酮化合物的制备方法，包括下述步骤：
1)以深海来源真菌Spiromastix sp.为菌种，利用液体或固体发酵培养，获得含所述聚酮化合物的发酵物；
2)将发酵物通过硅胶﹑凝胶﹑ODS色谱手段分离与纯化，在同一发酵物中制备所述式Ⅰ化合物。
3.权利要求1所述聚酮化合物、其药学上可接受的盐或它们的混合物的用途，用于制备药物，所述药物用于治疗流感。
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