WO2016032169A1 - 강화된 인터류킨-１ 수용체 길항제 생성능을 보유한 중간엽 줄기세포의 제조방법 - Google Patents

강화된 인터류킨-１ 수용체 길항제 생성능을 보유한 중간엽 줄기세포의 제조방법 Download PDF

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장재덕
서선희
김지현
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가톨릭대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing mesenchymal stem cells with enhanced ability to produce interleukin-1 receptor antagonists.
  • mesenchymal stem cells are highly proliferative adherent cells with multipotent ability to differentiate into bone, cartilage and fat and are known to be anti-inflammatory and immunomodulatory. Therefore, mesenchymal stem cells have recently been used to improve hematopoietic stem cell transplant engraftment rate or research and development as a treatment technology to lower inflammation in rheumatoid arthritis and to suppress autoimmune hyperresponsiveness.
  • mesenchymal stem cells can express indoleaminedeoxygenase (IDO), they convert tryptophan to kynurenine, which depletes tryptophan in the periphery of cells and inhibits proliferation of immune cells, thereby inhibiting inflammatory and immune responses. It is expected to do.
  • IDO indoleaminedeoxygenase
  • IL-1Ra interleukin-1 receptor antagonist
  • IL-1 interleukin-1 receptor antagonist
  • IL-1 interleukin-1 receptor antagonist
  • pretreatment of cells with TLR3 ligand increased IDO expression and IL1Ra production (Waterman, RS et al. (2010). PLoS One 5 (4): e10088; Betancourt, AM (2012) .Mesenchymal stem cells and related therapies The WPP Organization.The United States, The Administrators of The Tulane Educational Fund.), Along with cells, INF-gamma, and IL-1 or TNF alpha may be used for GvHD or autoimmune diseases (Shi, Y.). , L. Zhang, et al . (2014) .Kit containing stem cells and cytokines for use in attenuating immune responses.United States, Rutgers, The State University of New Jersey.
  • Yuan and Lu et al. (2013) developed a technique to forcibly increase the expression of IDO by inserting the IDO gene into mesenchymal stem cells, resulting in a large amount of kyneurenin, the result of IDO activity, up to 16 micromolar ( ⁇ M) in cell culture. Reported increase. It is known that high IDO activity in the inflammatory environment depletes tryptophan present in the environment, thereby blocking the proliferation of various immune cells and controlling the inflammatory response.
  • TGF-beta has both sides that can change into pro-inflammatory or anti-inflammatory depending on the surrounding cells and environment, it is necessary to control environmental factors other than TGF-beta (Sanjabi, S., LA). Zenewicz, et al. (2009) Curr Opin Pharmacol 9 (4): 447-53).
  • mouse MSC has the effect of inhibiting GvHD when used with MSC, INF gamma and IL-1 or TNF-alpha, but as part of the drug. Injecting IL-1 beta or TNF-alpha into humans is a technique of serious side effects, and even before immunosuppression, mouse MSC mainly uses iNOS and human MSC mainly uses IDO.
  • the present invention provides a basis for an embodiment in which it is difficult to apply a technology operating in the immune system of a mouse to a human, and does not set a specific cell pretreatment technology, and thus, it may be considered that the practical industrial applicability is reduced.
  • the conventional techniques appear to use a technique that is unlikely to be a successful cell therapy in the manufacturing process to improve the anti-inflammatory and immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells, and in addition to licensing as well as gene therapy in the case of genetic manipulation Since the licensing requirements including the efficacy, stability, and safety data must be satisfied, it is much more difficult than the case of using only simple cells until the actual development is successful and the product permission is obtained from the relevant authorities. In addition, there is always a concern about side effects when genetic manipulation is involved or when inflammatory factors or endotoxins are introduced into the final product above the standard value.
  • TNF Tumor Necrosis Factor
  • IL-1 Interleukin-1
  • IL-1Ra receptor antagonists
  • mesenchymal stem cells need to increase the expression level of IL-1Ra because the expression level of interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is minimal in normal condition and does not affect the inflammatory response.
  • An object of the present invention is to increase the production capacity of IL-1Ra from mesenchymal stem cells without using genetic engineering, LPS, poly (I: C), etc., and fully maximize the IDO activity to improve the immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells.
  • By providing an enhanced method it is possible to provide a method capable of producing mesenchymal stem cells for inflammation or immunosuppression, in which not only IDO but also IL-1Ra activity is enhanced.
  • Another object of the present invention is to provide a stem cell culture medium composition for producing stem cells having enhanced production of the interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra).
  • IL-1Ra interleukin-1 receptor antagonist
  • the present invention is an interleukin-1 receptor antagonist comprising the step of culturing stem cells in a basic medium to which the cytokine cocktail is mixed with IFN-gamma, IL-1 beta and TNF-alpha
  • a method for producing stem cells having enhanced ability to produce (IL-1Ra) is provided.
  • the present invention also provides a medium composition for producing stem cells with enhanced ability to produce an interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) to which a cytokine cocktail is mixed with IFN-gamma, IL-1 beta, and TNF-alpha.
  • IL-1Ra interleukin-1 receptor antagonist
  • the present invention has a high IL-1Ra production capacity by pretreatment of mesenchymal stem cells using a cell stimulation medium composition comprising an additive consisting of a combination of all three factors, IFN-gamma, IL-1 beta and TNF-alpha.
  • a cell stimulation medium composition comprising an additive consisting of a combination of all three factors, IFN-gamma, IL-1 beta and TNF-alpha.
  • Mesenchymal stem cells showing IDO activity can be prepared.
  • the mesenchymal stem cells prepared by the present invention in particular human mesenchymal stem cells, can be expected to enhance IL-1Ra production capacity and IDO activity, thus preventing diseases related to hyperimmune reactions such as rheumatoid arthritis and graft-versus-host disease. It can be used as a therapeutic mesenchymal stem cell therapy, and it is expected to enhance the possibility of treatment for many patients suffering from related diseases.
  • Figure 1 shows the results of comparing the IDO activity of mesenchymal stem cells by the control conditions and various types of stimulation in a small culture, the control (Control) DMEM-LG medium containing 10% bovine serum
  • the BA1 experimental group was stimulated with 1 ng / mL of IL-1 beta and 1 ng / mL of TNF-alpha in control medium, and the G2BA1 experimental group had 20 ng / mL INF in control medium.
  • Figure 2 shows the results of comparing the IDO activity of mesenchymal stem cells by the normal culture (Control) and two-stage stimulation culture (G2BA1) in the mass culture, the control (Control) DMEM containing 10% bovine serum -G2BA1 group incubated in -LG medium, BA1 medium (1 ng / mL IL-1 beta and 1 ng / mL in control medium after primary stimulation with 20 ng / mL INF-gamma added to the control medium) Medium added with TNF-alpha).
  • FIG. 3 is a comparison of IL-1Ra production capacity of mesenchymal stem cells pretreated by control and cytokine alone or mixed composition for 3 days, the control (Control) DMEM- containing 10% bovine serum
  • the group cultured in the LG medium and the experimental group were groups stimulated with a medium in which INF-gamma, IL-1 beta, TNF-alpha, or poly (I: C) was added alone or in combination as shown in Table 1 in the control medium. .
  • Figure 4 is a result of comparing the kineurenin production in mesenchymal stem cells pre-treated by the control and cytokine alone or mixed composition, the control (Control) in DMEM-LG medium containing 10% bovine serum
  • the cultured group and the experimental group were groups that were first stimulated with a medium in which INF-gamma, IL-1 beta, TNF-alpha, or poly (I: C) was added alone or in combination as shown in Table 1 in the control medium.
  • FIG. 5 shows a culture medium (CM1) and a general growth medium (DMEM-LG10) after 24 hours pretreatment by a composition using INF-gamma and IL-1 beta or TNF-alpha alone or in a mixture of two and three kinds of cytokines. ) Is a result of comparing the IL-1Ra concentration produced in mesenchymal stem cell culture (CM2) cultured for 48 hours after medium exchange.
  • CM1 mesenchymal stem cell culture
  • FIG. 6 shows that INF-gamma and IL-1 beta or TNF-alpha are used alone or in combination of two and 48 hours in general growth medium (DMEM-LG10) after 24 hours pretreatment by three different cytokine compositions. This is a result of comparing the concentration of kynurenine produced in the culture of mesenchymal stem cell culture.
  • DMEM-LG10 general growth medium
  • GBA1X is a mix of 20 ng / mL INF-gamma + 1 ng / mL IL-1 beta + 1 ng / mL TNF-alpha, with 1.5 ⁇ , 2 ⁇ , 5 ⁇ , 10 ⁇ being 1 X is a multiple of concentration.
  • FIG. 8 is a one-day culture with stimulation medium with increased concentrations of one or two cytokines in GBA stimulation medium containing INF-gamma, IL-1 beta, and TNF-alpha. It is the result of IL-1Ra production compared to 2 days after further culture.
  • the present invention enhances the ability to produce interleukin-1 receptor antagonists (IL-1Ra) comprising culturing stem cells in a basal medium containing a cytokine cocktail mixed with IFN-gamma, IL-1 beta and TNF-alpha. It relates to a method for producing stem cells.
  • IL-1Ra interleukin-1 receptor antagonists
  • the present invention is a medium for the production of stem cells with enhanced ability to produce an interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) to which a cytokine cocktail is mixed with IFN-gamma, IL-1 beta, and TNF-alpha.
  • IL-1Ra interleukin-1 receptor antagonist
  • the present invention can produce mesenchymal stem cells maximized the ability to produce such as interleukin 1 receptor antagonist (IL-1Ra), which is very weakly expressed by conventional culture methods, through stimulation culture using a cytokine mixture composition.
  • IL-1Ra interleukin 1 receptor antagonist
  • a control group cultured only in general growth medium a group using only IFN-gamma, a group using poly (I: C), IL- in a group using IFN-gamma and poly (I: C) Almost no Ra content was detected, and mesenchymal stem cells stimulated with cytokine cocktails mixed with IFN-gamma, IL-1 beta, and TNF-alpha were compared to the group with or without IL-1 beta and TNF-alpha. Significantly high amounts of IL-1Ra were identified.
  • IL-1Ra in mesenchymal stem cells further cultured in general growth medium for 48 hours, IFN-gamma, IL- It was confirmed that high content of IL-1Ra was maintained only when stimulated with a cytokine cocktail mixed with 1 beta and TNF-alpha.
  • Mesenchymal stem cells with improved IL-1Ra content are expected to be able to control the inflammatory response by blocking the mechanism of exacerbation of inflammatory symptoms caused by interleukin-1 in an inflammatory environment.
  • the present invention allows the pre-treated mesenchymal stem cells to have a high kynurenine production ability due to indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) activity in addition to high IL-1Ra production capacity. Therefore, when the mesenchymal stem cells prepared in the present invention, when applied in vivo, IL-1Ra interferes with the inflammatory signaling pathway triggered by IL-1 beta and also removes tryptophan from the environment where the cells are located. As a result, it is expected to prevent the proliferation of the disease and to prevent the exacerbation of inflammatory symptoms and to control the excessive immune response triggered by autoimmunity.
  • IDO indoleamine-2,3-dioxygenase
  • the method for producing stem cells with enhanced production of interleukin-1 receptor antagonists (IL-1Ra) of the present invention improves the production of IL-1Ra and IDO through appropriate stimulation of mesenchymal stem cells grown and cultured in vitro.
  • IL-1Ra interleukin-1 receptor antagonists
  • the cytokine cocktail may be a mixture of IFN-gamma, IL-1 beta and TNF-alpha in a mixing ratio of 20 to 200: 1 to 10: 1 to 10.
  • the cytokine cocktail comprises IFN-gamma at a concentration of 20 to 200 ng / mL, IL-1 beta at a concentration of 1 to 10 ng / mL, and TNF-alpha at a concentration of 1 to 10 ng / mL.
  • IFN-gamma at a concentration of 20 to 200 ng / mL
  • IL-1 beta at a concentration of 1 to 10 ng / mL
  • TNF-alpha at a concentration of 1 to 10 ng / mL.
  • the stem cells may be isolated from humans, mice, rats, guinea pigs, rabbits, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, antelope, dogs, and cats, but are not limited thereto.
  • Preferably human More specifically, it may be human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, umbilical cord, umbilical cord blood or adipose tissue. Such a method for obtaining mesenchymal stem cells is well known in the art.
  • the basic medium for in vitro proliferation and cell stimulation of mesenchymal stem cells is a known basic medium commonly used for cell culture, for example, M199 / F12 mixture, MEM-alpha (alpha Minimal essential Medium) medium, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) medium, MCDB 131 medium, IMEM medium, DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Ham? S F-12) medium, PCM medium or MSC expansion medium and the like, but are not particularly limited thereto.
  • These basic mediums include salts, vitamins, buffers, energy sources, amino acids and other substances, and include about 10% to 30% of animal-derived serum in the culture of stem cells. Will be provided.
  • the serum used for stem cell culture may be fetal, calf, horse or human serum, preferably fetal calf serum (FBS).
  • FBS fetal calf serum
  • compounds having components similar to those of animal-derived serum, such as bovine pituitary extract (BPE), may also be used.
  • antibiotics In addition, during stem cell culture, antibiotics, antifungal agents and reagents that prevent the growth of mycoplasma causing contamination may be added.
  • antibiotics commonly used in cell culture such as penicillin, streptomycin, or fungizone can be used. It is preferable to use amphotericin B as an antifungal agent and tyrosine as a mycoplasma inhibitor, and may prevent mycoplasma contamination with gentamicin, ciprofloxacin, azithromycin, and the like.
  • oxidants such as L-glutamine and energy metabolites such as sodium pyruvate may be further added.
  • General culture conditions of the initial culture is applied in the conditions of 90 to 95% humidity, 25 to 40 °C, 5 to 10% CO 2 incubator by applying the conditions most suitable for cell culture, the final concentration when 5 to 10% CO 2 incubation
  • Carbon modifiers such as sodium bicarbonate can be added so that is 0.17 to 0.22% by weight.
  • the cumulative population doubling time is maintained until 70-90% confluence of the cells in culture in the flask is preferably subcultured by collecting the cells at 80% confluence.
  • the mesenchymal stem cells grown and isolated from human bone marrow were cultured in general growth medium and stimulation medium.
  • Dulbecco's Modified Eagle Medium with low Glucose (LG10) medium containing 10% bovine serum was used as a general growth medium and 20 ng / mL INF-gamma was added to the general growth medium as the first stimulation medium.
  • ng / mL polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly (I: C) was added and used.
  • As a second stimulation medium 1 ng / mL of IL-1 beta and 1 ng / mL of TNF-alpha were added to the general growth medium.
  • Mesenchymal stem cells were suspended in normal growth medium and seeded in 6-well cell culture plates to 15,000 cells per cm 2 of the culture vessel surface. It was placed in an incubator (CO 2 incubator) to maintain 5% carbon dioxide and allowed to stand for 3 to 5 hours to remove the cells and then used the medium.
  • CO 2 incubator CO 2 incubator
  • the first stimulation medium was placed in a CO 2 incubator and cultured for 1 day.
  • mesenchymal stem cells were cultured in normal growth medium without primary stimulation. Thereafter, the used medium was removed, exchanged with a second stimulus medium, and placed in a CO 2 incubator, followed by secondary stimulation culture for 3 days. For comparison, cells stimulated in normal growth medium without primary stimulation were subjected to secondary stimulation.
  • the used medium was collected and centrifuged to remove particles or cell debris, and the supernatant was used as an analytical sample. At this time, the supernatant recovered from the culture solution of cells cultured only in the normal growth medium without stimulation was used as a control.
  • the degree of expression of IDO was indirectly confirmed by measuring the concentration of kynurenine contained in the culture medium recovered after stimulation.
  • concentration of kyneurenin 200 ⁇ l of sample or sequentially diluted kyneurenin solution was mixed with 80 ⁇ l of 30% trichloroacetic acid (TCA). After standing at 60 ° C. for 15 minutes, the mixture was centrifuged at 13,400 ⁇ g for 15 minutes. 70 ⁇ l of the supernatant and 70 ⁇ l of the Erlich reagent were mixed and allowed to stand for 12 minutes, and then the absorbance was measured at 480 nm. The standard curve was calculated using the absorbance of the sequentially diluted kynurenine solution, and the concentration of the kynurenine of the sample was calculated.
  • the culture was carried out sequentially in the medium.
  • Dulbecco's Modified Eagle Medium with low Glucose (LG10) medium containing 10% bovine serum was used as a general growth medium and 20 ng / mL INF-gamma was added to the general growth medium as a primary stimulation medium.
  • As a secondary stimulation medium 1 ng / mL of IL-1 beta and 1 ng / mL of TNF-alpha were added to the general growth medium.
  • Mesenchymal stem cells were suspended in normal growth medium and inoculated in T-175 cell culture vessels to be 8,600 cells per cm 2 of the culture vessel surface. The cells were attached to 5% CO 2 incubator and allowed to stand for 3 to 5 hours to remove the used medium.
  • the primary stimulation medium was placed in a CO 2 incubator, cultured for 1 day, and the cells were recovered and cryopreserved. Frozen primary stimulation cells were thawed and suspended in general growth medium and inoculated in T-175 cell culture vessels to be 8,600 cells per cm 2 of the culture vessel surface. Cells were allowed to attach to a 5% CO 2 incubator and allowed to stand for 3 to 5 hours.
  • the medium was replaced with a secondary stimulation medium and placed in a CO 2 incubator for 2 days. After incubation, the used medium was collected and centrifuged to use the supernatant as an analytical sample. At this time, the supernatant recovered from the culture solution of cells cultured only in the normal growth medium without stimulation was used as a control.
  • the mesenchymal stem cell supernatant (Control) cultured in the normal growth medium without any stimulation was hardly detected, the second stimulation culture after one day of primary stimulation culture containing INF-gamma When performed for one day (G2BA1), about 17 micromolar concentrations ( ⁇ M) of kyneurenin were detected, confirming the high IDO activity.
  • Example 1 and Example 2 after the stimulation culture using IFN-gamma it was confirmed that the high kineurenin production is possible when further stimulation culture in the culture conditions including IL-1 beta and TNF-alpha. On the basis of this, the simultaneous treatment of these two stimuli was confirmed to maintain the high production of kynurenine and to investigate whether the IL-1Ra content is improved. In addition, the IL-1Ra content was improved by using poly (I: C), IFN-gamma alone or in combination. To this end, mesenchymal stem cells isolated and cultured from human bone marrow were selectively cultured in general growth medium and mixed stimulation medium.
  • Dulbecco's Modified Eagle Medium with low Glucose medium containing 10% bovine serum was used as a control medium, and 20 ng / mL INF-gamma, 1 was used as a mixed stimulation medium (GBA1 experimental group).
  • GBA1 experimental group 20 ng / mL INF-gamma, 1 was used as a mixed stimulation medium
  • ng / mL IL-1 beta and 1 ng / mL TNF-alpha were added and used.
  • the control group including the GBA1 experimental group and the additional experimental group for stimulation medium were prepared and used in the experiment.
  • Stimulation medium composition Control G10 G20 P1 GP BA1 GBA1 PBA1 BA2 GBA2 PBA2 GPBA2 badge LG10 * LG10 INF-gamma (ng / mL) 10 20 20 20 20 20 20 IL-1 beta (ng / mL) One One One 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 TNF-alpha (ng / mL) One One One 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 poly (I: C) ( ⁇ g / mL) One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One
  • Mesenchymal stem cells were suspended in normal growth medium (LG10) and inoculated on a 12-well cell culture plate to be 58,000 cells per culture well. The cells were attached to a 5% CO 2 incubator and allowed to stand for 6 hours to remove the used medium. 1mL each of the stimulation medium prepared for the stimulation culture, put the plate in the CO 2 incubator and incubated for 3 days. As a control, mesenchymal stem cells were cultured in normal growth medium without stimulation. After incubation, the used medium was collected and centrifuged to use the supernatant as an analytical sample. At this time, the supernatant recovered from the culture solution of the cells cultured only in the normal growth medium without stimulation as a control.
  • LG10 normal growth medium
  • An enzyme immunoassay kit (Quantikine ELISA, R & D Systems) was used to measure the concentration of IL-1Ra in the culture medium produced by mesenchymal stem cells. The measurement method followed the protocol of the kit manufacturer. 100 ⁇ l of analytical dilutions were added to wells coated with mouse monoclonal antibody to human IL-1Ra, and then 100 ⁇ l of each sample, IL-1Ra standard solution, or control solution was added and allowed to stand for 2 hours. The contents of each well were removed and washed four times with wash buffer. After adding 200 ⁇ l of a conjugate solution containing a polyclonal antibody to IL-1Ra, to which peroxidase was bound, the mixture was allowed to stand for another 2 hours.
  • mesenchymal stem cell supernatant Control group or IFN-gamma only group (G10, G20), poly (I: C) group (P1), cultured in normal growth medium without any stimulation
  • poly (I: C) group P1
  • IFN-gamma and poly (I: C) at the same time, almost no IL-1Ra content was detected and the group using low concentrations of IL-1 beta and TNF-alpha alone or in combination with other factors (BA2, GBA2, PBA2, GPBA2) and low concentrations of IL-1Ra were detected in high concentrations of IL-1 beta and TNF-alpha alone or in poly (1: C) groups (BA1, PBA1).
  • IFN-gamma, IL-1 beta, and TNF-alpha are used to determine whether three cytokines are essential for high IL-1Ra production, or if each cytokine is used alone or based on IFN-gamma
  • the stimulation medium composition as shown in the table below was prepared and used in the experiment. After 24 hours of pretreatment stimulation, the culture medium was further cultured for 48 hours with a general growth medium (LG10), and the final culture medium was used as a sample. The difference in IL-1Ra production capacity was compared. In addition, at this time, to determine whether there is a change in IDO activity, the concentration of kynurenine in the culture solution for the last 48 hours was measured.
  • Stimulation medium composition LG10 G20 B1 A1 GB1 GA1 BA1 GBA1 badge LG10 * LG10 INF-gamma (ng / mL) - 20 20 20 20 IL-1 beta (ng / mL) - One One One One One TNF-alpha (ng / mL) - One One One One One One
  • the mesenchymal stem cells were suspended in a general growth medium and inoculated on a 24-well cell culture plate to be 50,000 cells per well of the culture vessel.
  • Cells were attached to a 5% CO 2 incubator and cultured for 1 day to remove cells and then used.
  • 0.5 mL of stimulation medium prepared for stimulation culture was put in each, and the plates were placed in a CO 2 incubator and incubated for 24 hours. After stimulation culture, the used medium was completely removed and cultured again for 48 hours after adding general growth medium.
  • mesenchymal stem cells were cultured in normal growth medium without stimulation. After incubation, the used medium was collected and centrifuged to use the supernatant as an analytical sample.
  • IL-1Ra concentration was measured in the same manner as in Example 3, kynurenine concentration was measured in the same manner as in Example 1.
  • pretreatment of 24 hours mesenchymal stem cells with various cytokine combinations followed by removal of the used stimulation medium and exchange with general growth medium for additional 48 hours incubation produced IL-1Ra and kinase.
  • the renin concentration was measured to determine whether IL-1Ra and kyneurenin production were present even after the pretreatment stimulus was lost.
  • Example 3 when pre-treatment of mesenchymal stem cells with stimulation medium (GBA1 stimulation medium) using 1 ng / mL of high IL-1 beta and TNF-alpha together with INF-gamma, It was confirmed to be generated.
  • the stimulation medium composition as shown in the table below was prepared and used in the experiment to confirm whether such a trend ensures high IL-1Ra production even when the concentration of cytokines included in the GBA1 stimulation medium is increased.
  • Stimulation medium composition GBA1X GBA1.5X GBA2X GBA5X GBA10X badge LG10 * INF-gamma (ng / mL) 20 30 40 100 200 IL-1 beta (ng / mL) One 1.5 2 5 10 TNF-alpha (ng / mL) One 1.5 2 5 10
  • Mesenchymal stem cells were suspended in normal growth medium and seeded in 24-well cell culture plates to be 23,000 cells per well of the culture vessel. The cells were placed in a 5% CO 2 incubator and incubated for 4 days to remove and propagate the cells. After each of the stimulation medium prepared for stimulation culture, the plate was placed in a CO 2 incubator and stimulated for 3 days. As a control, mesenchymal stem cells were cultured in normal growth medium without stimulation. After incubation, the used medium was collected and centrifuged to remove particles or cell debris, and the supernatant was used as an analytical sample. At this time, the supernatant recovered from the culture solution of cells cultured only in the normal growth medium without stimulation was used as a control.
  • IL-1Ra concentration was measured in the same manner as in Example 3.
  • mesenchymal stem cells were confirmed to produce a greater amount of IL-1Ra as the concentration of cytokines contained in the GBA stimulation medium.
  • mesenchymal stem cells were suspended in normal growth medium and seeded in 24-well cell culture plates to attach 25,000 cells per well of the culture vessel. The cells were placed in a 5% CO 2 incubator and incubated for 4 days to remove and propagate the cells. After each of the stimulation medium prepared for stimulation culture, the plate was placed in a CO 2 incubator and stimulated for 1 day. As a control, mesenchymal stem cells were cultured in normal growth medium without stimulation. After completion of the stimulation culture, the used medium was removed, and the culture medium was added and cultured for 2 days. After incubation, the medium was collected and centrifuged to use the supernatant as an analytical sample. At this time, the supernatant recovered from the culture solution of the cells cultured only in the normal growth medium without stimulation as a control.
  • IL-1Ra concentration was measured in the same manner as in Example 3.
  • mesenchymal stem cells were confirmed to produce high IL-1Ra even after stimulation was removed by GBA stimulation medium.
  • GBA composition with 10-fold increase in IL-1 beta or INF-gamma component showed no difference in IL-1Ra concentration from GBA1, but GBA-A10 and GBA-BA10, which were 10-fold increased TNF-alpha component
  • the experimental group showed about 300% improved IL-1Ra concentration compared to GBA1. Therefore, it was confirmed that the effect of TNF-alpha was the highest when increasing the content of individual cytokines included in GBA1 to increase IL-1Ra production.
  • the present invention can be used in the field of producing a culture medium for stem cell culture.

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Abstract

본 발명은 강화된 인터류킨-1 수용체 길항제 생성능을 보유한 중간엽 줄기세포의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 유전자 조작 없이, IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파가 혼합된 사이토카인 칵테일을 줄기세포 배양용 배지에 첨가하여 인터류킨-1 수용체 길항제 생성능이 강화된 줄기세포를 제조할 수 있다.

Description

강화된 인터류킨-１ 수용체 길항제 생성능을 보유한 중간엽 줄기세포의 제조방법
본 발명은 강화된 인터류킨-1 수용체 길항제 생성능을 보유한 중간엽 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포는 뼈, 연골 그리고 지방 등으로 분화할 수 있는 다분화능을 가지는 높은 증식성의 부착성 세포로서 항염증 및 면역조절능력이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 중간엽 줄기세포는 최근 들어서 조혈모세포이식 생착률 향상을 위해 사용되거나 류마티스 관절염 등에서의 염증을 낮추고 자가면역성 과다반응을 억제하는 치료기술로 연구 개발되고 있다.
중간엽 줄기세포는 인돌아민디옥시제나아제(IDO)를 발현할 수 있기 때문에 트립토판을 키뉴레닌으로 전환시킴으로써 세포주변에 있는 트립토판을 고갈시키게 되고 면역세포의 증식을 방해함으로써 염증반응 및 면역반응을 억제할 것으로 기대되고 있다. 또한 염증반응의 주요인자인 인터류킨-1(IL-1)이 세포와 반응하는 것을 차단할 수 있는 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)도 발현하는 것으로 알려져 있다. 그러나 체외에서 증식배양된 중간엽 줄기세포의 면역억제 관련 인자의 발현수준이 낮기 때문에 생체내로 도입되었을 경우 생체내에서의 환경에 따라 만족스러운 효과를 보이지 못하는 경우들이 보고되어 중간엽 줄기세포의 항염증능 및 면역조절능을 강화하기 위한 방법들이 연구되어 왔다.
중간엽 줄기세포의 면역조절능을 향상시키기 위한 종래의 기술에는 IDO 유전자를 세포에 삽입하여 과발현시키거나(Yuan, Lu et al. In Vitro Cell Dev Biol Anim., vol. 49(10), pp. 752-758, 2013.12), TGF-베타 유전자를 세포에 삽입하여 과발현시키는 기술(대한민국 특허 제10-1301262호) 등이 알려져 있으며 사람 중간엽 줄기세포의 약 5% 정도가 IL-1Ra를 발현하는 세포임을 확인한 보고(P Ortiz, L. A. et al. Proc Natl Acad Sci USA, vol. 104(26): 11002-11007, 2007)도 있다. 또한 TLR3 리간드로 세포를 전처리하면 IDO 발현 및 IL1Ra 생성이 증가된다는 보고(Waterman, R. S. et al. (2010). PLoS One 5(4): e10088; Betancourt, A. M. (2012). Mesenchymal stem cells and related therapies. W. P. P. Organization. United States, The Administrators of The Tulane Educational Fund.)도 있고, 세포와 INF-감마 그리고 IL-1 혹은 TNF 알파와 함께 GvHD 혹은 자가면역성 질환에 사용할 수 있다는 보고도 있다(Shi, Y., L. Zhang, et al. (2014). Kit containing stem cells and cytokines for use in attenuating immune responses. United States, Rutgers, The State University of New Jersey).
Yuan과 Lu 등 (2013)은 중간엽 줄기세포에 IDO 유전자를 삽입하여 강제로 IDO의 발현을 증가시키는 기술을 개발하여 IDO 활성의 결과인 키뉴레닌이 세포배양액에서 최대 16 마이크로몰(μM)로 많이 증가하였다고 보고하였다. 염증환경에서 높은 IDO 활성은 환경내에 존재하는 트립토판을 고갈시키게 되므로 각종 면역세포의 증식이 차단되어 염증반응이 조절된다고 알려져 있다. 또한 대한민국 특허 제10-1301262호에서는 TGF-베타 유전자를 중간엽 줄기세포에 삽입하여 TGF-베타가 과발현되도록 함으로써 관절염질환동물모델에 주입하였을 때 미처리 MSC보다 질환증상억제 효과가 훨씬 뛰어남을 증명하였다. 그러나 TGF-베타는 주변 세포와 환경에 따라 친염증 혹은 항염증으로 변할 수 있는 양면성을 다 보유하고 있으므로 TGF-베타 외의 환경적 요소를 잘 조절하는 것이 필요하다고 볼 수 있다(Sanjabi, S., L. A. Zenewicz, et al. (2009) Curr Opin Pharmacol 9(4): 447-53).
Shi 및 Zhang 등(2014)의 기술은 마우스 MSC를 사용하여 MSC, INF 감마와 함께 IL-1 또는 TNF-알파와 함께 사용하는 경우 GvHD를 억제하는 등의 효능을 가진다고 주장하고 있으나 약제의 일부로써 염증인자인 IL-1 베타나 TNF-알파를 사람에게 주사하는 것은 심한 부작용이 우려되는 기술이고 또한 면역억제기전에 있어서도 마우스 MSC는 iNOS를 주로 사용하고 사람 MSC는 IDO를 주로 사용하는 등의 차이가 있어 쥐의 면역체계에서 작동되는 기술을 사람에게 그대로 적용하기 곤란한 실시 예를 근거를 제시하고 있으며 구체적인 세포의 전처리 기술을 설정하지 않고 있어 실제 산업적 이용 가능성이 떨어진다고 볼 수 있다.
Waterman 및 Tomchuck 등(2010)의 기술은 TLR 리간드인 LPS 혹은 poly(I:C) 등이 포함된 DMEM alpha medium(16.7% FCS 첨가)배지로 MSC를 전처리함으로써 IL-1Ra와 IDO를 포함한 주요 인자들을 높게 생성하게 하는 기술을 개발하였다고 주장하고 있으나 DMEM 알파라는 배지종류가 존재하지 않고 16.7%의 높은 우혈청 함유량은 우혈청내에 높은 농도로 존재하는 TGF-b의 영향을 배제하기 어려워 서로 다른 제조 로트 혹은 다른 제조사의 우혈청을 사용할 경우 재현되지 않을 가능성이 있다. 실제로 poly(I:C)처리에 의해 중간엽 줄기세포의 면역억제능이 증가되는지는 논란이 있다는 것이 최근의 학술논문에서도 지적되고 있다 (van den Akker, F., S. C. de Jager, et al. (2013). Mediators Inflamm 2013: 181020.). 또한 본 발명자가 비교연구의 일환으로 진행한 DMEM low glucose(10% FBS 첨가) 배지에 1㎍/mL poly(I:C)를 처리한 경우에서 IDO의 의미 있는 증가가 관찰되지 않아서 상기 기술의 재현성에 의문이 제기되는 바이다. 그리고 LPS는 생체내 발열원 혹은 내독소로 작용하며 용해성 단백질의 정제공정에서조차도 제거가 까다로운 성분일 뿐 아니라 세포와 결합되어 있는 경우 더욱더 제거가 어려워지므로 세포의 LPS 처리는 바람직하지 않은 것으로 판단된다.
상기 종래의 기술들은 중간엽 줄기세포의 항염증 및 면역조절능력을 향상시키기 위하여 제조공정에서 세포치료제로서의 개발성공 가능성이 어려운 기술을 사용하는 것으로 보이고 또한 유전자 조작을 포함하는 경우 인허가뿐 아니라 유전자 치료제로서의 유효성, 안정성 및 안전성 자료를 포함하는 인허가 사항을 다 만족시켜야 하므로 실제 개발에 성공하여 관계 당국으로부터 품목허가를 받기까지는 단순 세포만 사용하는 경우 비해 훨씬 어렵다는 단점이 있다. 또한 유전자 조작이 포함되는 경우나 혹은 염증성 인자나 내독소가 최종제품에 기준치 이상이 유입되는 경우 그로 인한 부작용의 우려가 항상 존재한다고 할 수 있다.
염증이 수반되는 질환에서 염증반응의 억제는 질환치료에 있어서 주요한 목표기능 중의 하나로 여겨지고 있으며 염증반응의 진행에 있어서 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor, TNF)와 인터류킨-1(Interleukin-1, IL-1)이 중요한 역할을 하고 있다고 알려져 있다. 인터류킨-1은 마크로파지의 인터류킨-1 수용체에 결합하여 종양괴사인자의 증가를 유도하기 때문에 인터류킨-1과 그 수용체간의 결합을 수용체 길항제(IL-1Ra)를 사용하여 방해하면 염증조절이 가능할 것으로 이해되어 왔다. 그러나 중간엽 줄기세포는 정상조건에서 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 발현량이 극히 미미하여 염증반응에 영향을 미치지 못하기 때문에 IL-1Ra의 발현량을 증가시킬 필요가 있다. Waterman 및 Tomchuck (2010)이 TLR3 리간드 poly(I:C) 등이 포함된 DMEM alpha medium(16.7% FCS 첨가) 배지로 MSC를 전처리함으로써 IL1Ra와 IDO를 포함한 주요 인자들을 높게 생성하게 하는 기술을 개발하였다고 주장하고 있으나 poly(I:C)처리에 의한 IDO 증가는 일부 논란이 있다는 것이 최근의 학술논문에서도 지적되고 있다(van den Akker, de Jager et al. 2013).
따라서 체외배양된 중간엽 줄기세포를 손쉽게 자극하여 IL-1Ra의 발현량을 높이는 동시에 높은 IDO 활성을 보유한 세포로 만들기 위한 재현성 있으면서 안전하고 효율적인 기술의 개발이 매우 중요하다고 할 수 있다.
본 발명의 목적은 유전자조작이나 LPS, poly(I:C) 등을 사용하지 않으면서도 중간엽 줄기세포로부터 IL-1Ra의 생성능을 높이고, IDO 활성을 충분히 극대화시켜 중간엽 줄기세포의 면역조절능력을 강화할 수 있게 함으로써 IDO뿐만 아니라 IL-1Ra 활성이 강화된 염증억제용 혹은 면역억제용 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 생성능이 강화된 줄기세포 제조를 위한 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파를 혼합한 사이토카인 칵테일이 첨가된 기본배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 생성능이 강화된 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 기본배지에 대하여, IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파를 혼합한 사이토카인 칵테일이 첨가된 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 생성능이 강화된 줄기세포 제조용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명은 IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파의 세가지 인자 모두의 조합으로 이루어진 첨가물을 포함하는 세포 자극 배지 조성을 이용하여 중간엽 줄기세포를 전처리함으로써 높은 IL-1Ra 생성능을 가지게 되고 동시에 높은 IDO 활성을 보이는 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있다.
본 발명에 의하여 제조되는 중간엽 줄기세포, 특히 사람 중간엽 줄기세포를 이용하면 강화된 IL-1Ra 생성능 및 IDO 활성을 기대할 수 있게 되므로 류마티스 관절염이나 이식편대숙주질환 등의 과다 면역반응과 관련된 질환을 치료할 수 있는 중간엽 줄기세포 치료제로 사용될 수 있어 관련 질환을 앓고 있는 많은 환자에게 치료의 가능성을 제고할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 소규모배양에서 일반배양(Control)조건과 여러 종류의 자극에 의한 중간엽 줄기세포의 IDO 활성을 비교한 결과를 나타낸 것으로, 대조구(Control)는 10% 우혈청을 포함하는 DMEM-LG 배지에서 배양한 그룹, BA1 실험군은 대조구 배지에 1 ng/mL의 IL-1 베타와 1 ng/mL의 TNF-알파가 추가된 배지로 자극한 그룹, G2BA1 실험군은 대조구 배지에 20 ng/mL의 INF-감마가 추가된 배지로 일차자극 후 BA1배지로 추가자극한 그룹, P2BA1 실험군은 대조구 배지에 1 ㎍/mL의 poly(I:C)가 추가된 배지로 일차자극 후 BA1배지로 추가자극한 그룹이다.
도 2는 대량배양에서 일반배양(Control)조건과 2단계자극배양(G2BA1)에 의한 중간엽 줄기세포의 IDO 활성을 비교한 결과를 나타낸 것으로, 대조구(Control)는 10% 우혈청을 포함하는 DMEM-LG 배지에서 배양한 그룹, G2BA1 실험군은 대조구 배지에 20 ng/mL의 INF-감마가 추가된 배지로 일차자극 후 BA1배지(대조구 배지에 1 ng/mL의 IL-1 베타와 1 ng/mL의 TNF-알파가 추가된 배지)로 추가자극한 그룹)이다.
도 3은 일반배양(Control) 및 사이토카인 단독 혹은 혼합조성에 의해 3일간 전처리된 중간엽 줄기세포의 IL-1Ra 생성능을 비교한 결과로, 대조구(Control)는 10% 우혈청을 포함하는 DMEM-LG 배지에서 배양한 그룹, 실험군은 대조구 배지에 표 1과 같이 INF-감마, IL-1 베타, TNF-알파, 혹은 poly(I:C)를 단독 혹은 복합적으로 추가한 배지로 일차 자극한 그룹이다.
도 4는 일반배양(Control) 및 사이토카인 단독 혹은 혼합조성에 의해 전처리된 중간엽 줄기세포에서 키뉴레닌 생성능을 비교한 결과로, 대조구(Control)는 10% 우혈청을 포함하는 DMEM-LG 배지에서 배양한 그룹, 실험군은 대조구 배지에 표 1과 같이 INF-감마, IL-1 베타, TNF-알파, 혹은 poly(I:C)를 단독 혹은 복합적으로 추가한 배지로 일차 자극한 그룹이다.
도 5는 INF-감마와 IL-1 베타 혹은 TNF-알파가 단독 혹은 2종 혼합으로 사용된 조성과 사이토카인 3종 혼합조성에 의해 24시간 전처리 후의 배양액(CM1)과 일반증식배지(DMEM-LG10)로 배지 교환한 후 48시간 추가배양한 중간엽 줄기세포 배양액(CM2)에서 생성된 IL-1Ra 농도를 비교한 결과이다.
도 6은 INF-감마와 IL-1 베타 혹은 TNF-알파가 단독 혹은 2종 복합으로 사용된 경우와 사이토카인 3종 혼합조성에 의해 24시간 전처리 후 일반증식배지(DMEM-LG10)에서 48시간 추가배양한 중간엽 줄기세포 배양액에서 생성된 키뉴레닌 농도를 비교한 결과이다.
도 7은 INF-감마, IL-1 베타, 그리고 TNF-알파를 모두 포함하는 GBA 자극배지조성에서 각 사이토카인의 농도를 순차증가로 증가한 자극배지로 3일간 배양한 경우의 IL-1Ra 생성량을 비교한 결과로, GBA1X는 20 ng/mL의 INF-감마 + 1 ng/mL의 IL-1 베타 + 1 ng/mL의 TNF-알파의 혼합이고, 1.5×, 2×, 5×, 10×는 1× 농도에 대한 배수이다.
도 8은 INF-감마, IL-1 베타, 그리고 TNF-알파를 모두 포함하는 GBA 자극배지조성에서 하나 혹은 두 가지 사이토카인의 농도를 증가시킨 자극배지로 1일간 배양한 다음 일반증식배지로 배지 교환한 후 2일간 추가 배양한 경우의 IL-1Ra 생성량 비교한 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파를 혼합한 사이토카인 칵테일이 첨가된 기본배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 생성능이 강화된 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 기본배지에 대하여, IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파를 혼합한 사이토카인 칵테일이 첨가된 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 생성능이 강화된 줄기세포 제조용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명은 사이토카인 혼합물 조성을 이용한 자극배양을 통하여 종래의 배양방법으로는 매우 약하게 발현되는 인터류킨 1 수용체 길항제(IL-1Ra)등의 생성능이 극대화된 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 일반증식배지에서만 배양된 대조군, IFN-감마만 사용한 그룹, poly(I:C)을 사용한 그룹, IFN-감마와 poly(I:C)을 사용한 그룹에서는 IL-1Ra의 함량이 거의 검출되지 않았고, IL-1 베타와 TNF-알파를 단독 또는 혼합한 그룹 대비 IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파를 혼합한 사이토카인 칵테일로 자극한 중간엽 줄기세포는 현저히 높은 양의 IL-1Ra가 확인되었다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 24시간 동안 사이토카인으로 자극한 후 48시간 동안 일반증식배지에서 추가 배양한 중간엽 줄기세포의 IL-1Ra의 함량을 조사한 결과, IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파를 혼합한 사이토카인 칵테일로 자극한 경우에서만 높은 함량의 IL-1Ra이 유지됨을 확인하였다.
IL-1Ra의 함량이 향상된 중간엽 줄기세포는 염증환경에서 인터류킨-1에 의한 염증 증상의 악화 기전을 차단함으로써 염증반응을 통제할 수 있게 할 수 있을 것으로 기대된다.
또한 본 발명은 전처리된 중간엽 줄기세포로 하여금 높은 IL-1Ra 생성능 외에도 인돌아민-2,3-디옥시제나아제(IDO) 활성으로 인한 높은 키뉴레닌 생성능을 보유하게 한다. 따라서 본 발명에서 제조된 중간엽 줄기세포는 생체내에 적용될 경우 IL-1 베타에 의해 촉발되는 염증 신호전달경로를 IL-1Ra가 방해하게 되고 또한 세포가 위치하는 주변환경으로부터 트립토판을 제거시켜 T 면역세포의 증식을 억제하게 되어 결과적으로 염증증상의 악화를 방지하고 자가면역 등에 의해 촉발된 과다한 면역반응을 통제할 수 있게 될 것으로 기대된다.
본 발명의 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 생성능이 강화된 줄기세포의 제조방법은 체외에서 증식 배양된 중간엽 줄기세포에 대한 적절한 자극배양을 통하여 IL-1Ra 및 IDO의 생성능을 향상시키기 위한 것으로 중간엽 줄기세포의 체외증식배양 단계와, IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파의 혼합 사이토카인을 포함하는 세포자극용배지에서 상기 중간엽 줄기세포를 자극배양단계를 포함한다.
상기 사이토카인 칵테일은 IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파를 20 내지 200: 1 내지 10: 1 내지 10의 혼합 비율로 혼합한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 사이토카인 칵테일은 20 내지 200 ng/mL 농도의 IFN-감마, 1 내지 10 ng/mL 농도의 IL-1 베타, 및 1 내지 10 ng/mL 농도의 TNF-알파를 혼합한 것으로 상기 사이토카인 칵테일을 기본배지에 첨가하여 사용할 수 있다.
상기 줄기세포는 인간, 마우스, 랫트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 또는 고양이 등에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 인간일 수 있다. 더 구체적으로, 골수, 제대, 제대혈 또는 지방 조직 유래의 사람 중간엽 줄기세포일 수 있다. 이러한, 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에서 잘 알려져 있다.
중간엽 줄기세포의 체외증식배양 및 세포자극을 위한 상기 기본배지는 세포배양용으로 통상적으로 사용되는 공지의 기본배지로서, 예컨대, M199/F12 혼합물, MEM-알파(alpha Minimal essential Medium) 배지, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지, MCDB 131 배지, IMEM 배지, DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham?s F-12) 배지, PCM 배지 또는 MSC 확장 배지 등일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
이들 기본배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함하며, 줄기세포의 배양 시 동물 유래 혈청을 약 10% 내지 30% 정도 포함하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하게 된다.
줄기세포 배양에 사용되는 혈청은 태아, 송아지, 말 또는 사람의 혈청일 수 있고, 바람직하게는, 우태아혈청(FBS)일 수 있다. 또한, 동물 유래 혈청과 유사한 성분을 가지는 화합물, 예를 들어, BPE(bovine pituitary extract) 등을 사용할 수도 있다.
또한, 줄기세포 배양 시, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 좋다.
항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 펀지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다.
필요에 따라 L-글루타민 등의 산화영양소와 소듐 피루베이트 등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.
초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90 내지 95％, 온도 25 내지 40℃, 5 내지 10％ CO2 배양기에서 배양하고, 5 내지 10％ CO2 배양 시에는 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량％가 되게 소듐 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.
누적집단배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 70 내지 90％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 80％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대 배양을 한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 소규모배양에서 일반배양(Control) 조건과 여러 종류의 자극에 의한 IDO 활성 비교
사람 골수에서 분리하여 증식 배양된 중간엽 줄기세포를 일반증식배지 및 자극배지에서 배양하였다. 일반증식배지로는 10% 우혈청을 포함하는 Dulbecco?s Modified Eagle Medium with low Glucose (LG10) 배지를 사용하였고 제1자극배지로는 일반증식배지에 20 ng/mL의 INF-감마를 추가하거나 1 ng/mL의 폴리리보이노시닉 폴리리보시스티딜릭 산(Polyriboinosinic polyribocytidylic acid, poly(I:C))를 추가하여 사용하였다. 제2자극배지로는 일반증식배지에 1 ng/mL의 IL-1 베타와 1 ng/mL의 TNF-알파를 추가하여 사용하였다. 중간엽 줄기세포를 일반증식배지에 현탁시켜 배양용기 표면의 1 cm2 당 15,000개의 세포가 되도록 6-웰 세포배양용 플레이트에 접종하였다. 5%의 이산화탄소를 유지하는 배양기(CO2 배양기)에 넣고 3~5시간 정치하여 세포를 부착시킨 후 사용된 배지를 제거하였다. 일차자극배양을 위하여 제1자극배지를 넣고 CO2 배양기에 넣고 1일간 배양하였다. 비교를 위하여 일차 자극없이 일반증식배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 이후 사용된 배지를 제거하고 제2자극배지로 교환하여 CO2 배양기에 넣고 3일간 이차자극배양을 실시하였다. 비교를 위하여 일차 자극없이 일반증식배지에서 배양된 세포에도 이차자극배양을 실시하였다. 배양이 끝난 후 사용된 배지를 회수하여 원심분리하여 입자나 세포파편 등을 제거하고 상등액을 분석시료로 사용하였다. 이때 대조군으로 자극없이 일반증식배지에서만 배양된 세포의 배양액으로부터 회수한 상등액을 사용하였다.
<키뉴레닌 농도 측정방법>
세포내에서 발현되는 효소인 IDO의 활성에 의해 배지내의 트립토판이 키뉴레닌으로 전환되므로 자극배양 후 회수된 배양액에 포함된 키뉴레닌의 농도를 측정함으로써 IDO의 발현 정도를 간접적으로 확인하였다. 키뉴레닌의 농도를 측정하기 위하여 200 ㎕의 시료 혹은 순차적으로 희석된 키뉴레닌 용액을 80 ㎕의 30% TCA(trichloroacetic acid)와 혼합하였다. 60℃에서 15분간 정치 후 13,400×g로 15분간 원심분리하였다. 70 ㎕의 상등액과 70 ㎕의 Erlich 시약을 섞은 후 12분간 정치한 다음 480 nm에서 흡광도를 측정하였다. 순차적으로 희석된 키뉴레닌용액의 흡광도를 이용하여 표준곡선을 구하고 이를 이용하여 시료의 키뉴레닌 농도를 계산하였다.
도 1에서 볼 수 있듯이 아무런 자극없이 일반증식배지에서 배양된 중간엽 줄기세포 상등액(Control)에서는 2.0 마이크로몰(μM) 미만의 키뉴레닌이 검출되었고, 3일간의 BA1 자극배양그룹(BA1)에서는 약 6.0 마이크로몰(μM)의 키뉴레닌이 검출되었으며 poly(I:C)를 포함하는 일차자극배양 후 BA1으로 3일간 이차자극배양된 그룹(P2BA1)은 1.0 마이크로몰(μM) 미만의 키뉴레닌이 검출되었다. 이에 반해서 INF-감마를 포함하는 일차자극배양 후 연이어 3일간 IL-1 베타와 TNF-알파를 포함하는 배지에서 이차자극배양된 그룹(G2BA1)에서는 약 80 마이크로몰(μM)의 키뉴레닌이 검출되어 높은 IDO 활성이 유도되었음을 확인하였다.
<실시예 2> 대량배양에서 일반배양(Control) 조건과 이중자극배양에 의한 IDO 활성 비교
상기 실시예 1을 통하여 확립된 이중자극배양 프로토콜을 대량배양에 적용가능한지 확인하기 위하여 사람 골수 유래 중간엽 줄기세포를 대형 배양용기(T-175)를 이용하여 일반증식배지, 일차자극배지, 이차자극배지에서 순차적으로 배양을 실시하였다. 일반증식배지로는 10% 우혈청을 포함하는 Dulbecco?s Modified Eagle Medium with low Glucose(LG10) 배지를 사용하였고 일차자극배지로는 일반증식배지에 20 ng/mL의 INF-감마를 추가하여 사용하였다. 이차자극배지로는 일반증식배지에 1 ng/mL의 IL-1 베타와 1 ng/mL의 TNF-알파를 추가하여 사용하였다. 중간엽 줄기세포를 일반증식배지에 현탁시켜 배양용기 표면의 1 cm2 당 8,600개의 세포가 되도록 T-175 세포배양용기에 접종하였다. 5% CO2 배양기에 넣고 3~5시간 정치하여 세포를 부착시킨 후 사용된 배지를 제거하였다. 일차 자극배양을 위하여 일차자극배지를 넣고 CO2 배양기에 넣고 1일간 배양한 후 세포를 회수하고 동결보관하였다. 동결된 일차자극세포를 해동하여 일반증식배지에 현탁시켜 배양용기 표면의 1 cm2 당 8,600개의 세포가 되도록 T-175 세포배양용기에 접종하였다. 5% CO2 배양기에 넣고 3~5시간 정치하여 세포를 부착시킨 후 사용된 배지를 제거한 후 이차자극배지로 교환하여 CO2 배양기에 넣고 1일간 이차자극배양을 실시하였다. 배양이 끝난 후 사용된 배지를 회수하여 원심분리하여 상등액을 분석시료로 사용하였다. 이때 대조군으로 자극없이 일반증식배지에서만 배양된 세포의 배양액으로부터 회수한 상등액을 사용하였다.
키뉴레닌 농도는 상기 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 아무런 자극없이 일반증식배지에서 배양된 중간엽 줄기세포 상등액(Control)에서는 키뉴레닌이 거의 검출되지 않았고, INF-감마를 포함하는 일차자극배양 1일간 실시 후 이차자극배양을 1일간 실시한 경우(G2BA1)에는 약 17 마이크로몰농도(μM)의 키뉴레닌이 검출되어 높은 IDO 활성이 있음을 확인하였다.
<실시예 3> 일반배양(Control) 및 사이토카인 혼합조성에 의해 전처리된 세포에서 IL-1Ra 및 키뉴레닌 생성능 비교
실시예 1 및 실시예 2에서 IFN-감마를 이용한 자극배양 후 IL-1 베타 및 TNF-알파를 포함하는 배양조건에서 추가 자극배양하는 경우 높은 키뉴레닌 생성이 가능함을 확인하였다. 이를 토대로 이러한 두 가지 자극을 동시에 처리하는 경우 키뉴레닌 생성능이 높게 유지되는지 확인하는 한편 IL-1Ra의 함량이 향상되는지 조사하였다. 또한 비교를 위하여 poly(I:C), IFN-감마의 단독 혹은 복합 사용시 IL-1Ra 함량이 향상되는지도 조사하였다. 이를 위하여 사람 골수로부터 분리되어 증식배양된 중간엽 줄기세포를 일반증식배지 및 혼합자극배지에서 선별적으로 배양을 실시하였다. 일반증식배지(Control 그룹)로는 10% 우혈청을 포함하는 Dulbecco?s Modified Eagle Medium with low Glucose 배지를 사용하였고 혼합자극배지(GBA1 실험군)로는 일반증식배지에 20 ng/mL의 INF-감마, 1 ng/mL의 IL-1 베타와 1 ng/mL의 TNF-알파를 추가하여 사용하였다. 또한 비교를 위하여 GBA1 실험군을 포함 아래 표와 같은 대조군 및 자극배지용 추가 실험군을 준비하여 실험에 사용하였다.
자극배지 조성
Control G10 G20 P1 GP BA1 GBA1 PBA1 BA2 GBA2 PBA2 GPBA2
배지 LG10* LG10
INF-감마 (ng/mL) 10 20 20 20 20 20
IL-1 베타 (ng/mL) 1 1 1 0.025 0.025 0.025 0.025
TNF-알파 (ng/mL) 1 1 1 0.25 0.25 0.25 0.25
poly(I:C) (㎍/mL) 1 1 1 1 1
* LG10: DMEM Low Glucose(10% FBS 첨가됨)
중간엽 줄기세포를 일반증식배지(LG10)에 현탁시켜 배양용기 웰당 58,000개의 세포가 되도록 12-웰 세포배양용 플레이트에 접종하였다. 5% CO2 배양기에 넣고 6시간 정치하여 세포를 부착시킨 후 사용된 배지를 제거하였다. 자극배양을 위하여 준비된 자극배지를 각각 1mL씩 넣은 후 플레이트를 CO2 배양기에 넣고 3일간 배양하였다. 대조구로는 자극없이 일반증식배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 배양이 끝난 후 사용된 배지를 회수하여 원심분리하여 상등액을 분석시료로 사용하였다. 이 때 대조군으로 자극없이 일반증식배지에서만 배양된 세포의 배양액으로부터 회수한 상등액을 사용하였다.
<IL-1Ra 농도 측정방법>
중간엽 줄기세포에 의해 생성된 배양액내의 IL-1Ra농도를 측정하기 위하여 효소면역측정키트(Quantikine ELISA, R&D Systems)를 사용하였다. 측정방법은 키트 제조사의 프로토콜을 준수하였다. 인간 IL-1Ra에 대한 마우스 단클론항체가 코팅되어 있는 웰에 100 ㎕의 분석용 희석액을 넣은 후 시료, IL-1Ra 표준용액, 혹은 대조구 용액 각 100 ㎕를 추가하고 2시간 정치하였다. 각 웰의 내용물을 제거하고 세척용 완충액으로 4회 세척하였다. 페르옥시다아제가 결합된, IL-1Ra에 대한 다클론항체를 포함하는 컨쥬게이트 용액 200 ㎕를 더한 후 다시 2시간 정치하였다. 각 웰의 내용물을 제거하고 세척용 완충액으로 4회 세척한 다음, 200 ㎕의 발색용 기질용액을 넣고 실온 암소에서 20분간 반응시켰다. 2N 황산용액 50 ㎕를 혼합하여 반응을 중지시키고 450 nm 및 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 450 nm에서의 흡광도에서 540 nm에서의 흡광도를 차감한 후 표준용액으로부터 얻어진 흡광도를 이용하여 표준곡선을 작성하고 이를 이용하여 시료의 IL-1Ra 농도를 계산하였다.
키뉴레닌 농도는 상기 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 측정하였다.
도 3에서 볼 수 있듯이 아무런 자극없이 일반증식배지에서 배양된 중간엽 줄기세포 상등액(Control 그룹)이나 IFN-감마만 사용한 그룹(G10, G20), poly(I:C)만 사용한 그룹(P1), 그리고 IFN-감마와 poly(I:C)를 동시에 사용한 그룹 등에서는 IL-1Ra의 함량이 거의 검출되지 않았고 낮은 농도의 IL-1 베타 및 TNF-알파를 단독 혹은 다른 인자와 함께 사용한 그룹(BA2, GBA2, PBA2, GPBA2) 그리고 높은 농도의 IL-1 베타 및 TNF-알파를 단독 혹은 poly(1:C)와 같이 사용한 그룹(BA1, PBA1)등에서는 낮은 농도의 IL-1Ra가 검출되었다. 그리고 높은 농도의 IL-1 베타 그리고 TNF-알파와 함께 INF-감마가 사용된 경우(GBA1 그룹)에서만 특이적으로 약 130 pg/mL의 IL-1Ra가 검출되어 상기의 GBA1 혼합자극배지는 높은 IL-1Ra 유도능이 있음을 확인하였다.
또한 도 4에서 볼 수 있듯이 GBA1 그룹을 포함 IFN-감마가 포함된 자극배지에서만 50 μM 이상의 키뉴레닌이 검출되었고 대조군이나 poly(I:C) 혹은 IL-1 베타 및 TNF-알파 등의 단독 혹은 복합사용에 의해서는 상대적으로 낮은 키뉴레닌이 검출되었다. 이러한 결과를 놓고 볼 때 높은 농도의 IL-1 베타 그리고 TNF-알파와 함께 IFN-감마를 포함하는 자극배지로 자극하여야만 높은 함량의 IL-1Ra을 보장할 수 있음을 확인하였으며 이러한 자극조건에서 IDO 활성도 높아져 높은 키뉴레닌 생성능을 유지하는 것을 확인하였다.
<실시예 4> IFN-감마와 IL-1 베타 혹은 TNF-알파가 사용된 경우와 사이토카인 3종 혼합조성에 의해 24시간 전처리 후 일반증식배지(LG10)에서 48시간 추가배양된 중간엽 줄기세포에 의한 IL-1Ra 생성능 비교
IFN-감마, IL-1 베타, 그리고 TNF-알파의 세가지 사이토카인이 높은 IL-1Ra 생성을 위한 필수조건인지를 확인하기 위하여 각 사이토카인 단독으로 사용된 경우 혹은 IFN-감마를 기본으로 하고 IL-1 베타 혹은 TNF-알파를 동시에 사용한 경우, 그리고 세 가지 사이토카인 모두를 포함하는 경우에 IL-1Ra 생성량이 차이가 있는 지를 조사하였다.
본 실시예에서는 사이토카인으로 전처리한 후 배지를 제거하고 일반증식배지(LG10)으로 교환하였을 때 중간엽 줄기세포가 IL-1Ra를 생성하는 능력을 여전히 보유하고 있는지 확인하고자 하였다. 이를 위하여 본 실시예에서는 아래 표와 같은 자극배지 조성을 준비하여 실험에 사용하였으며 24시간 전처리 자극 후 일반증식배지(LG10)로 48시간 추가 배양하여 최종 배양액을 시료로 사용하였고 전처리의 종류에 따른 세포의 IL-1Ra 생성능에 차이가 있는지를 비교하였다. 또한 이때 IDO 활성의 변화가 있는지를 알아보기 위하여 최종 48시간 배양액의 키뉴레닌 농도를 측정하였다.
자극배지 조성
LG10 G20 B1 A1 GB1 GA1 BA1 GBA1
배지 LG10* LG10
INF-감마 (ng/mL) - 20 20 20 20
IL-1 베타 (ng/mL) - 1 1 1 1
TNF-알파 (ng/mL) - 1 1 1 1
* LG10: DMEM Low Glucose(10% FBS 첨가)(일반증식배지)
이를 위하여 중간엽 줄기세포를 일반증식배지에 현탁시켜 배양용기 웰당 50,000개의 세포가 되도록 24-웰 세포배양용 플레이트에 접종하였다. 5% CO2 배양기에 넣고 1일간 배양하여 세포를 부착시킨 후 사용된 배지를 제거하였다. 자극배양을 위하여 준비된 자극배지 0.5 mL을 각각 넣은 후 플레이트를 CO2 배양기에 넣고 24시간 배양하였다. 자극배양 후 사용된 배지를 완전히 제거하고 일반증식배지를 추가한 후 48시간 다시 배양하였다. 대조구로는 자극없이 일반증식배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 배양이 끝난 후 사용된 배지를 회수하여 원심분리하여 상등액을 분석시료로 사용하였다.
IL-1Ra 농도는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였고, 키뉴레닌 농도는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다.
본 실시예는 여러 가지 사이토카인 조합으로 24시간 중간엽 줄기세포를 전처리하고 나서 사용된 자극배지를 제거하고 일반증식배지로 교환하여 추가로 48시간 배양한 경우의 배양액에 생성된 IL-1Ra 및 키뉴레닌 농도를 측정한 것으로 전처리 자극이 없어진 후에도 IL-1Ra 및 키뉴레닌 생성능이 존재하는지 확인하고자 하였다.
도 5에서 볼 수 있듯이 24시간 전처리배양액(CM1)에서는 INF-감마+IL-1 베타(GB1) 혹은 INF-감마+TNF-알파(GA1)의 2종 사이토카인 조합의 경우에 대조군인 LG10에 비해서 다소 증가된 IL-1Ra 양상을 보였으나 유의한 정도는 아니었고 INF-감마+IL-1 베타+TNF-알파(GBA1)으로 전처리되었을 경우가 가장 유의하게 높은 IL-1Ra 농도를 보여주었다. 또한 자극이 제거된 후 48시간 일반배양된 후의 배양액에서는 INF-감마(G20) 혹은 IL-1 베타(B1) 혹은 TNF-알파(A1) 만으로 전처리되었을 경우나 INF-감마+IL-1 베타(GB1) 혹은 INF-감마+TNF-알파(GA1) 혹은 IL-1 베타+TNF-알파(BA1)의 2종 사이토카인 조합에 의해서는 대조군에 비하여 동등 이하의 IL-1Ra 생성량을 보인 반면 INF-감마+IL-1 베타+TNF-알파(GBA1)의 3종 사이토카인 조합으로 전처리되었을 경우에는 의미 있게 높은 IL-1Ra 생성량을 유지한 것으로 나타났다. 이로써 INF-감마, IL-1 베타, 그리고 TNF-알파의 세 가지 사이토카인 모두를 포함하는 자극배지조성(GBA1 자극배지)으로 처리된 중간엽 줄기세포만이 높은 IL-1Ra를 생성하게 하는 의미 있는 조성임을 알 수 있었다.
또한, 도 6에서 볼 수 있듯이 GBA1 자극배지를 포함한 20 ng/mL의 INF-감마가 포함된 모든 조성에서 48시간 배양액에서 높은 키뉴레닌 농도가 검출되어 20 ng/mL의 INF-감마가 높은 IDO 활성을 유도하는 가장 중요한 요인임을 확인하였으며 GBA1 조성이 INF-감마에 의한 IDO 활성의 증가를 방해하지 않음을 확인하였다.
<실시예 5> 증가된 농도의 사이토카인 3종 혼합조성에 의해 전처리된 세포에 의한 IL-1Ra 생성능 비교
실시예 3에서 INF-감마와 함께 1 ng/mL의 높은 IL-1 베타 및 TNF-알파를 동시에 사용하는 자극배지(GBA1 자극배지)로 중간엽 줄기세포를 전처리하였을 때 많은 양의 IL-1Ra가 생성됨을 확인하였다. 본 실시예에서는 이러한 경향이 GBA1 자극배지에 포함된 사이토카인의 농도을 증가하였을 때도 높은 IL-1Ra 생성이 보장되는지 확인하기 위하여 아래 표와 같은 자극배지 조성을 준비하여 실험에 사용하였다.
자극배지 조성
GBA1X GBA1.5X GBA2X GBA5X GBA10X
배지 LG10*
INF-감마 (ng/mL) 20 30 40 100 200
IL-1 베타 (ng/mL) 1 1.5 2 5 10
TNF-알파 (ng/mL) 1 1.5 2 5 10
* LG10: DMEM Low Glucose(10% FBS이 첨가됨)
중간엽 줄기세포를 일반증식배지에 현탁시켜 배양용기 웰당 23,000개의 세포가 되도록 24-웰 세포배양용 플레이트에 접종하였다. 5% CO2 배양기에 넣고 4일간 배양하여 세포를 부착 및 증식시킨 후 사용된 배지를 제거하였다. 자극배양을 위하여 준비된 자극배지를 각각 넣은 후 플레이트를 CO2 배양기에 넣고 3일간 자극배양하였다. 대조구로는 자극없이 일반증식배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 배양이 끝난 후 사용된 배지를 회수하여 원심분리하여 입자나 세포파편 등을 제거하고 상등액을 분석시료로 사용하였다. 이때 대조군으로 자극없이 일반증식배지에서만 배양된 세포의 배양액으로부터 회수한 상등액을 사용하였다.
IL-1Ra 농도는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 중간엽 줄기세포는 GBA 자극배지에 포함된 사이토카인의 농도가 높아질수록 더 많은 량의 IL-1Ra를 생성되는 것으로 확인되었다.
<실시예 6> 여러 비율의 사이토카인 3종 혼합조성에 의해 24시간 전처리 후 일반증식배지(LG10)에서 48시간 추가배양된 중간엽 줄기세포에 의한 IL-1Ra 생성능 비교
본 실시예는 3종 사이토카인 조합으로 24시간 중간엽 줄기세포를 전처리하고 나서 사용된 자극배지를 제거하고 일반증식배지로 교환하여 추가로 48시간 배양한 경우 전처리 자극이 없어진 후에도 IL-1Ra 생성능이 존재하는지 확인하고자 하였다.
GBA1 GBA-B10 GBA-A10 GBA-BA10 GBA-G200
배지 LG10*
INF-감마 (ng/mL) 20 20 20 20 200
IL-1 베타 (ng/mL) 1 10 1 10 1
TNF-알파 (ng/mL) 1 1 10 10 1
* LG10: DMEM Low Glucose(10% FBS이 첨가됨)
이를 위하여 중간엽 줄기세포를 일반증식배지에 현탁시켜 배양용기 웰당 25,000개의 세포가 부착되도록 24-웰 세포배양용 플레이트에 접종하였다. 5% CO2 배양기에 넣고 4일간 배양하여 세포를 부착 및 증식시킨 후 사용된 배지를 제거하였다. 자극배양을 위하여 준비된 자극배지를 각각 넣은 후 플레이트를 CO2 배양기에 넣고 1일간 자극배양하였다. 대조구로는 자극없이 일반증식배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 자극배양이 끝난 후 사용된 배지를 제거하고 일반증식배지를 추가한 후 2일간 추가배양하였다. 배양이 끝난 후 배지를 회수하여 원심분리하여 상등액을 분석시료로 사용하였다. 이 때 대조군으로 자극없이 일반증식배지에서만 배양된 세포의 배양액으로부터 회수한 상등액을 사용하였다.
IL-1Ra 농도는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였다.
도 8에서 볼 수 있듯이 중간엽 줄기세포는 GBA 자극배지에 의해 자극을 제거한 후에도 높은 IL-1Ra를 생성하는 것으로 확인되었다. 또한 IL-1 베타 혹은 INF-감마 성분을 10배로 증가시킨 GBA 조성은 IL-1Ra의 농도가 GBA1과 별 차이가 없었으나 10배 증량된 TNF-알파 성분을 포함한 실험군인 GBA-A10 및 GBA-BA10 실험군에서는 GBA1에 비해 약 300% 향상된 IL-1Ra 농도를 보여주었다. 따라서 IL-1Ra 생성량을 높이기 위해서 GBA1에 포함된 개별 사이토카인의 함량을 높이는 경우에는 TNF-알파의 영향이 가장 높음을 확인할 수 있었다.
본 발명은 줄기세포 배양용 배지 제조 분야에 사용할 수 있다.

Claims (9)

  1. IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파를 혼합한 사이토카인 칵테일이 첨가된 기본배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 생성능이 강화된 줄기세포의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    사이토카인 칵테일은 IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파를 20 내지 200: 1 내지 10: 1 내지 10의 혼합 비율로 혼합한 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    줄기세포는 골수, 지방 조직, 제대 또는 제대혈 유래의 사람 중간엽 줄기세포인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    줄기세포는 10% 내지 30%의 우태아, 송아지, 말 또는 사람의 혈청 하에서 배양하는 것인, 방법.
  5. 기본배지에 대하여,
    IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파를 혼합한 사이토카인 칵테일이 첨가된, 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 생성능이 강화된 줄기세포 제조용 배지 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    사이토카인 칵테일은 IFN-감마, IL-1 베타 및 TNF-알파를 20 내지 200: 1 내지 10: 1 내지 10의 혼합 비율로 혼합한 것인, 줄기세포 제조용 배지 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    줄기세포는 골수, 지방 조직, 제대 또는 제대혈 유래의 사람 중간엽 줄기세포인, 줄기세포 배양용 배지 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    기본배지는 M199/F12 혼합물, MEM-알파 배지, DMEM 배지, MCDB 131 배지, IMEM 배지, DMEM/F12 배지, PCM 배지 및 MSC 확장 배지로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 줄기세포 배양용 배지 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    조성물은 우태아, 송아지, 말 또는 사람의 혈청, L-글루타민, 항생제 및 항진균제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는, 줄기세포 배양용 배지 조성물.
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