TWI604849B - 中華被毛孢多醣體用於促進胰島素敏感性之用途及其製備方法 - Google Patents

中華被毛孢多醣體用於促進胰島素敏感性之用途及其製備方法 Download PDF

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Description

中華被毛孢多醣體用於促進胰島素敏感性之用途及其製備方法
本發明係提供一種中華被毛孢多醣體之用途；進一步而言，本發明係提供一種中華被毛孢多醣體用於促進胰島素敏感性之用途。
從數千年前開始，亞洲國家已開始使用傳統的中草藥，因此，對中草藥的應用具有相當長遠的歷史。藥用菇類是常用傳統中草藥劑的一種，其包括例如：牛樟芝(Antrodia cinnamomea)、姬松茸(Agaricus blazei Murrill)、靈芝(Ganoderma lucidum)、以及冬蟲夏草(Ophiocordyceps sinensis)。這些中草藥劑中含有多種具有生物活性與調節免疫能力的化合物，而幾個世紀以來，冬蟲夏草一直被用來增長人體的壽命與促進健康。近期的研究將冬蟲夏草無性生殖菌絲(anamorphic mycelium)定義為中華被毛孢(Hirsutella sinensis)，並有研究顯示，冬蟲夏草子實體與中華被毛孢菌絲的萃取物對於實驗動物具有多種的功效，包括：抗疲勞、抗發炎、腎臟保健、以及促進性欲等。然而，目前並沒有冬蟲夏草/中華被毛孢可能對胰 島素抗性有幫助之報導，而冬蟲夏草/中華被毛孢內產生促進胰島素敏感性的活性物質亦仍未知。
第2型糖尿病的特徵係無法調節血液中葡萄糖的程度。長期而言，這種現象會導致若干併發症的產生，例如：心血管疾病、眼睛損傷、足部潰瘍、腎臟衰竭、以及中風。糖尿病的盛行在現今社會中是公眾健康主要的威脅之一，全世界估計有3億8,700萬的糖尿病患者。故，糖尿病的預防為現今社會的一大挑戰。
早期的第2型糖尿病，週邊組織(peripheral tissues)如：肝臟、肌肉、脂肪組織對胰島素的敏感性降低。對於早期的第2型糖尿病，可使用如：飲食控制、運動、以及藥物等方法來穩定血糖程度。舉例而言，二甲雙胍類藥物每福敏(metformin)係一種人工合成的藥物，其可藉由抑制胰臟分泌胰島素來降低高血脂病。此外，每福敏亦增加週邊組織的胰島素敏感性並減少小腸道吸收葡萄糖。然而，每福敏以及其他抗糖尿病的藥物皆會產生一些不良的副作用(如：噁心、腹瀉和其他胃部病徵、虛弱無力或呼吸困難，或口腔內有金屬味等)而限制治療的功效。
鑑於糖尿病人口的增長以及對糖尿病預防及治療的困難，人們需要一種替代性的方法來預防、治療、或控制糖尿病。亟需一種新的方法可直接引入飲食中，而不需要大幅改變日常生活習慣且不會產生毒性或不良的影響。
有鑑於此，本發明之一方面係提供一種中華被毛孢 (Hirsutella sinensis)多醣體用於製備提升胰島素敏感性之藥物的用途，其中該中華被毛孢多醣體係為中華被毛孢菌絲體的水萃取物；且其中該中華被毛孢多醣體物至少包含甘露醣(mannose)、葡萄醣(glucose)、及半乳醣(galactose)。本發明之中華被毛孢多醣體進一步包含岩藻醣(fucose)、鼠李醣(rhamnose)、阿拉伯醣(arabinose)、葡萄醣胺(glucosamine)、及半乳醣胺(galactosamine)。在本發明之一實施例中，該中華被毛孢多醣體中岩藻醣、鼠李醣、阿拉伯醣、葡萄醣胺、半乳醣、葡萄醣、甘露醣以及半乳醣胺的比例係為3：3：1：4：23：12：50：0.2至4：4：2：5：24：13：51：0.6。其中該中華被毛孢多醣體之重量平均分子量(weight average molecular weight)係為312kDa，以及範圍係介於15,776Da至1,231,969Da之間，分子量分布指數(Mw/Mn)係為7.475。本發明所提供之中華被毛孢多醣體係降低一個體空腹血液中胰島素含量、空腹血液中葡萄糖含量；同時，本發明之中華被毛孢多醣體亦可降低一個體對胰島素之抵抗性。在本發明之一實施例中，該中華被毛孢多醣體之有效劑量係0.001mg/kg至1g/kg。
本發明之另一方面係提供一種中華被毛孢多醣體之製備方法，包含：由一中華被毛孢菌絲以水萃取，並續以一醇類沉澱，再經離心分離與濾膜過濾而得，其中，(a)將一中華被毛孢菌絲與水混合並以低轉速萃取一預定時間，取上清液並將該上清液濃縮，以獲得一中華被毛孢萃取濃縮物；(b)將該中華被毛孢萃取濃縮物加入一醇類靜置一段時間以沉澱出一中華被毛孢多醣體粗萃取物；以及(c)將該中華被毛孢多醣體粗萃取物離心後獲得一沉澱物；以切向流過濾系統(tangential flow filtration,TFF)過濾該沉澱物，以獲得一中華被毛孢多醣體。
在本發明之一實施例中，步驟(a)之該上清液係以蒸發方式濃縮且步驟(a)該中華被毛孢菌絲與水混合的比值為5.0%(w/v)；步驟(b)中該醇類係為95%酒精、該中華被毛孢萃取濃縮物之濃度比值為20.0%(w/v)與95%酒精混合的比例為1：5、而該一段時間係至少16小時；步驟(c)之切向流過濾系統由0.2μm中空纖維膜過濾及10-300kDa超限濾膜(50cm2，polyethersulfone，PES)之組合進行劃分過濾。
本發明之中華被毛孢多醣體係可用於在動物體或人體中降低高血糖症並促進胰島素敏感性，因此，可提供作為治療或預防第2型糖尿病或其他血糖恆定相關疾病之醫藥品、補充品、或飲食品。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，以下所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖係為本發明中華被毛孢多醣體之萃取流程圖；第2圖係為本發明使用高效陰離子交換層析與脈衝安培檢測(high-performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD)分析中華被毛孢多醣體分餾液(CS-1)中的單醣組成；第3圖係為本發明中華被毛孢多醣體分餾液(CS-1)之凝膠滲透圖譜(gel permeation chromatogram)； 第4圖係為本發明中華被毛孢多醣體分餾液(CS-1)的分子量取對數(Log molecular weight)對重量分部/微分分子量取對數(weight fraction/dLogMW)的曲線圖；第5圖係為本發明中華被毛孢多醣體分餾液(CS-1)的分子量取對數(Log molecular weight)對累積重量分部(cumulative weight fraction)的曲線圖；第6圖係為本發明中華被毛孢多醣體分餾液對於小鼠口服葡萄糖耐受性測試(OGTT)與胰島素耐受性測試(ITT)的影響。(A)代表口服葡萄糖負荷為3g/kg於時間點為0施予6至8隻空腹小鼠並使用一標準葡萄糖測量儀測量該些小鼠尾巴頂端靜脈收集血液之血糖的程度；(B)代表經由該葡萄糖負荷處理後的曲線下面積(area under the curve，AUC)；(C)代表監控胰島素負荷為1U/kg於時間點為0腹腔注射施予之血糖程度；(D)代表經由該胰島素負荷處理後的曲線下面積。在口服葡萄糖耐受性測試以及胰島素耐受性中，與控制組高脂肪飼料餵食小鼠相比較，以CS-1、CS-2、以及CS-3分餾物處理，可降低高脂肪飼料餵食小鼠的血糖。在數值統計分析應用上使用Student’s t test(***P<0.001，ns為非顯著)。
定義
本文所述之有效劑量表示能減少動物及人類體重及脂肪堆積的中華被毛孢多醣體劑量。適當的有效劑量可依所治療生物體或個體的不同而有所差異，但可使用劑量遞增的各種實驗技術決定有效劑量。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20% 的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
本發明提供一種能促進胰島素敏感性的中華被毛孢多醣體，經由實驗顯示本發明之中華被毛孢多糖體能有效降低一個體空腹血液中胰島素與葡萄糖的含量。概括而言，每日給予哺乳動物或人類本發明之多醣體0.001至1,000mg/kg(體重)劑量可有效降低該哺乳動物或人類對胰島素之抵抗性，詳細說明如下。
首先，將中華被毛孢多醣體定性，之後經由實驗顯示該分離的中華被毛孢多醣體對於空腹胰島素、空腹血糖、胰島素抗性(HOMA-IR)、以及小鼠口服葡萄糖耐受性之影響。
實施例1 本發明之中華被毛孢多醣體的製備方法
本發明之中華被毛孢多醣體係為中華被毛孢菌絲體的水萃取物能有效用於降低高血糖症以及促進胰島素敏感性。本發明之中華被毛孢多醣體可加入至飲食中，其可為一飲品、日常補充品或食品，不需要在生活方式有太大的改變，且不會引起毒素或對健康造成不良的影響。
1.1本發明中華被毛孢多醣體的製備方法
第1圖係顯示從中華被毛孢(冬蟲夏草無性生殖菌絲體)分離多醣體之方法。首先，由長庚生物科技股份有限公司(臺北，臺灣)取得之乾燥液態醱酵的冬蟲夏草無性生殖菌絲體(即：中華被毛孢，500g)混合10L蒸餾水形成混合液(50g/L)，其中固體與液體比值為5.0%(w/v)，以20公升攪拌式反應器、121℃高溫以及150RPM轉速(revolution per minute)條件 下萃取30分鐘。接著，離心該萃取後混合液以去除固體物質，獲得一中華被毛孢水萃取物，並以蒸發方式濃縮該中華被毛孢醱酵菌絲體水萃取物至體積為2.5公升，並分裝至20mL暗色玻璃安瓶，接著經高溫高壓滅菌處理20分鐘，獲得一固體與液體比值為20.0%(w/v)的一中華被毛孢萃取濃縮液，保存於4℃備用。
1.2本發明中華被毛孢多醣體粗萃取物的製備步驟
如第1圖所示，取120mL、20.0%(w/v)的中華被毛孢萃取濃縮物(代號為W1，含有總水溶性碳水化合物2.09g；詳見表1)，加入600mL(五倍中華被毛孢水萃取濃縮物體積)、95%酒精混合均勻，在4℃靜置16小時以沉澱出中華被毛孢多醣體粗萃取物，接著續以離心去除上清液，並以120mL、70%冰酒精清洗及離心沉澱中華被毛孢多醣體粗萃取物三次。接著，將三次的上清液混合為酒精沉澱上清液，體積為1,040mL(代號為CS-4，含有總水溶性碳水化合物0.83g；詳見表1)。取1,000mL蒸餾水復溶酒精沉澱中華被毛孢多醣體粗萃取物，經濃縮至體積為700mL以去除殘留酒精，接著加入蒸餾水定量此中華被毛孢多醣體粗萃取物體積至2,400mL(代號為W2，含有總水溶性粗多醣1.26g；詳見表1與表2)。
1.3本發明中華被毛孢多醣體粗萃取物的分離純化
取2,400ml中華被毛孢多醣體粗萃取物至50℃水浴槽，接著以切向流過濾系統TFF(Spectrum公司，KrosFlo型號)組合0.2μm中空纖維膜(1,500cm2，PES)進行劃分過濾並將過膜壓力(transmembrane pressure，TMP)控制在15-16psi。當回流液體積剩餘800-1,000mL時補入蒸餾水600 mL，繼續進行過濾。重複操作補入蒸餾水600mL三次，共計補入蒸餾水1,800mL。得到1,250mL的CS-1-1分餾液(含總水溶性粗多醣0.24g)及3,600mL過濾液。
取上述3,600mL、0.2μm中空纖維膜過濾液至50℃水浴槽，接著以切向流過濾系統組合300kDa超限濾膜(50cm2，PES)進行劃分過濾，將過膜壓力(TMP)控制在18-20psi。當回流液體積剩餘1,000至1,200mL時補入蒸餾水600mL，繼續進行過濾。得到回流液體積為1,040mL的CS-1-2分餾液(含總水溶性粗多醣0.18g)及3,600mL過濾液。合併CS-1-1分餾液與CS-1-2分餾液得到體積為2,290mL的CS-1分餾液(總水溶性粗多醣0.42g；詳見表2)。
另取上述步驟3,600mL、300kDa超限濾膜過濾液至50℃水浴槽，接著以切向流過濾系統組合10kDa超限濾膜(50cm2，PES)進行劃分過濾，將過膜壓力(TMP)控制在18-20psi。當回流液體積剩餘1,000至1,200mL時補入蒸餾水600mL，繼續進行過濾。得到990mL的10kDa至300kDa的CS-2分餾液(總水溶性粗多醣0.64g；詳見表2)，3,600mL的10kDa過濾液，該10kDa過濾液即為小於10kDa的CS-3分餾液(總水溶性粗多醣0.16g；詳見表2)。
將劃分收集到的四個CS-1~CS-4分餾液，進行濃縮至少量體積並復溶於蒸餾水至體積120mL。將每一分餾液分裝至20mL暗色玻璃安瓶，接著經121℃滅菌20分鐘，保存於4℃備用。
1.4本發明之中華被毛孢多醣體總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多醣含量分析
本發明使用酚-硫酸法分析20.0%(w/v)的中華被毛孢水萃取濃縮物(代號為W1，120mL)、中華被毛孢多醣體粗萃取物(代號為W2，2,400mL)、CS-1分餾液(2,290mL)、CS-2分餾液(990mL)、CS-3分餾液(3,600mL)與CS-4分餾液(1,040mL)之總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多醣含量。配製0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16、0.18與0.20mg/mL之葡萄糖標準溶液。每一濃度的葡萄糖標準溶液分別取200μL至1.5mL微量離心管，再加入200μL、5%苯酚並混合均勻。接著加入1mL硫酸，混合均勻。待靜置20分鐘，以分光光度計(spectrophotometer)在波長490nm下測定其讀值，並以此讀值建立檢量線，檢量線之R2>0.99。待測樣品經適當稀釋後，取200μL至1.5mL微量離心管，再加入200μL、5%苯酚，混合均勻。接著加入1mL硫酸，混合均勻。待靜置20分鐘，以分光光度計在波長490nm下測定其讀值，將讀值帶入檢量線可以計算獲得總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多醣的濃度。
中華被毛孢多醣體粗萃取物的總水溶性碳水化合物與總水溶性粗多醣含量分析結果如表1及表2所示，其中在表2的20%(w/v)中華被毛孢萃取濃縮液的總水溶性粗多醣含量分布分析中，中華被毛孢多醣體粗萃取物(W2)的總水溶性粗多醣中含有0.42克截留分子量大於300kDa的本發明之中華被毛孢多醣體(CS-1)，其佔總中華被毛孢多醣體粗萃取物(W2)的33.3%；0.64克截留分子量10kDa至300kDa的本發明之中華被毛孢多醣體(CS-2)，其佔總中華被毛孢多醣體粗萃取物(W2)的50.8%；0.16克截留 分子量小於10kDa的本發明之中華被毛孢多醣體(CS-3)，其佔總中華被毛孢多醣體粗萃取物(W2)的12.7%。
1.5本發明中華被毛孢多醣體的單醣組成分析
第2圖顯示使用高效能陰離子交換色層分析儀裝配脈衝式安培檢測器(Dionex ICS-5000 System)分析CS-1多醣體分餾液之單醣組成。岩藻醣(L-fucose)、鼠李醣(L-rhamnose)、半乳醣胺(D-galactosamine)、阿拉伯醣(D-arabinose)、葡萄醣胺(D-glucosamine)、半乳醣(D-galactose)、葡萄醣 (D-glucose)與甘露醣(D-mannose)之標準混合溶液濃度為0.1、0.5、1.0、2.0與5.0mg/L。分析條件係：注射體積為25μL、分析管柱為CarboPac PA1(4×250mm)、移動相為純水(92%)與200mM氫氧化鈉水溶液(8%)經混合後組成比例為16mM氫氧化鈉水溶液、流速為1.0ml/min、以及管柱烘箱溫度為30℃。注射入單醣標準品，經過30分鐘之分析時間，可獲得單醣標準品在0.1、0.5、1.0、2.0與5.0mg/L的峰形積分面積，以此積分面積建立各別單醣之檢量線，檢量線之R2>0.99。
取1.0mL中華被毛孢CS-1分餾液(總水溶性粗多醣3mg)加入1.79mL蒸餾水以及1.33mL三氟醋酸(trifluoroacetic acid)，在112℃下加熱12小時進行酸水解。接著將此混合物濃縮並反覆復溶於蒸餾水以除酸，最後復溶於蒸餾水至1mg/mL。此水解產物經稀釋4倍(0.25mg/mL)後取25μL，利用高效能陰離子交換色層分析儀搭配脈衝式安培檢測器與分析管柱分析，移動相為純水(92%)與200mM氫氧化鈉水溶液(8%)經混合後組成比例為16mM氫氧化鈉水溶液、流速為1.0ml/min、管柱烘箱溫度為30℃。經過30分鐘之分析時間，將樣品分析所得峰形之滯留時間與積分面積與上述8個標準品相比對，可經由標準品檢量線計算出中華被毛孢分餾液(CS-1)的各別單醣濃度，進而獲得單醣組成的百分比。中華被毛孢分餾液(CS-1)經高效能陰離子交換色層分析儀搭配脈衝式安培檢測器分析單醣組成比例，岩藻醣佔3.2%、鼠李醣佔3.4%、阿拉伯醣佔1.7%、葡萄醣胺佔4.6%、半乳醣佔23.8%、葡萄醣佔12.5%、甘露醣佔50.4%以及半乳醣胺佔0.4%，詳如表3、表4、以及第2圖所示。
1.6本發明中華被毛孢多醣分子量分佈的分析
本發明使用分子篩滲透層析法(size-exclusion chromatography，SEC)搭配折射(refractive index，RI)、以及光散射(light scattering，LS)二合一偵測器之高效液相色谱分析儀(high performance liquid chromatography，配有Waters 2410折射率檢測器index detector，Viscotek 270雙檢測器)來分析中華被毛孢分餾液(CS-1)與分餾液(CS-2)中的多醣分子量分佈。製備濃度為1.5mg/mL的分子量標準品葡聚糖(Dextran 670；分子量為667,800Da)進行系統校正。分析條件係：注射體積100μL、分析管柱為串接2組GPC管柱TSKgel G5000PWxL(7.8×300mm)與TSKgel G6000PWxL(7.8×300mm)、移動相為純水添加0.02% NaNO3、流速為0.5ml/min、管柱分析溫度為45℃。
取CS-1及CS-2分餾液以上述條件以OmniSEC軟體(Viscotek公司，美國)進行分析，其計算方式如下表示：Mn：數目平均分子量
Mw：重量平均分子量
Mz：較高平均分子量
Mp：最高波鋒分子量，為分子量分布最高重量分布點的分子量
Mi：單鏈分子量(molecular weight of a chain)
Ni：單鏈的數目(number of chains of that molecular weight)
利用光散射GPC/SEC系統進行CS-1分餾液(總水溶性粗多 醣4.0mg/ml)的分子量分析：取得折射率(refractive index，RI)以及光散射(light scattering，LS)數據(第3圖)。多醣分子量分布以OmniSEC軟體(Viscotek公司，美國)進行分析(第4圖)，同時獲得累積重量分部(cumulative weight fraction)(第5圖)。
CS-1分餾液累積重量分部值為0.95(5%)及0.05(95%)，多醣分子量分別為15,776Da及1,231,969Da。在15,776Da及1,231,969Da之間的多醣佔有大約90%的總多醣重量，分子量分布指數(Mw/Mn)係為7.475。表五顯示CS-1與CS-2多醣分餾液之比較表。
實施例2 本發明中華被毛孢多醣體對高脂飲食誘導成肥胖小鼠(high-fat diet-fed，HFD-fed)在促進胰島素敏感性之功效
第6A至6D圖顯示本發明中華被毛孢多醣體於高脂飲食誘 導肥胖的小鼠經口服葡萄糖耐受性測試(OGTT)與口服胰島素耐受性測試(ITT)之結果。C57BL/6NCrlBltw小鼠係以標準飼料(能量來源13.5%為脂肪)或高脂肪含量飼料(能量來源60%為脂肪)飼養，並每天藉由胃內灌食的方式以100μL的中華被毛孢多醣體分餾液(CS-1、CS-2、CS-3、以及CS-4)或蒸餾水處理，持續3個月(n=5代表每組各有5隻小鼠)，分別為HFD+8% CS-1、HFD+8% CS-2、HFD+8% CS-3、HFD+8% CS-4、HFD、Chow+8% CS-1、Chow+8% CS-2、Chow+8% CS-3、Chow+8% CS-4及Chow組。
如第6A至6B圖所示，HFD+8% CS-1、HFD+8% CS-2、HFD+8% CS-3組血液中葡萄糖的濃度明顯較僅以蒸餾水處理之控制HFD組為低，說明以中華被毛孢多醣體分餾液CS-1至CS-3(8%)處理之小鼠的葡萄糖耐受性提升；另一方面，如第6C至6D圖所示，HFD+8% CS-1、HFD+8% CS-2、HFD+8% CS-3組在施予監控胰島素(1U/kg)後，血液中葡萄糖的濃度下降，尤其是HFD+8% CS-1，說明中華被毛孢多醣體分餾液CS-1至CS-3(8%)可促進胰島素的敏感性。此外，中華被毛孢多醣體分餾液CS-4(8%)則不會造成顯著的葡萄糖耐受性與胰島素耐受性變化(如第6A至6D圖所示)。
各中華被毛孢多醣體分餾液之多醣體含量分別為：0.35g/100mL(CS-1)、0.53g/100mL(CS-2)、0.13g/100mL(CS-3)、0.69g/100mL(CS-4)。故，用以處理小鼠(平均體重為30g)之各中華被毛孢多醣體的劑量係分別為0.00035g/小鼠體重(CS-1)、0.00053g/小鼠體重(CS-2)、0.00013g/小鼠體重(CS-3)、0.00069g/小鼠體重(CS-4)。經由換算，可得用以處理人個體(體重為70kg)之各中華被毛孢多醣體的劑量係分別為0.82g/人個體體重 (CS-1)、1.24g/人個體體重(CS-2)、0.30g/人個體體重(CS-3)、1.61g/人個體體重(CS-4)，亦即用於人體之劑量分別為：0.012g/kg(CS-1)、0.018g/kg(CS-2)、0.0043g/kg(CS-3)、0.023g/kg(CS-4)。
本發明所提供之分離與純化的中華被毛孢多醣體可提升哺乳類動物葡萄糖耐受性與胰島素敏感性。因此，本發明之中華被毛孢多醣體係可作為一新的預防或治療人類第2型糖尿病與胰島素抗性的方法。鑑於市場上對糖尿病治療或預防產品之迫切的需求，本發明顯然具有產業上利用的價值，惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。

Claims (4)

  1. 一種中華被毛孢(Hirsutella sinensis)多醣體用於製備提升胰島素敏感性之藥物的用途，其中該中華被毛孢多醣體係為中華被毛孢菌絲體的水萃取物；且其中該中華被毛孢多醣體中岩藻醣：鼠李醣：阿拉伯醣：葡萄醣胺：半乳醣：葡萄醣：甘露醣：半乳醣胺的比例係為3~4：3~4：1~2：4~5：23~24：12~13：50~51：0.2~0.6。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該中華被毛孢多醣體之分子量範圍係介於15,776Da至1,231,969Da之間。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該中華被毛孢多醣體係降低一個體對胰島素之抵抗性。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該中華被毛孢多醣體之有效劑量係0.001mg/kg至1g/kg。
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