CN110988213B - 一种超声辅助提取、酸解灵芝多糖及单糖组成检测方法 - Google Patents

一种超声辅助提取、酸解灵芝多糖及单糖组成检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于多糖提取及检测技术领域，具体涉及一种超声辅助提取、酸解灵芝多糖及单糖组成检测方法。本发明提供了一种超声辅助提取、酸解灵芝多糖的方法，具有速度快、效率高等显著优势，结合UPLC‑CAD法可以实现灵芝多糖单糖组成的快速分析测定。对灵芝多糖酸解产物的单糖组成及含量进行分析比较，结果表明：灵芝多糖的完全水解产物中木糖的含量最高，其次为阿拉伯糖，而鼠李糖、半乳糖、岩藻糖含量接近，葡萄糖和甘露糖的含量较低，研究结果为评价灵芝药材质量及指导进一步开发利用提供了数据支持和技术参考。

Description

一种超声辅助提取、酸解灵芝多糖及单糖组成检测方法
技术领域
本发明属于多糖提取及单糖组成检测技术领域，具体涉及一种超声辅助提取和酸解灵芝多糖及通过超高液相色谱-电雾式检测器测定灵芝多糖中单糖组成的检测方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
灵芝多糖(Ganoderma Lucidum polysaccharides)是灵芝菌丝的次生代谢产物，是灵芝的主要功效成分，具有降血脂、降血糖、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗肿瘤、提高免疫力等作用。多糖是由单糖通过糖苷键结合而成，准确测定多糖的单糖组成以及各单糖的含量，对于多糖的质量控制具有重要意义。
水解是多糖组成测定的关键步骤，不同糖苷键对水解的敏感性不同，解聚单糖的难易程度也不同，多糖的水解效率将会直接影响其单糖组成测定的准确性。近年来，研究者们对多糖的降解方法进行了大量研究，主要包括酸水解、碱水解、酶解以及电磁辐射等。其中，酸水解法反应速率快，水解产物发生结构变化的机率较小，所以在多糖的单糖组成分析中应用较广。但同时也发现，传统的高温酸水解方式用于多糖的水解，时间长、能耗大、效率较低。超声提取技术是利用超声波产生的强烈的空化效应和机械振动加速药物有效成分进入溶剂，促进提取的进行，增加有效成分的溶出率，提高药材的利用率，节约能源并且避免了高温对提取成分的影响，具有省时、节能、提取率高等优点，已经广泛的应用于天然产物中有效成分的提取，但在多糖水解方面的应用鲜有报道。
超高效液相色谱技术(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)是近年来推出的一种采用亚2微米填料色谱柱的超高效液相色谱系统，具有高分离度、高效率、节省溶剂等优势。电喷雾式检测器(CAD)是近年来在市场上被逐步推广的一款高灵敏度、通用型检测器，其检测信号不依赖于被检测物质的化学结构，对不同结构的化合物有一致的响应，已逐渐用于糖类、脂质类、固醇类和皂苷类等样品的检测，可以耐受进行梯度洗脱溶剂，与蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector，ELSD)相比灵敏度较高。
发明内容
本发明提供了一种超声辅助酸解(Ultrasonic Assisted Acid Hydrolysis，UAH)-UPLC-CAD法测定灵芝多糖单糖组成的方法，并对6批赤芝多糖的单糖组成和含量进行测定，以期为药食两用真菌多糖的单糖组成研究提供方法和数据参考。
基于上述研究成果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种灵芝多糖提取方法，所述提取方法包括超声辅助提取获取提取液，通过加入醇溶液对提取液进行沉淀从而获取粗多糖，通过酸解粗多糖获得灵芝多糖中单糖的组成。
优选的，所述超声辅助提取的步骤如下：将灵芝子实体粉末置于去离子水中加热超声提取，离心获取上清部分即为提取液。
进一步优选的，所述灵芝为赤芝。
进一步优选的，所述粉末与去离子的加入比例为1.8～2.2g：28～32mL。
进一步优选的，所述加热温度为88～92℃。
进一步优选的，所述超声提取时间为28～32min。
进一步优选的，所述离心参数为4800～5200r/min，10min。
优选的，所述醇溶液为乙醇溶液，具体的，为93～97％乙醇(v/v)；使提取液中乙醇浓度为80％。
优选的，向提取液中加入醇液后将提取液置于3～5℃静置10～14h后离心，获取沉淀物，即为粗多糖。
进一步优选的，将所述沉淀物置于水浴锅中干燥，之后采用热水复溶，离心后定容。
优选的，所述酸解采用三氟乙酸(TFA)溶液进行处理。
优选的，所述酸解粗多糖的方法如下：向粗多糖溶液中加入三氟乙酸溶液置于超声中在65～75℃下酸解0.8～1.2h。
进一步优选的，所述酸解产物采用甲醇洗涤、氮气吹干。
本发明第二方面，提供一种灵芝多糖的检测方法，所述检测方法包括超高液相色谱(UPLC)及电雾式检测器(CAD)对多糖中的单糖进行检测，所述超高效液相采用Amide色谱柱。
优选的，所述流动相：流动相A-0.8％甲酸水溶液，流动相B-乙腈。
优选的，所述超高液相色谱采用梯度洗脱，梯度洗脱方式如下：0～6min，85％B；6～8min，85％B～72％B；8～12min，72％B；12～15min，72％B～50％B。
优选的，所述流速为0.3～0.5mL·min-1。
优选的，所述CAD检测参数如下：气体源为N2，压力61.2Psi，Filter 5.0sec，雾化器温度35℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的超声辅助酸解方法具有简便、高效的特点，相比现有技术中将灵芝发酵后分离发酵物的方法更加简便易行；另外，本发明研究表明，三氟乙酸用于灵芝多糖的水解效果更为彻底，能够将七种单糖成分尽数检出，且易于除去，用于灵芝多糖提取具有良好的技术效果。
本发明还提供了一种超高液相色谱分离检测多糖单体的方法，对于上述七种单体成分具有良好的检测效果，定量限最低达到0.02μg/mL。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中酸种类(A)及浓度(B)对水解程度的影响柱状图；
图2为实施例1中超声功率(A)、温度(B)和时间(C)对水解程度的影响柱状图；
图3为对照品(A)和样品(B)的UPLC-CAD色谱图；
其中，1,2为鼠李糖，3,5为岩藻糖，4,6为木糖，7为阿拉伯糖，8为甘露糖，9,11为葡萄糖，10,12为半乳糖。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种超声辅助酸解灵芝多糖及超高液相色谱-电雾式检测器测定灵芝多糖的方法。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
1材料与方法
1.1材料
对照品D-(+)-葡萄糖(LOT：S08J6G1)、L-鼠李糖(LOT：SJ0715GA13)、D-半乳糖(LOT：AJ0603LA14)、D-甘露糖(LOT：A16O6L4546)、D-阿拉伯糖(LOT：AJ0702FA14)、D-(+)-木糖(LOT：B02M6W1)、L-(+)-岩藻糖(LOT：TM0312QB14)，纯度均大于98％，购于上海源叶生物科技有限公司。95％乙醇(山东禹王实业有限公司化工分公司，分析纯)、乙腈(瑞典Oceanpak，色谱纯)、氢氟酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色谱纯)、三氟乙酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)、浓盐酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、甲酸铵(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)，其余试剂均为分析纯，实验用水为娃哈哈纯净水。干燥的样品子实体均购于济南市药王楼，由山东省分析测试中心王晓研究员鉴定为赤芝(Ganoderma lucidum)，产地来源为安徽。
1.2仪器与设备
赛默飞Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国，Thermo Fisher)；万分之一电子分析天平(德国Sartourius)；SBL-10DT型恒温超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；TG16-WS台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；色谱柱：WatersACQUITY UPLC Amide柱(3.0×100mm，1.7μm)、Waters Xbridge HILIC(2.1×150mm，2.5μm)、MERCK ZIC-HILIC(2.1×150mm，2.5μm)。
1.3粗多糖的提取
将收集的灵芝子实体样品置于真空干燥箱中60℃烘干后切片，粉碎，过40目筛。准确称取2.0g干燥的样品粉末置于锥形瓶中，加入30.0mL去离子水，在90℃热水中超声提取30min，后冷却15min，再将提取液离心(5000r/min，10min)，上清液抽滤，后定容至30.0mL。向其中加入95％乙醇(v/v)，使乙醇的最终浓度为80％(v/v)，用于沉淀粗多糖。4℃醇沉12h后离心(5000r/min，15min)。沉淀物于80℃水浴锅中干燥，并用5.0mL热水(80℃)复溶，再次离心(5000r/min，15min)，最终用水定容至5.0mL。
1.4多糖的完全水解
700μL的粗多糖溶液用4.0mol·L-1的三氟乙酸(TFA)溶液进行处理，总体积为1400μL。置于恒温超声波清洗机(功率270W)中，在70℃下酸解1h。水解产物用甲醇洗涤并用氮气吹干，以除去TFA残留。
1.5标准品溶液的配制
分别精密称取鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖对照品各1.0mg，置于1mL容量瓶中，用乙腈-水(v:v＝3:1)溶液定容至刻度，配制成质量浓度为1.0mg·mL-1的标准品溶液，备用。
1.6样品溶液的配制
将吹干的样品用乙腈-水(v:v＝3:1)溶液定容至1.0mL，经0.22μm微孔膜过滤，制成样品溶液，备用。
1.7检测色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC Amide柱(3.0×100mm，1.7μm)，流动相A为0.8％甲酸水溶液，B为乙腈溶液。洗脱梯度：0～6min，85％B；6～8min，85％B～72％B；8～12min，72％B；12～15min，72％B～50％B。流速：0.4mL·min-1；进样量：10μL；柱温：25℃。CAD检测参数：气体源为N2，压力61.2Psi，Filter 5.0sec，雾化器温度35℃。
2结果与分析
2.1灵芝多糖酸解条件的优化
2.1.1酸种类的影响
常用于多糖水解的酸有盐酸(HCL)、三氟乙酸(TFA)和氢氟酸(HF)，其中，TFA因其易于除去的优点而被广泛采用。从图1(A)可以看出，采用盐酸和氢氟酸用于灵芝多糖水解时，均有部分单糖未检出。而在三氟乙酸作用下，水解产物中7种单糖均可检出。因此，本实验选TFA用于灵芝多糖的水解。
2.1.2酸浓度的影响
如图1(B)所示，随着TFA浓度的增加，各特征峰峰面积呈现先升高后下降的趋势，当浓度为4mol·L-1时，水解程度达到最大值。这可能是由于酸浓度低时，水解程度较低，大部分以多糖的形式存在；而酸浓度过高时，单糖易转化成糠醛及其衍生物。因此，选定TFA的浓度为4mol·L-1。
2.1.3超声功率的影响
如图2(A)所示，超声功率在150W～270W范围内，灵芝多糖水解程度随着超声功率的增加而快速增加。当功率超过270W后，水解程度随功率增加而呈现降低趋势，这可能是因为较高的超声功率会产生较强的空化和剪切效应，使得单糖发生转化或分解，降低了单糖的含量。所以，最终选择灵芝多糖的超声功率为270W。
2.1.4水解温度的影响
如图2(B)所示，灵芝多糖水解程度随着温度的变化而发生明显改变。在30℃和50℃时，由于温度过低，水解程度较低；当温度升高到70℃时，水解程度大幅度增加，各特征峰峰面积均出现明显增加；当温度继续升高，部分单糖发生转化，峰面积降低。因此，选择70℃作为灵芝多糖的水解温度。
2.1.5水解时间的影响
如图2(C)所示，当水解时间为0.5h时，灵芝多糖水解不够充分，大部分以多糖形式存在，单糖含量较低；当水解时间增加到1h时，多糖和寡糖开始水解，单糖含量明显现增加；水解时间继续增加，单糖含量整体没有明显变化。因此，选择灵芝多糖的水解时间为1h。
2.2色谱条件优化
为了获得较短的分离时间和最佳的色谱分离效果，对色谱柱类型、流动相组成、柱温等色谱条件进行了考察。
在相同的梯度和流动相条件下，考察了Waters ACQUITY UPLC Amide柱(3.0×100mm，1.7μm)、Waters Xbridge HILIC(2.1×150mm，2.5μm)、MERCK ZIC-HILIC(2.1×150mm，2.5μm)三种色谱柱，最终选择Waters ACQUITY UPLC Amide柱(3.0×100mm，1.7μm)柱作为灵芝多糖单糖组成的分析柱。根据7种单糖的分离效果和保留时间，确定乙腈-水(0.8％甲酸)的溶剂体系。糖类为多羟基物质，升高色谱柱温度可以明显改善单糖的峰型，但温度过高又会使得糖类物质发生改性，因此选择柱温为25℃。在优化的色谱条件下，对照品及样品的UPLC-CAD色谱图见图3。从图中可知，有12个色谱峰被确认为糖类物质。
2.3方法学考察
2.3.1线性范围考察
分别吸取“1.5”中配好的7种标准品溶液(鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖各10.0μL，阿拉伯糖20.0μL，木糖30.0μL)至容量瓶中，充分混匀后稀释至不同浓度，按“1.7”项下色谱条件进样分析。以峰面积的对数为纵坐标(Y)，以各对照品质量浓度的对数为横坐标(X)，绘制标准曲线，结果见表1。由表1可知，各单糖的线性关系良好。
表1线性关系考察
Figure BDA0002339510930000071
2.3.2仪器精密度试验
取同一供试品溶液，按“1.7”项下色谱条件连续进样6次，测得7个单糖峰的保留时间RSD分别为0.58％(0.27％)、0.55％(0.55％)、0.80％(0.51％)、0.74％、0.30％、0.62％(0.85％)、0.48％(0.21％)，均小于1％；峰面积RSD分别为2.93％(1.31％)、2.62％(1.02％)、1.96％(0.59％)、4.28％、1.29％、2.99％(2.30％)、1.15％(2.21％)，均小于5％。结果表明仪器精密度良好。
2.3.3日间精密度试验
每日取同一批次粗多糖样品按“1.6”项下方法制成供试品溶液，按“1.7”项下色谱条件进样2次，连续测定3天，测得7个单糖峰的保留时间RSD分别为0.85％(0.35％)、0.65％(0.31％)、0.08％(0.32％)、0.13％、0.35％、0.46％(0.54％)、0.47％(0.17％)，均小于1％；峰面积RSD分别为1.00％(0.08％)、1.05％(0.82％)、0.97％(0.69％)、0.35％、0.94％、1.11％(0.16％)、0.95％(1.64％)，均小于5％。结果表明日间精密度良好。
2.3.4重复性试验
取同一批次粗多糖样品，按“1.6”项下方法制成6份供试品溶液，按“1.7”项下色谱条件进行测定，测得7个单糖峰的保留时间RSD分别为0.60％(0.22％)、0.40％(0.50％)、0.23％(0.16％)、0.15％、0.39％、0.25％(0.46％)、0.23％(0.14％)，均小于1％；峰面积RSD分别为3.53％(2.90％)、1.95％(1.56％)、1.18％(2.01％)、3.54％、1.74％、2.43％(1.20％)、1.00％(1.83％)，均小于5％。结果表明方法重复性良好。
2.3.5稳定性试验
取同一供试品溶液分别于0、3、6、12、18、24h按“1.7”项下色谱条件进样分析，测得7个单糖峰的保留时间RSD分别为0.71％(0.24％)、0.40％(0.69％)、0.62％(0.46％)、0.26％、0.80％、0.31％(0.54％)、0.55％(0.21％)，均小于1％；峰面积RSD分别为3.50％(2.63％)、2.68％(2.05％)、2.08％(2.15％)、3.92％、3.48％、1.98％(4.10％)、1.99％(1.81％)，均小于5％。表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.3.6加样回收率试验
精密称取已知含量的同一批次粗多糖样品6份，分别精密加入不同量的鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖对照品适量，使得样品中所含各单糖量与加入的单糖对照品量之比约为1:1，按“1.4”项下方法进行水解，并按“1.6”项下方法制成供试品溶液后按“1.7”项下色谱条件进行分析检测，计算加样回收率，结果见表2。
表2加样回收率试验(n＝6)
Figure BDA0002339510930000081
Figure BDA0002339510930000091
2.4样品测定
提取的灵芝粗多糖样品经“1.4”项下方法水解后，按“1.6”项下方法制成供试品溶液，根据“1.7”项下色谱条件分别测定6批次样品中7种单糖成分的含量。含量测定结果见表3。
表3粗多糖水解后单糖含量(mg/g)测定结果
Figure BDA0002339510930000101
2.5灵芝多糖的单糖组成分析
多糖是由10个以上的单糖基和糖苷键连接而成的天然生物大分子，其单糖组成分析是基础性和关键性的环节，水解后的单糖组成复杂且含量差异较大。采用本实验方法对灵芝多糖进行完全水解，其水解后的产物由7种单糖共同组成，其含量分别为：鼠李糖2.42mg/g、岩藻糖2.19mg/g、木糖27.25mg/g、阿拉伯糖11.99mg/g、甘露糖0.45mg/g、葡萄糖0.85mg/g和半乳糖2.36mg/g，含量大小依次为：木糖>阿拉伯糖>鼠李糖>半乳糖>岩藻糖>葡萄糖>甘露糖。摩尔比为：鼠李糖：岩藻糖：木糖：阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝5.90：5.34：72.64：31.96：1.00：1.89：5.24。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种灵芝多糖的检测方法，其特征在于，包括灵芝多糖的提取，提取方法包括超声辅助提取获取提取液，通过加入醇溶液对提取液进行沉淀从而获取粗多糖，通过超声辅助酸解灵芝多糖获得灵芝多糖的单糖组成；所述灵芝多糖的单糖组成包括鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖；
所述超声辅助提取的步骤如下：将灵芝子实体粉末置于去离子水中加热超声提取，离心获取上清部分即为提取液；
所述酸解采用三氟乙酸溶液进行处理；
所述检测方法包括超高效液相色谱UPLC及电雾式检测器CAD对多糖中的单糖进行检测，所述超高效液相色谱采用Amide色谱柱，色谱柱的规格为3.0×100 mm，1.7 μm；流动相：流动相A-0.8%甲酸水溶液，流动相B-乙腈；
所述超高效液相色谱采用梯度洗脱，梯度洗脱方式如下：0～6 min，85% B；6～8 min，85% B～72% B；8～12 min，72% B；12～15 min，72% B～50% B。
2.如权利要求1所述灵芝多糖的检测方法，其特征在于，所述粉末与去离子水的加入比例为1.8~2.2g：28~32mL。
3.如权利要求1所述灵芝多糖的检测方法，其特征在于，所述加热温度为88~92℃；所述超声提取时间为28~32min；所述离心参数为4800~5200 r/min，10min。
4.如权利要求1所述灵芝多糖的检测方法，其特征在于，所述醇溶液为93%~97% v/v的乙醇溶液；使提取液中乙醇浓度为80%。
5.如权利要求1所述灵芝多糖的检测方法，其特征在于，向提取液中加入醇液后将提取液置于3~5℃静置10~14h后离心，获取沉淀物，即为粗多糖。
6.如权利要求5所述灵芝多糖的检测方法，其特征在于，将所述沉淀物置于水浴锅中干燥，之后采用热水复溶，离心后定容。
7.如权利要求1所述灵芝多糖的检测方法，其特征在于，所述酸解粗多糖的方法如下：向粗多糖溶液中加入三氟乙酸溶液置于超声中在65~75℃下酸解0.8~1.2 h。
8.如权利要求7所述灵芝多糖的检测方法，其特征在于，所述酸解产物采用甲醇洗涤、氮气吹干。
9.如权利要求1所述灵芝多糖的检测方法，其特征在于，所述CAD检测参数如下：气体源为N2，压力61.2Psi，Filter5.0sec，雾化器温度35℃。
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