TWI543765B - 靈芝多醣體作為抑制肥胖之用途及其製備方法 - Google Patents

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Description

靈芝多醣體作為抑制肥胖之用途及其製備方法
本發明提供一種靈芝多醣體之用途，特別係一種靈芝多醣體作為抑制肥胖之用途。
長期以來，肥胖被定義為與大多數的健康問題以及與減少壽命有關的疾病病症。越來越多臨床數據顯示，肥胖與慢性發炎症狀密切相關，且會導致胰島素抗性、第二型糖尿病、脂肪肝、心血管疾病、阻塞性呼吸暫停以及癌症。然而，肥胖的發生機率很高，目前已經成為威脅大眾健康的主要病症之一，全球約有5億的肥胖者及14億的超重者。因此，預防肥胖已成為現今社會大眾的一大挑戰。
對於肥胖及與其相關的代謝異常，目前使用了包括有抗生素與益菌素用於其治療。對缺乏瘦素基因的小鼠(ob/ob)或以高脂飼料餵養的小鼠給予抗生素治療，可以改變腸道菌群、降低血液內毒素血症以及改善葡萄糖耐受性。此外，由於益菌素屬於不可消化但可被微生物利用之寡醣、多醣與膳食纖維，因此可藉由其促進腸道中特定有益細菌之生長，達成減少體重及發揮抗發炎之效果。益菌素不僅改變腸道菌群還能改善腸道緊密連接完整性，並降低脂多醣(lipopolysaccharides,LPS)引起的血液內毒素血症。
然而，基於人類肥胖發生率有越來越高的趨勢，以及肥胖在治療及預防上的困難，有需要以替代方法來預防、治療或控制此病症。新的方法可引入至飲食中，不需要在生活方式有太大的改變且不會引起毒素或對健康有不良的影響。
有鑑於此，本發明之一目的係提供一種靈芝多醣體作為抑制肥胖之用途，其中該靈芝多醣體之分子量係大於135kDa；且其中該靈芝多醣體至少包含甘露醣(mannose)、葡萄醣(glucose)及半乳醣(galactose)。
在本發明之一實施例中，其中該靈芝多醣體進一步包含岩藻醣(fucose)、鼠李醣(rhamnose)、阿拉伯醣(arabinose)及葡萄醣胺(glucosamine)。
在本發明之一實施例中，其中該靈芝多醣體中岩藻醣、鼠李醣、阿拉伯醣、葡萄醣胺、半乳醣、葡萄醣以及甘露醣的比例係為2：2：2：1：16：26：47至3：3：3：1：17：27：48。
在本發明之一實施例中，其中該靈芝多醣體之重量平均分子量係為846kDa，以及範圍係介於135kDa至5,364kDa之間，分子量分部指數(Mw/Mn)係為6.25。
在本發明之一實施例中，其中該靈芝多醣體的有效劑量為0.001至1,000mg/kg。
本發明之另一目的係提供一種所述之靈芝多醣體之製備方法，包含：係由一靈芝菌絲以水萃取，並續以一醇類沉澱，再經離心分離與濾膜過濾而得，其中(a)將一靈芝菌絲與水混合並以低轉速萃取一預定時間，取上清液並將該上清液濃縮，以獲得一靈芝水萃取濃縮物；(b)將該靈芝水萃取濃縮物加入一醇類靜置一段時間以沉澱出一靈芝多醣體粗萃取 物；以及(c)將該靈芝多醣體粗萃取物離心後獲得一沈澱物；以切向流過濾系統(tangential flow filtration,TFF)過濾該沈澱物，以獲得一靈芝多醣體。
在本發明之一實施例中，其中該步驟(a)進一步包含將該萃取液進行一高溫萃取步驟，該高溫萃取步驟係於高溫攪拌式反應器萃取一預定時間，且該萃取上清液係以蒸發方式濃縮，以及該萃取液靈芝菌絲與水混合的比值為5.0%(w/v)。
在本發明之一實施例中，其中步驟(b)該醇類係為95%酒精，且該靈芝萃取濃縮液之濃度比值為20%(w/v)，且該20%(w/v)濃度比值的靈芝萃取濃縮液與95%酒精混合的比例為1：5，使該混合液最終酒精濃度比值為80%，以及該一段混合靜置時間係至少十六小時。
在本發明之一實施例中，其中步驟(c)切向流過濾系統由0.2μm中空纖維膜過濾及300kDa超限濾膜(50cm2)TFF之組合進行劃分過濾。
給予一個體本發明之靈芝多醣體可減少體重、附睪脂肪及皮下脂肪的蓄積；亦能達到預防、治療肥胖及抑制脂肪堆積之功效。因此，本發明之靈芝多醣體為一種預防、治療肥胖的新策略。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，以下所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第一圖係為本發明之靈芝多醣體的萃取流程圖。
第二圖係為本發明利用高效能陰離子交換色層分析儀裝配脈衝式安培檢測器(high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD)分析靈芝多醣體分餾液(G1)中的單醣組成。
第三圖係為本發明之靈芝多醣體分餾液(G1)的凝膠滲透圖譜(gel permeation chromatogram)。
第四圖係為本發明之靈芝多醣體分餾液(G1)的分子量取對數(Log molecular weight)對重量分部/微分分子量取對數(weight fraction/dLogMW)的曲線圖。
第五圖係為本發明之靈芝多醣體分餾液(G1)的分子量取對數(Log molecular weight)對累積重量分部(cumulative weight fraction)的曲線圖。
第六圖A至D係為本發明之靈芝多醣體對高脂飲食誘導成肥胖小鼠(high-fat diet，HFD)在減輕體重及減少脂肪堆積的數據圖；A為體重、B為體重增加、C為附睪脂肪(epididymal fat)及D為皮下脂肪(subcutaneous fat)。在數值統計分析應用上使用Student’s t test(**P<0.01,***P<0.001)。
定義
本文所述之有效劑量表示能減少動物及人類體重及脂肪堆積的靈芝多醣體劑量，適當的有效劑量可依治療生物體或個體的不同而有不同，但可以劑量遞增的各種實驗技術決定有效劑量。
如於本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
本發明提供一種有效減少動物及人類體重及脂肪堆積的靈芝多醣體，經由實驗顯示本發明之靈芝多糖體能有效減少小鼠體重及脂肪堆積。一般而言，每日給予哺乳動物或人類本發明之多醣體0.001至1,000mg/kg劑量可有效減少體重及脂肪堆積，詳細說明如下。
實施例1 本發明之靈芝多醣體的製備方法
本發明之靈芝多醣體具有大於135kDa之分子量能有效用於預防、治療肥胖、減少脂肪蓄積以及體重管理。本發明之靈芝多醣體可引入至飲食中，其可為一飲品、日常補充品或食物，不需要在生活方式有太大的改變，且不會引起毒素或對健康有不良的影響。
1.1本發明之靈芝萃取濃縮液的製備
如第一圖所示，首先，由長庚生物科技股份有限公司(臺北，臺灣)取得之乾燥液態發酵的靈芝菌絲(500g)混合10L蒸餾水形成混合液(50g/L)，其中固體與液體比值為5.0%(w/v)，以20公升攪拌式反應器、121℃高溫以及150RPM轉速(revolution per minute)條件下萃取三十分鐘。接著，離心該萃取後混合液以去除固體物質以獲得一靈芝水萃取物，並以蒸發方式濃縮該靈芝水萃取物至2.5公升，並分裝至20ml暗色玻璃安瓶，接著經高壓高溫滅菌處理二十分鐘，以獲得一固體與液體比值為20.0%(w/v)的一靈芝水萃取濃縮物，保存於4℃備用。
1.2本發明之靈芝多醣體粗萃取物的製備
如第一圖所示，取120ml、20.0%(w/v)的靈芝水萃取濃縮物(代號為W1，含有總水溶性碳水化合物6.03g；詳見表一)，加入600ml(五倍靈芝水萃取濃縮物體積)、95%酒精混合均勻，在4℃靜置十六小時以沉澱出靈芝多醣體酒精粗萃取物，接著續以離心去除上清液，並以120ml、70%冰酒精清洗及離心沈澱靈芝多醣體酒精粗萃取物三次，將三次的上清液混合為酒精沈澱上清液，體積為1,050ml(代號為G4，含有總水溶性碳水化合物2.82g；詳見表一)。取1,000ml蒸餾水復溶酒精沈澱靈芝多醣體粗萃取物，再經濃縮至700ml以去除殘留酒精，接著加入蒸餾水定量此靈芝多醣體粗萃取物至2,400ml(代號為W2，含有總水溶性粗多醣3.21g；詳見表 一與表二)。
1.3本發明之靈芝多醣體粗萃取物的分離純化
取2,400ml靈芝多醣體粗萃取物至50℃水浴槽，接著以切向流超限過濾系統TFF(Spectrum公司，KrosFlo型號)組合0.2μm中空纖維膜(1,500cm2，polyethersulfone)並將過膜壓力(transmembrane pressure，TMP)控制在15至16psi進行劃分過濾。當回流液體積剩餘800至1000ml時補入蒸餾水600ml，繼續操作過濾。重複操作補入蒸餾水600ml三次，共計補入蒸餾水1,800ml。得到650ml的G1-1分餾液(總水溶性粗多醣1.26g)及3,600ml過濾液。
取前步驟3,600ml、0.2μm中空纖維膜過濾液至50℃水浴槽，接著以切向流過濾系統組合300kDa超限濾膜(50cm2)進行劃分過濾，將過膜壓力控制在16至18psi。當回流液體積剩餘1,000至1,200ml時補入蒸餾水600ml，繼續操作過濾。得到950ml的G1-2分餾液(總水溶性粗多醣0.60g)以及3,600ml過濾液。合併G1-1分餾液與G1-2分餾液得到1,600ml的G1分餾液(代號為G1，總水溶性粗多醣1.86g；詳見表二)。
另取前步驟3,600ml過濾液至50℃水浴槽，接著以切向流過濾系統組合10kDa超限濾膜(50cm2)進行劃分過濾，將過膜壓力控制在16至18psi。當回流液體積剩餘1,000至1,200ml時補入蒸餾水600ml，繼續操作過濾。得到970ml的10kDa至300kDa的G2分餾液(總水溶性粗多醣1.01g；詳見表二)，3,600ml的10kDa過濾液，該10kDa過濾液即為小於10kDa的G3分餾液(總水溶性粗多醣0.34g；詳見表二)。
將劃分收集到的四個G1-G4分餾液，進行濃縮至少量體積並復溶蒸餾水至體積110ml。每一分餾液分裝至五瓶20ml暗色玻璃安瓶，接著經高壓高溫中滅菌斧滅菌二十分鐘，保存於4℃備用。
1.4本發明之靈芝多醣體的總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多醣含量分析
本發明利用酚-硫酸法分析20.0%(w/v)的靈芝水萃取濃縮物(代號為W1,120ml)、靈芝多醣體粗萃取物(代號為W2,2,400ml)、G1分餾液(1,600ml)、G2分餾液(970ml)、G3分餾液(3,600ml)與G4分餾液(1,050ml)的總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多醣含量。配製0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16、0.18與0.20mg/ml之葡萄醣標準溶液。每一濃度的葡萄醣標準溶液分別取200μl至1.5ml微量離心管，再加入200μl 5%苯酚並均勻混合。接著加入1ml硫酸並均勻混合。待靜置二十分鐘，以分光光度計(spectrophotometer)在波長490nm下測定其讀值，並以此讀值建立檢量線，檢量線之R2>0.99。待測樣品經適當稀釋後，取200μl至1.5ml微量離心管，再加入200μl 5%苯酚均勻混合均勻。接著加入1ml硫酸均勻混合。待靜置二十分鐘，以分光光度計在波長490nm下測定其讀值，將讀值帶入檢量線可以計算獲得總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多醣的濃度。
靈芝多醣體粗萃取物的總水溶性碳水化合物與總水溶性粗多醣含量分析結果如表一及表二所示，其中在表二的20%(w/v)靈芝萃取濃縮液的總水溶性粗多醣含量分布分析中，靈芝多醣體粗萃取物(W2)的總水溶性粗多醣中含有1.86克截留分子量大於300kDa的本發明之靈芝多醣體(G1)，其佔總靈芝多醣體萃取物(W2)的57.9%。
1.5本發明之靈芝多醣體的單醣組成分析
本發明使用高效能陰離子交換色層分析儀裝配脈衝式安培檢測器(HPAEC-PAD；廠牌：Thermo Scientific；型號：Dionex ICS-5000 System)分析各靈芝萃取物中的單醣組成。岩藻醣(L-fucose)、鼠李醣(L-rhamnose)、半乳醣胺(D-galactosamine)、阿拉伯醣(D-arabinose)、葡萄醣胺(D-glucosamine)、半乳醣(D-galactose)、葡萄醣(D-glucose)與甘露醣(D-mannose)之標準混合溶液濃度為0.1、0.5、1.0、2.0與5.0mg/L。分析條件在注射體積為25μl、分析管柱為CarboPac PA1(4×250mm)、移動相為純水(92%)與200mM氫氧化鈉水溶液(8%)經混合後組成比例為16mM氫氧化 鈉水溶液、流速為1.0ml/min以及管柱烘箱溫度為30℃。注射入單醣標準品，經過三十分鐘之分析時間，可獲得單醣標準品在0.1、0.5、1.0、2.0與5.0mg/L的峰形積分面積，以此積分面積建立各別單醣之檢量線，檢量線之R2>0.99。
取0.21ml的分餾液(G1)(總水溶性粗多醣3mg)加入2.79ml蒸餾水以及1.33ml三氟醋酸(trifluoroacetic acid)，在112℃下加熱十二小時進行酸水解。接著將此混合物濃縮並反覆復溶蒸餾水以除酸，最後復溶蒸餾水至1mg/ml。此水解產物經稀釋4倍(0.25mg/ml)後取25μl，利用高效能陰離子交換色層分析儀搭配脈衝式安培檢測器與分析管柱分析，移動相為純水(92%)與200mM氫氧化鈉水溶液(8%)經混合後組成比例為16mM氫氧化鈉水溶液、流速為1.0ml/min以及管柱烘箱溫度為30℃。經過三十分鐘之分析時間，將樣品分析所得峰形之滯留時間與積分面積與8個標準品相比對，可經由標準品檢量線計算出分餾液(G1)的各別單醣濃度，進而獲得單醣組成的百分比。分餾液(G1)經高效能陰離子交換色層分析儀搭配脈衝式安培檢測器分析單醣組成比例，岩藻醣佔2.8%、鼠李醣佔2.5%、阿拉伯醣佔2.9%、葡萄醣胺佔1.1%、半乳醣佔16.9%、葡萄醣佔26.3%以及甘露醣佔47.5%(詳見第二圖、表3與表4)。
1.6本發明之靈芝多醣體的分子量分佈的分析
本發明使用分子篩滲透層析法(size-exclusion chromatography,SEC)搭配折射(refractive index,RI)、微差黏度(differential viscosity,DV)以及光散射(light scattering,LS)三合一偵測器之高效液相色谱 分析儀(high performance liquid chromatography，配有Waters 2410折射率檢測器index detector，Viscotek 270雙檢測器)分析分餾液(G1)中的多醣分子量分佈。製備分子量濃度1.5mg/ml的標準品葡聚醣(Dextran 670)進行系統校正。分析條件為注射體積100μl、分析管柱為串接2組GPC管柱TSKgel G5000PW×L(7.8×300mm)與TSKgel G6000PW×L(7.8×300mm)、移動相為純水添加0.02% NaNO3、流速為0.8ml/min以及管柱分析溫度為22℃。
取分餾液(G1)(總水溶性粗多醣7.5mg/ml)以上述條件以OmniSEC軟體(Viscotek公司，美國)進行分析，其計算方式如下表示：Mn：數目平均分子量
Mw：重量平均分子量
Mz：較高平均分子量
Mp：最高波鋒分子量，為分子量分布最高重量分布點的分子量
Mi：單鏈分子量(molecular weight of a chain)
Ni：單鏈的數目(number of chains of that molecular weight)
將分餾液(G1)分析所得之RI-DV-LS數據(第三圖)經OmniSEC軟體進行分析計算之後，所得多醣體分子量分佈圖如第四圖所示，其中Mn(數目平均分子量)為135,395Da、Mw(重量平均分子量)為846,622Da、Mz(z-平均分子量)為5,364,000Da，與峰值分子量Mp(最高波鋒分子量)為309,436Da。多醣體分子重量累積圖(第五圖)，Mn與Mw之累 積重量分部(cumulative weight fraction)為0.79與0.18，換算多醣體分子量介於Mn 135,395Da至Mw 846,622Da之間約占總多醣重量之61%。
因此，本發明之分餾液(G1)雖為截留分子量300kDa超限濾膜所截留，但是由於多糖類的生物高分子特性在一般的情況下會產生團聚現象，因此多醣實際分子量會有小於濾膜截留分子量現象，如第四圖所示G1分子量分布，證實本發明之分餾液(G1)之分子量係大於135kDa的靈芝多醣體。
實施例2 本發明之靈芝多醣體對高脂飲食誘導成肥胖小鼠(High-Fat Diet，HFD)在減輕體重及減少脂肪堆積之功效
本發明以標準飼料飼養(來自脂肪能量13.5%)的C57BL/6NCrlBltw作為對照組(Chow)，以及高脂飲食誘導(來自脂肪能量60%)成肥胖小鼠作為實驗組(HFD)，每個實驗組再分為每日灌胃給予0.001至1,000mg/kg的G1分餾液、G2分餾液、G3分餾液、G4分餾液或蒸餾水之小組並持續兩個月(每小組n=5)，分別為HFD+G1、HFD+G2、HFD+G3、HFD+G4、HFD、Chow+G1、Chow+G2、Chow+G3、Chow+G4及Chow小組。
如第六圖A至D顯示靈芝多醣對高脂飲食誘導成肥胖小鼠(HFD)在減輕體重及減少脂肪堆積之功效。在體重方面如第六圖A所示，相較於其他HFD組，HFD+G1體重較輕，顯示出不同分子量的靈芝多醣體對減輕體重的效果不同；且大於135kDa分子量靈芝多醣體體重減輕效果最佳。在減少體重增加方面如第六圖B所示，HFD+G1比其他HFD組減少體重增加效果最佳，顯示出不同分子量的靈芝多醣體對減少體重增加的效果不同，且以大於135kDa分子量減少體重增加效果最佳。在附睪脂肪(epididymal fat)方面如第六圖C所示，HFD+G1比其他HFD組附睪脂肪少， 顯示出不同分子量的靈芝多醣體對附睪脂肪減少的效果不同，且以135kDa分子量靈芝多醣體附睪脂肪減少最多，以小於10kDa分子量靈芝多醣體附睪脂肪減少最少。在皮下脂肪(subcutaneous fat)方面如第六圖D所示，HFD+G1比其他HFD組皮下脂肪少，顯示出不同分子量的靈芝多醣體對皮下脂肪減少的效果不同，且以135kDa分子量靈芝多醣體皮下脂肪減少最多，以小於10kDa分子量靈芝多醣體皮下脂肪減少最少。因此，本發明之大於135kDa分子量靈芝多醣體具有良好的減輕體重、減少體重增加以及減少脂肪推積的效果。
本發明提供一種靈芝多醣體作為抑制肥胖之用途及其製備方法，經由本發明之特殊製備方法所萃取的靈芝多醣體能有效降低哺乳動物體重及脂肪堆積。因此，本發明對於體重管理及減少體脂肪堆積提供一種新策略，該策略可有效應用於商業上體重控制及管理需求之目標族群，達到增進人類健康福祉之目的。

Claims (11)

  1. 一種靈芝多醣體用於製備抑制肥胖之藥物的用途，其中該靈芝多醣體係由以下步驟製得係利用以下步驟製得：(a)將一靈芝菌絲與水以5.0%比值(w/v)混合並以一高溫低轉速萃取一預定時間，取上清液並將該上清液以蒸發方式濃縮，以獲得一靈芝水萃取濃縮物；(b)將20%(w/v)靈芝水萃取濃縮物與95%酒精以1：5的混合比例混合，並於一低溫靜置至少十六小時沉澱出一靈芝多醣體粗萃取物；以及(c)將該靈芝多醣體粗萃取物離心、濃縮以及定量後獲得一純化後的靈芝多醣體粗萃取物；以及(d)將該純化後的靈芝多醣體粗萃取物以切向流過濾系統TFF分別組合0.2μm中空纖維膜過濾及300kDa超限濾膜進行劃分過濾，以獲得一靈芝多醣體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該靈芝多醣體至少包含甘露醣(mannose)、葡萄醣(glucose)及半乳醣(galactose)。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該靈芝多醣體進一步包含岩藻醣(fucose)、鼠李醣(rhamnose)、阿拉伯醣(arabinose)及葡萄醣胺(glucosamine)。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該靈芝多醣體中岩藻醣、鼠李醣、阿拉伯醣、葡萄醣胺、半乳醣、葡萄醣以及甘露醣的比例係為2：2：2：1：16：26：47至3：3：3：1：17：27：48。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該靈芝多醣體的有效劑量為0.001至1,000mg/kg。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該靈芝多醣體之重量平均分子量係為846kDa，以及範圍係介於135kDa至5,364kDa之間，分子量分布指數(Mw/Mn)係為6.25。
  7. 一種如申請專利範圍第1項所述之靈芝多醣體之製備方法，包含：係由一靈芝菌絲以水萃取，並續以一醇類沉澱，再經離心分離與濾膜過濾而得，其中(a)將一靈芝菌絲與水以5.0%比值(w/v)混合並以低轉速萃取一預定時間，取上清液並將該上清液濃縮，以獲得一靈芝水萃取濃縮物；(b)將20%(w/v)該靈芝水萃取濃縮物加入一95%酒精以1：5的混合比例混合，靜置一段時間以沉澱出一靈芝多醣體粗萃取物；以及(c)將該靈芝多醣體粗萃取物離心後獲得一沈澱物；以切向流過濾系統(TFF)分別組合0.2μm中空纖維膜過濾及300kDa超限濾膜進行劃分過濾該沈澱物，以獲得一靈芝多醣體。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之製備方法，其中該步驟(a)進一步包含將該上清液進行一高溫萃取處理步驟。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之製備方法，其中該高溫萃取處理步驟係於高溫攪拌式反應器萃取一預定時間。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之製備方法，其中該步驟(a)該上清液係以蒸發方式濃縮。
  11. 如申請專利範圍第7項所述之製備方法，其中步驟(b)該一段時間係至少 十六小時。
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