CN118160927A - 天然多糖在制备预防高血糖和高血脂保健品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种天然多糖在制备预防高血糖和高血脂保健品中的应用，所述天然多糖为羊栖菜多糖、仙人掌多糖和三七多糖中的一种或多种。其思路是从羊栖菜、仙人掌和三七中通过热水提取得到水溶性多糖，接着通过DEAE纤维素柱纯化得到多糖不同组分，对不同多糖组分进行结构表征，并筛选主要组分对高脂饮食诱导的糖脂代谢紊乱模型小鼠进行预防性受试，评价羊栖菜多糖、仙人掌多糖和三七多糖对高血糖和高血脂的预防效果及过程中对小鼠肠道菌群的调节效果。
Description
技术领域
本发明涉及天然植物多糖技术领域，具体涉及天然多糖尤其是羊栖菜多糖、仙人掌多糖和三七多糖的提取纯化以及在制备预防高血糖和高血脂保健品中的应用。
背景技术
随着生活节奏加快，长期暴露于不健康生活方式以及日益增加的压力下，出现了以糖脂代谢紊乱为基础的代谢性疾病，包括糖尿病、高脂血症、肥胖、非酒精性脂肪肝、高血压及心血管疾病等。该类疾病机制复杂、病程长、并发症多，药物治疗难度较大，并且糖脂代谢性疾病的发病率和患病率逐渐增加且出现年轻化趋势。目前临床降糖降脂药物因长期使用产生耐药性及不良反应，因此寻找疗效好且副作用小的药物成为迫切的需要。近年来，大量研究表明一些药食同源的天然植物及其提取物对糖脂代谢紊乱的防治具有较好效果，受到人们广泛的关注。通过日常饮食积极开展代谢综合征防治，具有较高的社会价值和经济价值。
多糖是一类由10个及10个以上单糖或单糖衍生物通过糖苷键缩合形成的天然高分子化合物，是药食同源植物中最重要的活性成分之一。植物多糖具有多种生物学功能，如可以通过改善细胞膜的通透性、调节信号通路和产生肿瘤坏死因子等方式增强机体抵抗癌症的能力；通过调节脂质代谢缓解脂肪肝；通过减少病毒的复制来抑制病毒在体内的扩散，起到抗病毒的作用等。并且，植物多糖具有来源广、易于提取、安全性高、副作用小的特点，因此近年来植物多糖在生化、医药和食品工业中得到了广泛的研究和应用。羊栖菜、仙人掌作用药食同源植物，三七作为名贵的传统中药材，都具有十分重要的食用及药用价值。而多糖作为三种植物的主要活性成分，是其发挥众多生物活性的基础；因此，研究羊栖菜多糖、仙人掌多糖以及三七多糖对于血糖血脂的调节作用，对于开发预防高血糖和高血脂保健品具有重要的指导意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的上述不足，提供一种将羊栖菜多糖、仙人掌多糖和三七多糖等天然多糖应用于高脂饮食诱导的糖脂代谢紊乱的预防上，旨在将羊栖菜多糖、仙人掌多糖和三七多糖等天然多糖用于制备预防高血糖和高血脂保健品中的应用。
其所要解决的技术问题通过以下技术方案来实施。
一种天然多糖在制备预防高血糖和高血脂保健品中的应用，其特点为，所述天然多糖为羊栖菜多糖、仙人掌多糖和三七多糖中的一种或多种。
进一步，所述天然多糖为水溶性多糖。
其中，所述天然多糖为羊栖菜多糖时，所述羊栖菜多糖采用如下制备方法：
(1-1)、将干燥羊栖菜粉碎，过筛，得到羊栖菜粉末；将羊栖菜粉末采用95％乙醇通过索式提取回流充分脱脂脱色，然后干燥至恒重；
(1-2)、取干燥后羊栖菜粉末，按设定的料液比热水提取，合并提取液并浓缩至合适体积；
(1-3)、在提取液中加入无水乙醇至乙醇终浓度80％，4℃放置过夜，离心，沉淀冷冻干燥，得到羊栖菜粗多糖；
所述天然多糖为仙人掌多糖时，所述仙人掌多糖采用如下制备方法：
(2-1)、将新鲜仙人掌除刺去皮后，切成小块，用95％乙醇通过索式提取回流充分脱脂脱色，干燥至恒重后粉碎，过筛，得仙人掌粉末；
(2-2)、取干燥后仙人掌粉末，按设定的料液比热水提取，合并提取液并浓缩至合适体积；
(2-3)、在提取液中加入无水乙醇至乙醇终浓度80％，放置于4℃过夜，离心，沉淀冷冻干燥，得到仙人掌粗多糖；
所述天然多糖为三七多糖时，所述三七多糖采用如下制备方法：
(3-1)、将干燥三七粉碎，过筛，得到三七粉末；将三七粉末采用95％乙醇通过索式提取回流充分脱脂脱色，然后干燥至恒重；
(3-2)、取干燥后三七粉末，按设定的料液比热水提取，合并提取液并浓缩至合适体积；
(3-3)、在提取液中加入无水乙醇至乙醇终浓度80％，放置于4℃过夜，离心，沉淀冷冻干燥，得到三七粗多糖。
优选的，步骤(1-2)中，提取温度为90℃以上；步骤(2-2)中，提取温度为75℃以上；步骤(3-2)中，提取温度为65°以上。
优选的，步骤(1-2)中，料液比为1:25，提取条件为1小时提取两次；步骤(2-2)中，料液比为1:15，提取条件为2小时提取两次；步骤(3-2)中，料液比为1:15，提取条件为1.5小时提取两次。。
更进一步，所述天然多糖的多糖采用如下的步骤进一步提纯：
(4)、将所得的粗多糖溶解，采用Sevage法反复处理以完全去除游离蛋白，采用透析袋透析，然后将透析后的多糖溶液浓缩至合适体积；
(5)、将(4)中的多糖溶液经过DEAE-52纤维素柱纯化，依次用去离子水、梯度NaCl溶液洗脱；
(6)、将(5)中每个浓度NaCl溶液洗脱的组分收集合并，采用透析袋透析，然后将透析后的多糖溶液浓缩至合适体积，真空冷冻干燥最终得到对应的六个羊栖菜多糖组分、三个仙人掌多糖组分或者两个三七多糖组分。
优选的，步骤(4)中，采用3500Da透析袋透析48h。
优选的，步骤(5)中，每个洗脱液浓度洗脱两个柱体积。
进一步，六个羊栖菜多糖组分中,羊栖菜多糖主要组分SFP，按摩尔比，其单糖组成为岩藻糖：半乳糖：甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：木糖：鼠李糖＝1：0.38：0.35：0.14：0.13：0.12：0.01。
也进一步，羊栖菜多糖主要组分SFP为一种总糖含量96.40％，主要由摩尔比1：0.38：0.35：0.14：0.13：0.12：0.01的岩藻糖：半乳糖：甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：木糖：鼠李糖组成的分子量为115.6kDa的杂多糖。
采用上述技术方案的应用，具有如下的有益效果：
1、相比于已有方法，在多糖的提取方面可以在更温和的提取条件得到相同的提取率；
2、采用药食同源植物多糖作为预防高血糖及高血脂保健品的主要活性成分，对人体的安全性更高，也有助于药食同源植物的进一步开发应用。
附图说明
图1为本发明制备羊栖菜多糖所涉及的DEAE-52纤维素柱洗脱曲线；
图2为本发明制备的羊栖菜多糖的HPGPC图谱；
图3为本发明制备的三七多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠体重的影响；
图4为本发明制备的仙人掌多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠体重的影响；
图5为本发明制备的三七多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠空腹血糖的影响；
图6为本发明制备的仙人掌多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠空腹血糖的影响；
图7为本发明制备的三七多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清TC含量的影响；
图8为本发明制备的三七多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清TG含量的影响；
图9为本发明制备的三七多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清LDL-c含量的影响；
图10为本发明制备的三七多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清HDL-c含量的影响；
图11为本发明制备的仙人掌多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清TC含量的影响；
图12为本发明制备的仙人掌多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清TG含量的影响；
图13为本发明制备的仙人掌多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清LDL-c含量的影响；
图14为本发明制备的仙人掌多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清HDL-c含量的影响；
图15为本发明制备的三七多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清LDL-c与HDL-c比值的影响；
图16为本发明制备的仙人掌多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清LDL-c与HDL-c比值的影响；
图17为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠体重的影响；
图18为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠空腹血糖的影响；
图19为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清HDL-c含量的影响；
图20为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清LDL-c含量的影响；
图21为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清TG含量的影响；
图22为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清TC含量的影响；
图23为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清LDL-c与HDL-c比值的影响；
图24为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清AST含量的影响；
图25为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清ALT含量的影响；
图26为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠血清TNF-α含量的影响；
图27为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠中Normal组小鼠脂肪组织切片情况；
图28为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠中HFD组小鼠脂肪组织切片情况；
图29为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠中SFP-H组小鼠脂肪组织切片情况；
图30为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠中SFP-L组小鼠脂肪组织切片情况；
图31为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠脂肪细胞面积的影响；
图32为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠中Normal组小鼠肝脏H&E染色切片情况；
图33为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠中HFD组小鼠肝脏H&E染色切片情况；
图34为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠中SFP-H组小鼠肝脏H&E染色切片情况；
图35为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠中SFP-L组小鼠肝脏H&E染色切片情况；
图36-39为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠肠道菌群α多样性的影响，其中，图36为Shannon指数；图37为Observed species指数；图38为Chao1指数；图39为Simpson指数；
图40为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠肠道菌群β多样性PCA主成分分析图；
图41为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠肠道菌群β多样性PCoA分析图；
图42为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠肠道菌群门水平的菌群组成柱状图；
图43为本发明制备羊栖菜多糖对高脂饮食诱导糖脂代谢紊乱模型小鼠肠道菌群属水平的菌群组成聚类热图。
具体实施方式
本发明提供了一种天然多糖在制备预防高血糖和高血脂保健品中的应用，其思路是从羊栖菜、仙人掌和三七中通过热水提取得到水溶性多糖，接着通过DEAE纤维素柱纯化得到多糖不同组分，对不同多糖组分进行结构表征，并筛选主要组分对高脂饮食诱导的糖脂代谢紊乱模型小鼠进行预防性受试，评价羊栖菜多糖、仙人掌多糖和三七多糖对高血糖和高血脂的预防效果及过程中对小鼠肠道菌群的调节效果。
下面结合附图对本发明的具体实施方式进行进一步的详细说明。
实施例1：羊栖菜多糖的制备及纯化
包括以下技术步骤：
(1)、将干燥羊栖菜粉碎，过80目筛，得到羊栖菜粉末；将羊栖菜粉末采用95％乙醇通过索式提取回流充分脱脂脱色，然后干燥至恒重；
(2)、取(1)中干燥后粉末，按料液比1：25，提取温度90℃，提取时间1小时，重复提取两次，合并提取液并浓缩至合适体积；
(3)、在(2)提取液中加入无水乙醇至乙醇终浓度80％，放置于4℃过夜，离心，沉淀冷冻干燥，得到羊栖菜粗多糖。
(4)、将(3)中所得的羊栖菜粗多糖溶解，采用Sevage法反复处理7～8次，以完全去除游离蛋白，然后采用3500Da透析袋透析48h，然后将透析后的多糖溶液浓缩至合适体积。
(5)、将(4)中多糖溶液经过DEAE-52纤维素柱纯化，依次用去离子水、梯度NaCl溶液洗脱，每个洗脱液浓度洗脱两个柱体积，洗脱曲线如图1。
(6)、将(5)中每个NaCl溶液洗脱的组分收集合并，然后采用3500Da透析袋透析48h，然后将透析后的多糖溶液浓缩至合适体积，真空冷冻干燥3天，最终得到六个羊栖菜多糖组分。
实施例2：三七多糖及仙人掌多糖的制备及纯化
包括以下技术步骤：
(1)、将新鲜仙人掌除刺去皮后，切成小块，用95％乙醇通过索式提取回流充分脱脂脱色，干燥至恒重后粉碎，过80目筛，得仙人掌粉末；
(2)、将干燥三七粉碎，过80目筛，得到三七粉末；将三七粉末采用95％乙醇通过索式提取回流充分脱脂脱色，然后干燥至恒重；
(3)、取(1)中干燥后粉末，按料液比1：15，提取温度75℃，提取时间2小时，重复提取两次，合并提取液并浓缩至合适体积；
(4)、取(2)中干燥后粉末，按料液比1：15，提取温度65℃，提取时间1.5小时，重复提取两次，合并提取液并浓缩至合适体积；
(5)、在(3)、(4)提取液中加入无水乙醇至乙醇终浓度80％，放置于4℃过夜，离心，沉淀冷冻干燥，得到仙人掌粗多糖和三七粗多糖。
(6)、将(5)中所得的仙人掌粗多糖和三七粗多糖溶解，采用Sevage法反复处理7～8次，以完全去除游离蛋白，然后采用3500Da透析袋透析48h，然后将透析后的多糖溶液浓缩至合适体积。
(7)、将(6)中多糖溶液经过DEAE-52纤维素柱纯化，依次用去离子水、梯度NaCl溶液洗脱，每个洗脱液浓度洗脱两个柱体积。
(8)、将(7)中每个NaCl溶液洗脱的组分收集合并，然后采用3500Da透析袋透析48h，然后将透析后的多糖溶液浓缩至合适体积，真空冷冻干燥3天，最终得到三个仙人掌多糖组分以及两个三七多糖组分。
实施例3：羊栖菜多糖不同组分的结构表征
(1)、对实施例1中得到的6个组分采用硫酸苯酚法检测总糖含量、采用BCA法检测蛋白含量，结果如下表1所示。
表1：
| 0.05M | 0.1M | 0.2M | 0.3M | 0.5M | 1M | |
| 总糖含量 | 52.46％ | 55.86％ | 96.40％ | 60.16％ | 50.21％ | 55.46％ |
| 蛋白含量 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
(2)、结合实施例1中六种多糖组分的得率及实施例3(1)中总糖含量、蛋白含量，分析得到羊栖菜多糖主要组分SFP。
(3)、对SFP进行分子排阻色谱检测，将多糖组分配置成5mg/mL溶液，同样取分子量标准物质(葡聚糖)配置成5mg/mL溶液，过0.22μm滤膜备用。
HPGPC检测条件：
Shimadzu LC-2010AHT高效液相色谱仪；
示差检测器(RID-20A)；
TSKgel GMPWxL(7.8mm*30cm)及TSKgel G5000PWxL(7.8mm*30cm)色谱柱串联；
流动相：0.01M磷酸盐缓冲液；
流速：0.6mL/min；
柱温：35℃；
池温度：35℃；
进样量：10μL。
检测结果为：SFP的相对分子质量为115.6kDa。图2为本发明制备的羊栖菜多糖的HPGPC图谱。
(4)、对SFP进行单糖组成测定，取20mg各多糖组分，加入2mL的4mol/L三氟乙酸溶液，于110℃水解6小时，然后加入甲醇，旋蒸至少量，重复5次以充分去除三氟乙酸，最后一次蒸发至干；然后加入300μL 0.6M NaOH及600μL PMP-甲醇溶液，于70℃反应2小时，然后加入氯仿萃取多次，留水相过0.22μm膜备用；标准单糖用同样方法制样备用；
HPLC检测条件：
Shimadzu LC-2010AHT高效液相色谱仪；
紫外检测器(SPD)；
InertSustain C18(4.6mm*250mm)色谱柱；
流动相：0.2M磷酸盐缓冲液：乙腈(84：16)；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
检测结果为：SFP的单糖组成为岩藻糖：半乳糖：甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：木糖：鼠李糖＝1：0.38：0.35：0.14：0.13：0.12：0.01(摩尔比)。
综上，该发明得到了一种总糖含量96.40％，主要由摩尔比1：0.38：0.35：0.14：0.13：0.12：0.01的岩藻糖：半乳糖：甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：木糖：鼠李糖组成的分子量为115.6kDa的杂多糖SFP。
实施例4：三七多糖及仙人掌多糖对肥胖的预防作用
肥胖小鼠模型建立及两种多糖受试分组：
选择4周龄雄性C57BL/6J小鼠32只，饲养于SPF级动物实验室内。饲养条件为温度22±2℃，湿度50±10％，9:00～21:00置于光照环境，21:00～次日9:00置于黑暗环境，不限制饮水量及进食量。小鼠先适应性饲养一周，然后随机分为4组(n＝8)。
三七多糖受试分组：
(a)、Normal(空白对照组)：普通饲料喂养+去离子水灌胃；
(b)、HFD(模型组)：高脂饮食(HFD)喂养+去离子水灌胃；
(c)、PNPs-L(三七多糖低剂量组)：HFD喂养+0.15g/kg/d三七多糖灌胃；
(d)、PNPs-H(三七多糖高剂量组)：HFD喂养+0.3g/kg/d三七多糖灌胃。
仙人掌多糖受试分组：
(a)、Normal(空白对照组)：普通饲料喂养+去离子水灌胃；
(b)、HFD(模型组)：HFD喂养+去离子水灌胃；
(c)、ODPs-L(仙人掌多糖低剂量组)：HFD喂养+0.15g/kg/d仙人掌多糖灌胃；
(d)、ODPs-H(仙人掌多糖高剂量组)：HFD喂养+0.3g/kg/d仙人掌多糖灌胃。
每克小鼠体重的灌胃体积为0.01mL，即20g重的小鼠灌胃体积为0.2mL。实验持续12周，期间自由摄食和饮水，每周记录体重。
小鼠解剖及血清和组织收集：第13周，小鼠禁食12小时，测量血糖，摘除眼球后收集血液，室温放置1.5h，4℃下5000rpm离心10min，收集血清于-80℃待用。收集血液后将小鼠脱颈椎处死。脂质代谢相关指标：小鼠血清中TC、TG、LDL-c、HDL-c的含量，依据相应试剂盒说明书步骤进行检测。
结果：
通过12周受试小鼠体重的增长结果，可以直观反映小鼠生长情况、肥胖造模以及不同多糖受试的改善效果。各组小鼠第12周体重如图3和图4所示，两组实验中，HFD小鼠体重相较于Normal组小鼠体重均有显著性提高，根据“动物肥胖模型评价标准”，超过正常体重的20％可诊断为肥胖，可知肥胖造模成功。在给与两种多糖受试的组中，小鼠体重相较于HFD组均显著降低，且PNP多糖受试组小鼠体重减少趋势呈现剂量依赖性，说明两种多糖受试均能够显著减低小鼠的体重增长。图5和图6展示了12周末各组小鼠的空腹血糖，其中，12周后HFD组小鼠的空腹血糖显著高于Normal组，而两种多糖受试一定程度抑制了小鼠的血糖升高。
由图7至图14可知，HFD组小鼠血清TC、TG和LDL-c水平相较于Normal组小鼠均显著提高，说明HFD小鼠血脂含量上升、脂质代谢紊乱，而小鼠受试两种多糖后，血清中的TC、TG、LDL-c水平均显著降低。通过小鼠血清中脂代谢相关指标的显著下降，表明了两种多糖对肥胖小鼠脂代谢均有改善效果。对LDL-c/HDL-c的比值进行分析(图15和图16)，以更加准确地表征小鼠脂代谢情况，可知HFD喂养会使该比值显著升高，而受试两种多糖能够显著降低该比值。
实施例5：羊栖菜多糖：
肥胖小鼠模型建立及羊栖菜多糖受试分组：
选择4周龄雄性C57BL/6J小鼠32只，饲养于SPF级动物实验室内。饲养条件为温度22±2℃，湿度50±10％，9:00～21:00置于光照环境，21:00～次日9:00置于黑暗环境，不限制饮水量及进食量。小鼠先适应性饲养一周，然后随机分为4组(n＝8)。
羊栖菜多糖受试分组：
(a)、Normal(空白对照组)：普通饲料喂养+去离子水灌胃；
(b)、HFD(模型组)：HFD喂养+去离子水灌胃；
(c)、SFP-L(羊栖菜多糖低剂量组)：HFD喂养+0.15g/kg/d羊栖菜多糖灌胃；
(d)、SFP-H(羊栖菜多糖高剂量组)：HFD喂养+0.3g/kg/d羊栖菜多糖灌胃。
每克小鼠体重的灌胃体积为0.01mL，即20g重的小鼠灌胃体积为0.2mL。实验持续12周，期间自由摄食和饮水，每周记录体重。
小鼠解剖及血清和组织收集：第13周，小鼠禁食12小时，测量血糖，摘除眼球后收集血液，室温放置1.5h，4℃下5000rpm离心10min，收集血清于-80℃待用。收集血液后将小鼠脱颈椎处死。解剖，得到肝脏、白色脂肪(附睾脂肪、肠系膜脂肪、肾周脂肪)、棕色脂肪、盲肠内容物，用4％多聚甲醛固定部分肝脏和附睾脂肪，用于后续组织病理学检测，其余部分用铝箔纸包裹储存于-80℃。
脂质代谢相关指标：小鼠血清中TC、TG、LDL-c、HDL-c的含量，依据相应试剂盒说明书步骤进行检测。
肝损伤相关指标ALT和AST水平依照说明书步骤使用相应的生化试剂盒进行测定。
促炎因子检测：小鼠血清中的TNF-α含量通过酶联免疫吸附的方法，使用相应的ELISA试剂盒进行测定。
组织病理学检测：取固定的附睾脂肪和肝脏，用石蜡包埋并进行切片，然后用苏木精-伊红(H&E)染色，用电子显微镜扫描拍摄组织形态。
小鼠粪便收集与肠道菌群测序：受试结束解剖后，收集小鼠盲肠内容物(100-200mg/只)于无菌冻存管中，液氮速冻，每组随机抽取3个样本进行微生物组学分析。使用DNA提取试剂盒，从12例小鼠粪便样本中提取总DNA并定量。然后，PCR扩增16SrRNA基因的V3-V4高变区，磁珠回收PCR产物后，使用双链DNA分析试剂盒进行定量。测序文库使用TruSeq Nano DNA建库试剂盒制备。
短链脂肪酸(SCFAs)测定：使用气相色谱法(GC)测定小鼠盲肠内容物中的SCFAs。
标准品制备：以乙醚为溶液，准确配置浓度为6μmol/L的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、正戊酸、乙基丁酸和异戊酸为标准品，分别进样以确定该样品在GC中的保留时间。之后，移取等量的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、正戊酸、乙基丁酸和异戊酸标准品，充分混合制备得到混标(混标中各标品终浓度为1μmol/L)。所有制备所得标准品置于-20℃冰箱待测。检测前，使用0.22μm尼龙膜过滤。
待测样品前处理：准确称取100mg小鼠盲肠内容物，加入0.25mL的50％(w/v)硫酸，充分匀浆。匀浆后，加入1mL乙醚，50μL 2-乙基丁酸(i-C6)作为内标，内标的最终浓度为1μmol/L。4℃下，进行30min涡旋使充分混合，离心(5000rpm，4℃)后取上清液。完成后，再次加入1mL乙醚并重复上述步骤3次，使SCFAs充分转移至上清液中。使用0.22μm尼龙膜过滤上清后待测。
GC设置参数：进样口温度为290℃，检测器温度为350℃，载气流速3.7mL/min；设置初始温度为100℃，保持3min，之后以8℃/min的速度升温至180℃，整个升温程序时间为12min；一次进样体积为0.5μL，并设置不分流进样。
结果：
通过12周受试小鼠体重的增长结果，可以直观反映小鼠生长情况、肥胖造模以及SFP受试的改善效果。各组小鼠第12周体重如图17所示，HFD小鼠体重相较于Normal组小鼠体重均有显著性提高，根据“动物肥胖模型评价标准”，超过正常体重的20％可诊断为肥胖，可知肥胖造模成功。在给与SFP受试的组中，小鼠体重相较于HFD组均显著降低，说明SFP受试均能够显著减低小鼠的体重增长。图18展示了12周末各组小鼠的空腹血糖，其中，12周后HFD组小鼠的空腹血糖显著高于Normal组，而SFP受试一定程度上抑制了小鼠的血糖升高。
由图19至图23可知，HFD组小鼠血清TC、TG和LDL-c水平相较于Normal组小鼠均显著提高，说明HFD小鼠血脂含量上升、脂质代谢紊乱，而小鼠进行SFP受试后，血清中的TC、TG、LDL-c水平均显著降低。通过小鼠血清中脂代谢相关指标的显著下降，表明了SFP对肥胖小鼠脂代谢途径均有改善效果。对LDL-c/HDL-c的比值进行分析，以更加准确地表征小鼠脂代谢情况，可知HFD喂养会使该比值显著升高，而SFP受试能够剂量依赖性降低该比值，使其显著降低。
研究中通常使用血清ALT、AST来初步反映肝脏功能，由图24和图25可知，HFD组小鼠血清中ALT和AST水平已显著高于Normal组，表明肥胖小鼠体内出现了较为严重的肝损伤；而与HFD组相比，SFP受试的小鼠血清中的ALT和AST水平均显著降低。
脂质沉积不仅引起肝细胞应激增加，还可进一步刺激炎症通路，同时促炎细胞因子在血液中的水平将随着肥胖程度的增加而增加。由图26所示，HFD组小鼠血清TNF-α的含量相较于Normal组显著升高，而与HFD组相比，SFP受试的小鼠血清中的TNF-α水平均显著降低，均与HFD组之间存在显著性差异。
对各组小鼠附睾脂肪进行切片和H&E染色，如图27至图30所示，并通过软件测定脂肪细胞大小，结果如图31所示。HFD组小鼠脂肪细胞显著增大，而SFP-H和SFP-L组小鼠脂肪细胞面积相较于HFD组显著性降低，以上实验结果说明SFP受试可以有效改善肥胖小鼠的脂肪堆积。
通过组织病理学观察，可以更加直观地反映小鼠的肝损伤程度。如图32至图35H&E染色显示，Normal组小鼠的肝细胞排列规则，结构完整，无脂肪空泡及炎性细胞；反之，HFD组出现严重的脂肪变性并伴有炎性细胞浸润现象；SFP干预后，肝损伤情况明显好转。综上可知，SFP干预可以有效减轻HFD喂养造成的肝损伤。
微生物组：
α多样性分析可以反映组内的菌群丰度，常用来评估微生物群落的物种多样性的分析指标有丰富度指数和多样性指数。图36至图39是小鼠肠道菌群α多样性分析的数据图，包括Chao1、Observed species、Shannon和Simpson指数。Chao1和Observed species常用来评估物种的丰富度，而Shannon指数和Simpson指数综合了物种的丰富度和物种的分布均匀程度，也被称为多样性指数。与Normal组相比，HFD组在物种的丰富度方面有所降低，而SFP受试组丰富度降低明显，这说明肥胖在一定程度上影响了小鼠肠道菌群的物种丰富度。而从物种的多样性上来看，HFD喂养使Shannon指数和Simpson指数相较于正常小鼠显著下降；与HFD组相比，SFP-H受试组显著提高了Shannon指数和Simpson指数。由此可知，SFP可有效预防肥胖小鼠体内肠道菌群的α多样性降低。综合四个指数来看，推测是高脂饮食和SFP处理改变了菌群组成。
β多样性分析用以反应组间的菌群丰度和菌群差异。其中主成分分析法(PCA)是一种进行物种的β多样性分析的常用方法。如图40所示，四组有一定的重合，说明HFD喂养和SFP受试对于肠道菌群的影响在一个合适范围内，而SFP-L组与HF组和Normal组相比产生了较好的的区分，说明SFP-L受试改变了菌群组成部分。
基于Weighted Unifrac距离的PCoA分析综合考虑了物种丰度和多样性，如图41所示，Normal组显著区别于其他组，说明高脂饮食和多糖受试都改变了肠道菌群组成。而SFP受试组与HFD组产生明显的区分，并向Normal组靠近，且两个SFP受试组之间存在一定重叠，表明SFP受试改变了菌群组成部分。
图42是基于门水平的菌群组成柱状图，其中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌门。HFD导致Firmicutes/Bacteroidetes的比例显著升高，并使作为内毒素产生菌的Proteobacteria的相对丰度上升。我们的HFD组的结果与之相一致，而SFP受试则剂量依赖性地预防了肥胖小鼠肠道内Firmicutes/Bacteroidetes的比例以及Proteobacteria的相对丰度的升高。其中，Proteobacteria作为一种肠道生态失调的生物标志物，丰度过高可导致宿主的营养和代谢紊乱，并产生炎症。SFP可能通过降低该菌门丰度，进而改善小鼠体内的糖脂代谢紊乱并预防炎症发生。
图43显示了小鼠在属水平上的肠道菌群组成差异，与正常饮食相比，HFD喂养显著改变了小鼠肠道部分菌属的相对丰度，HFD组相较于Normal组增加的菌属主要表现在产生有毒物质如硫化氢，破坏肠道或肠屏障，致病菌具有耐药性。而Normal组相对于HFD组显著增加的菌属主要表现在可以参与复杂碳水化合物的代谢如果胶、抗性淀粉等，产生短链脂肪酸，主要是乙酸和丁酸。SFP受试后相对于HFD组增加的菌属为拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、粘螺菌属(Mucispirillum)、梭状芽孢杆菌属(Clostridia)、丁酸弧菌属(Butyricimonas)、经黏液真杆菌属(Blautia)、嗜胆菌属(Bilophila)、拟杆菌属(Bacteroides)以及Lachnoclostridium等，这些菌属主要为可降解多糖的菌属以及产短链脂肪酸的菌属。由此说明，SFP受试可优化肠道菌群组成，能够显著改善HFD对菌属结构的影响，有效阻止HFD喂养导致的有害菌增长和有益菌减少。
Claims (10)
1.一种天然多糖在制备预防高血糖和高血脂保健品中的应用，其特征在于，所述天然多糖为羊栖菜多糖、仙人掌多糖和三七多糖中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述天然多糖为水溶性多糖。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述天然多糖为羊栖菜多糖时，所述羊栖菜多糖采用如下制备方法：
(1-1)、将干燥羊栖菜粉碎，过筛，得到羊栖菜粉末；将羊栖菜粉末采用95％乙醇通过索式提取回流充分脱脂脱色，然后干燥至恒重；
(1-2)、取干燥后羊栖菜粉末，按设定的料液比热水提取，合并提取液并浓缩至合适体积；
(1-3)、在提取液中加入无水乙醇至乙醇终浓度80％，4℃放置过夜，离心，沉淀冷冻干燥，得到羊栖菜粗多糖；
所述天然多糖为仙人掌多糖时，所述仙人掌多糖采用如下制备方法：
(2-1)、将新鲜仙人掌除刺去皮后，切成小块，用95％乙醇通过索式提取回流充分脱脂脱色，干燥至恒重后粉碎，过筛，得仙人掌粉末；
(2-2)、取干燥后仙人掌粉末，按设定的料液比热水提取，合并提取液并浓缩至合适体积；
(2-3)、在提取液中加入无水乙醇至乙醇终浓度80％，放置于4℃过夜，离心，沉淀冷冻干燥，得到仙人掌粗多糖；
所述天然多糖为三七多糖时，所述三七多糖采用如下制备方法：
(3-1)、将干燥三七粉碎，过筛，得到三七粉末；将三七粉末采用95％乙醇通过索式提取回流充分脱脂脱色，然后干燥至恒重；
(3-2)、取干燥后三七粉末，按设定的料液比热水提取，合并提取液并浓缩至合适体积；
(3-3)、在提取液中加入无水乙醇至乙醇终浓度80％，放置于4℃过夜，离心，沉淀冷冻干燥，得到三七粗多糖。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1-2)中，提取温度为90℃以上；步骤(2-2)中，提取温度为75℃以上；步骤(3-2)中，提取温度为65°以上。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，步骤(1-2)中，料液比为1:25，提取条件为1小时提取两次；步骤(2-2)中，料液比为1:15，提取条件为2小时提取两次；步骤(3-2)中，料液比为1:15，提取条件为1.5小时提取两次。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
所述天然多糖的粗多糖采用如下的步骤进一步提纯：
(4)、将所得的粗多糖溶解，采用Sevage法反复处理以完全去除游离蛋白，采用透析袋透析，然后将透析后的多糖溶液浓缩至合适体积；
(5)、将(4)中的多糖溶液经过DEAE-52纤维素柱纯化，依次用去离子水、梯度NaCl溶液洗脱；
(6)、将(5)中每个浓度NaCl溶液洗脱的组分收集合并，采用透析袋透析，然后将透析后的多糖溶液浓缩至合适体积，真空冷冻干燥最终得到对应的六个羊栖菜多糖组分、三个仙人掌多糖组分或者两个三七多糖组分。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，采用3500Da透析袋透析48h。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(5)中，每个洗脱液浓度洗脱两个柱体积。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，六个羊栖菜多糖组分中,羊栖菜多糖主要组分SFP，按摩尔比，其单糖组成为岩藻糖：半乳糖：甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：木糖：鼠李糖＝1：0.38：0.35：0.14：0.13：0.12：0.01。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，羊栖菜多糖主要组分SFP为一种总糖含量96.40％，主要由摩尔比1：0.38：0.35：0.14：0.13：0.12：0.01的岩藻糖：半乳糖：甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：木糖：鼠李糖组成的分子量为115.6kDa的杂多糖。
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