CN103864952A - 一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法及用途：对甘草药材进行脱脂；制备甘草粗多糖，再将其加水煮沸提取，将过滤后的上清液每100ml用0.4g活性炭60℃脱色，浓缩后再沉淀4小时，离心，干燥得到甘草粗多糖；进行分级醇沉：加水稀释成浓度为2～5%甘草粗多糖溶液，溶胀、离心提取上清液，浓缩，沉淀4小时，离心、除掉沉淀的大分子多糖，取上清液进行浓缩至该除掉大分子多糖后的上清液体积的1/6～1/8，将溶液的乙醇浓度调至75～85%后沉淀，离心15～25分钟，取沉淀物淋洗后，干燥；纯化：依次进行除去蛋白、超滤除盐和冷冻干燥，即得到小分子甘草多糖。本发明纯度高、服用剂量小，增强自身免疫功能从而表现出显著的抗肿瘤能力。

Description

一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种小分子甘草多糖。特别是涉及一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法及用途。

背景技术

近年来随着社会的不断发展，环境污染和人们的压力越来越严重，患癌症的病人的数量及人们患癌症的几率也在逐年大量增加。2010年8月第21届世界抗癌大会上的数据显示，中国每年癌症发病人数约260万，死亡180万，在过去的30年中国癌症死亡率增加了80%。

常用癌症治疗方法为外科手术、放射治疗、化学治疗等。这些治疗方法通常会导致癌症病人身体衰弱、免疫力下降、炎症反应等副作用影响。因此在癌症治疗期间服用具抗肿瘤及提高免疫作用的药物来增强患者自身的免疫抗病能力就变得十分重要。因此在天然药物中研究开发具抗肿瘤、提高免疫力活性，且副作用相对较低的产品就具有了很强的实际意义。

甘草为我国常用大宗药材、药食兼用品种，其又名国之药老，有“十方九草”的美誉，其具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效，因此自古以来在临床上大量使用。随着现代糖化学技术的发展，甘草多糖作为甘草中药活性物质之一也进入了人们的视野。国内外的研究者发现甘草多糖具有抗肿瘤及多种免疫增强功能（王忱,谢广茹,史玉荣,等.甘草多糖的体内抑瘤作用及其机制的研究[J].临床肿瘤学杂志,2003,8(2):85-87.；王岳五,史玉荣,张海波,等.甘草残渣中多糖GPS抗肿瘤作用的研究[J].南开大学学报,2000,33(4):46-48.）但是甘草全多糖具有服用剂量大，服用不方便的缺点。目前尚无对甘草中的多糖按分子量划段精制后对其抗肿瘤活性进行综合评价的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够提高治疗效果、降低服用剂量、且具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖及其制备方法及用途。

本发明所采用的技术方案是：一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法，包括如下步骤：

1）对甘草药材进行脱脂；

2）制备甘草粗多糖，将脱脂后的甘草药材加水煮沸提取2次，每次2小时，将过滤后的上清液每100ml用0.4g活性炭60℃脱色1～3小时，浓缩后再用70～80%浓度乙醇醇沉沉淀4小时，离心，干燥得到甘草粗多糖；

3）进行分级醇沉：将得到的甘草粗多糖加水稀释成浓度为2～5%甘草粗多糖溶液，在室温下溶胀、离心提取上清液，然后浓缩，用浓度50～60%乙醇醇沉沉淀4小时，离心、除掉沉淀的大分子多糖，取除掉大分子多糖后的上清液进行浓缩至该除掉大分子多糖后的上清液体积的1/6～1/8，再将溶液的乙醇浓度调至75～85%后沉淀，然后以4500r/min速度离心15～25分钟，取沉淀物用95%浓度乙醇淋洗后，干燥；

4）纯化：依次进行用sevage法除去蛋白、超滤除盐和冷冻干燥，即得到小分子甘草多糖。

步骤1）所述的脱脂是：将甘草药材切片，用95%浓度乙醇提取2次，每次2小时，然后滤除渣自然风干；

每次的提取是选用5～8倍量的95%浓度乙醇进行提取。

在步骤2）所述的加水煮沸提取2次中，每一次煮沸所加的水是脱脂后的甘草药材5～15倍量。

步骤3）中所述的溶胀时间为2～3小时。

步骤3）中所述的将溶液的乙醇浓度调至75～85%后沉淀6小时。

所述小分子甘草多糖用于治疗肿瘤药物的用途。

本发明的一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法及用途，纯度高、服用剂量小，而且能够更明显的诱导体内淋巴因子表达，增强自身免疫功能从而表现出显著的抗肿瘤能力。因此可以辅助癌症治疗，减轻放射治疗和化学治疗的副作用，使身体机能更快恢复，保证治疗的顺利完成。本发明能够达到提高治疗效果、降低服用剂量的目的。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法及用途做出详细说明。

本发明的一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法及用途，是将甘草药材为原料，经乙醇脱脂后，药材水提液再通过分级醇沉的方法将甘草多糖按分子量划段，并通过活性试验证实了小分子甘草多糖的抗肿瘤活性。再通过离心、干燥、脱蛋白、除盐等手段得到精制小分子甘草多糖。活性较弱的大分子甘草多糖在甘草总多糖中所占比重为60%，因此制备具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖，除去活性较弱的大分子多糖，可以达到提高治疗效果、降低服用剂量的目的。

本发明的一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法，包括如下步骤：

1）对甘草药材进行脱脂：

将甘草药材切片，用95%浓度乙醇提取2次，每次是选用5～8倍量的95%浓度乙醇进行提取，每次2小时，然后滤过，除去滤液后滤渣自然风干；

2）制备甘草粗多糖：将脱脂后的甘草药材加水煮沸提取2次，每次2小时，所述的加水煮沸提取2次中，每一次煮沸所加的水是脱脂后的甘草药材的5～15倍量。然后将过滤后的上清液每100ml加0.4g活性炭60℃脱色1～3小时，浓缩后再用70～80%浓度乙醇醇沉沉淀4小时，离心，干燥得到甘草粗多糖；用70～80%浓度乙醇醇沉沉淀4小时

3）进行分级醇沉：将得到的甘草粗多糖加水稀释成浓度为2～5%甘草粗多糖溶液，在室温溶胀，所述的溶胀时间为2～3小时，离心，取上清液，然后浓缩，用浓度50～60%乙醇醇沉沉淀4小时，离心、除掉沉淀的大分子多糖，取除掉大分子多糖后的上清液进行浓缩至该除掉大分子多糖后的上清液体积的1/6～1/8，再将溶液的乙醇浓度调至75～85%后沉淀6小时，然后以4500r/min速度离心15～25分钟，取沉淀物用95%浓度乙醇淋洗后，干燥；

4）纯化：依次进行用sevage法除去蛋白、超滤除盐和冷冻干燥，即得到小分子甘草多糖。

采用本发明的一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法，制备的小分子甘草多糖可用于治疗肿瘤药物的用途。经实验证明，所述小分子甘草多糖具有较大分子甘草多糖及甘草全多糖更高的抑瘤率。而且能显著提高癌症小鼠的脾脏指数和胸腺指数。

下面给出实体实例：

实施例一、

1）甘草药材脱脂：将甘草药材切片，5倍量95%乙醇提取2次，每次2小时，滤过，弃去滤液，滤渣自然风干。

2）制备甘草粗多糖，将脱脂后的甘草药材加5倍量水煮沸提取2次，每次2小时，将过滤后的上清液每100ml用0.4g活性炭，在60℃下搅拌脱色，1小时，滤过除去活性炭，滤液浓缩后再用70%浓度乙醇醇沉4小时，离心，去掉上清液，沉淀，冷冻干燥，得到甘草粗多糖；

3）进行分级醇沉：将得到的甘草粗多糖每2g加入100ml水稀释成为溶液，在室温下溶胀2小时、离心，提取上清液，浓缩至该体积的1/2，用浓度50%乙醇醇沉，沉淀4小时，离心、除掉沉淀的大分子多糖，取除掉大分子多糖后的上清液进行浓缩至该体积的1/6，再将溶液的乙醇浓度调至75%后沉淀6h，然后放入冷冻离心机，以4500r/min速度离心15分钟，取沉淀物用95%浓度乙醇淋洗后，冷冻干燥；

4）纯化：用sevage法除去蛋白、之后用超滤法除盐，冷冻干燥，即得到小分子甘草多糖。

实施例二、

1）对甘草药材进行脱脂：将甘草药材切片净制，用8倍量的浓度为95%的乙醇提取2次，每次2小时，滤过，弃去滤液，取滤渣，常温风干；

2）制备甘草粗多糖：将脱脂后的甘草药材加10倍量去离子水煮沸提取2次，每次2小时，滤过，取滤液，每100ml中加入0.4g活性炭，水浴加热至60℃脱色3小时，浓缩后再用80%浓度乙醇醇沉沉淀4小时，离心，弃去上清液，取沉淀，60℃真空干燥得到甘草粗多糖；

3）对甘草粗多糖进行分级醇沉：将得到的甘草粗多糖加去离子水，稀释成浓度为5%的溶液。在室温下溶胀3小时，离心取上清液，浓缩，用浓度60%乙醇醇沉沉淀4小时，离心、除掉沉淀物，沉淀物为大分子多糖，取除掉沉淀物后的上清液进行浓缩至该体积的1/8，再将溶液的乙醇浓度调至85%，沉淀6小时，然后以4500r/min的速度离心25分钟，取沉淀物用95%浓度乙醇淋洗，70℃真空干燥；

4）纯化：依次用sevage法除去蛋白、超滤法除盐后，冷冻干燥，即得到小分子甘草多糖。

实施例三：

1）对甘草药材进行脱脂；将甘草药材切片、净制，用6倍量的浓度为95%的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，弃去滤液，将滤渣自然风干，为脱脂后的甘草药材；

2）制备甘草粗多糖，将脱脂后的甘草药材加10倍量水煮沸提取2次，每次2小时，将过滤后的上清液每100ml加入0.4g活性炭，加热至60℃脱色2小时，过滤够去掉滤渣，将上清液浓缩后再用80%浓度乙醇醇沉沉淀4小时，离心，弃去上清液，沉淀烘干得到甘草粗多糖；

3）进行分级醇沉：将得到的甘草粗多糖加水稀释成浓度为3%的甘草粗多糖溶液，在室温下溶胀2小时。离心提取上清液，浓缩上清液，用浓度60%的乙醇醇沉沉淀4小时，沉淀为大分子多糖，离心、除掉沉淀，取除掉大分子多糖后的上清液进行浓缩至该除掉大分子多糖后的上清液体积的1/7，再将溶液的乙醇浓度调至75%后沉淀6小时，然后以4500r/min速度离心20分钟，取沉淀物用95%浓度乙醇淋洗去除杂质，干燥；

4）纯化：用sevage法除去小分子多糖中的蛋白、用超滤法除去除蛋白后的小分子多糖中的盐，冷冻干燥，得到小分子甘草多糖。

实施例四：

1）对甘草药材进行脱脂；将甘草药材净制，切片，厚度在0.3厘米左右，加入95%浓度乙醇5倍量提取2小时，两次，滤过，取滤渣自然风干，得到脱脂后的甘草药材；

2）制备甘草粗多糖，将脱脂后的甘草药材加15倍量去离子水煮沸提取2次，每次2小时，滤过，取上清液每100ml用0.4g活性炭60℃脱色3小时，滤过除去活性炭，将滤液浓缩后再用80%浓度乙醇醇沉，沉淀4小时，离心，弃去上清液，沉淀干燥得到甘草粗多糖；

3）进行分级醇沉：将得到的甘草粗多糖加去离子水稀释成浓度为4%甘草粗多糖水溶液，在室温下溶胀3小时。离心，提取上清液，浓缩，用浓度60%乙醇醇沉，沉淀4小时，离心、除掉沉淀的大分子多糖，取除掉大分子多糖后的上清液进行浓缩至该除掉大分子多糖后的上清液体积的1/6，再将溶液的乙醇浓度调至80%，静置6小时，使用高速冷冻离心机以4500r/min速度离心，20分钟，弃去上清液，取沉淀物用95%浓度乙醇淋洗后，冷冻干燥；

4）纯化：依次进行用sevage法除去蛋白、超滤法除盐、冷冻干燥，得到小分子甘草多糖。

小分子甘草多糖对C-26肿瘤小鼠的影响

1.实验样品的制备

将粗甘草多糖使用分级醇沉的方法划分为大分子甘草多糖部分、小分子甘草多糖部分以及全甘草多糖，分别命名为GP-A、GP-B、GP-C。阳性对照药物为环磷酰胺。

2.动物分组和灌胃剂量的设计

选用体重18g～27g的C-26雌性、雄性肿瘤小鼠各50只，各自随机均分为5组，每组雄性10只，雌性10只。即GP-A组、GP-B组、GP-C组、空白对照组以及阳性对照组，除阳性对照组采取腹腔注射200mg/kg/d外，其余四组适应性饲养3天后开始灌胃，灌胃剂量均为500mg/kg/d。每天观察小鼠的肿瘤大小、精神、毛发等状况。每隔5天进行一次称重。

3.解剖取材

连续给予受试物14天，末次给药30min后，将小鼠颈椎脱臼处死，解剖取肿瘤组织和胸腺、脾脏称重。分别计算胸腺指数（mg胸腺重/g体重）、脾脏指数（mg脾脏重/g体重），并计算抑瘤率。

4.结论

实验结果见附表。小分子甘草多糖的抑瘤率比大分子量甘草多糖及甘草全多糖高，提示小分子量的甘草多糖是甘草多糖中主要活性物质。且小分子甘草多糖能提高癌症小鼠的脾脏指数和胸腺指数，并与阴性对照组相比有显著性差异。说明小分子甘草多糖具有增强肿瘤小鼠的自身免疫力的能力。

注：与阴性对照组比较（Saline）P<0.05*,P<0.01**

小分子甘草多糖的质量控制

1.经高效凝胶渗透色谱法测定，其平均分子量为5.5万，单糖组成以百分比计为鼠李糖3.22%，葡萄糖42.49%、葡萄糖醛酸0.29%、半乳糖醛酸10.78%、半乳糖16.35%、阿拉伯糖26.87%。

2.甘草多糖的质量控制：

1）采用苯酚-硫酸法测定多糖含量不低于70%；

2）.采用高效凝胶渗透色谱法对多糖相对分子量分布进行测定，本产品相对分子量5.5万左右。

苯酚-硫酸法对甘草多糖的含量测定

1、标准曲线的绘制

1.1标准系列溶液的配制

称取干燥至恒重（105℃）的葡萄糖50mg，置于50ml容量瓶（1mg/ml），加水溶解稀释至刻度制成储备液，从储备液中分别精密移取0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml分别置于6个50ml的容量瓶中，定容，配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/ml的葡萄糖标准系列溶液。

1.2苯酚溶液的配制

称取苯酚40g，加入蒸馏水10ml，即为80%的苯酚溶液，冰箱中密封避光长期保存。取密封避光保存的80%苯酚溶液，放置于室温，精密移取1.5ml，再精密移取18.5ml的蒸馏水，即为6%的苯酚溶液，临用前现配。

1.3标准曲线的绘制

精密移取葡萄糖标准系列溶液各1.0ml，空白取1.0ml。分别置于洁净的试管中，各加6%的苯酚1.0ml后充分振摇，再迅速加入浓硫酸5.0ml，迅速振摇，后置于沸水浴中约10min，取出摇匀放置室温（约25min），后于490nm下测定吸光度。以吸光度（Y）对葡萄糖浓度（X）进行线性回归，得回归方程。

2、换算因子的计算

精密称定精制甘草多糖50mg，定容于50ml容量瓶中，配制成浓度1mg/ml的储备液，从中移取1ml置于50ml的容量瓶中，定容，配制成0.02mg/ml的待测液。苯酚-硫酸比色法测定其吸光度，由回归方程求出此精制甘草多糖储备液中葡萄糖的质量浓度，按下式计算换算因子：

换算因子（f）=C_样品/C_葡萄糖

3、粗多糖的含量测定

精密称定甘草精制多糖50mg，定容于50ml容量瓶中，配制成浓度为1mg/ml的储备液。从中取出2.5ml置于50ml容量瓶中，定容，配制成0.05mg/ml的待测液。精密移取粗多糖的待测液1.0ml，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，根据标准曲线计算其中的多糖浓度，按照以下公式算出多糖的含量：

多糖含量(%)=C×D×f×V/W×100%

C：供试品中葡萄糖浓度(g/ml)；D：供试品的稀释因素；f：换算因子；V：供试品体积(ml)；W：供试品的重量(g)

高效凝胶渗透色谱法测定甘草多糖的相对分子量分布

1.仪器与试药

岛津LC-20A，示差折光检测器（岛津）；TSKgel G4000PWXL凝胶色谱柱；岛津GPC数据分析软件。右旋糖酐分子量标准对照品（中国药品生物制品检定所，D4～D8，分子量依次为10000、21400、41100、84400、133800）；其余试剂均为分析纯。

2.色谱条件

色谱柱：TSKgel G4000PWXL凝胶色谱柱；示差折光检测器，检测池温度：35℃；流动相：0.7%硫酸钠水溶液；柱温：35℃；流速：0.8mL/min；进样量：20μL。

3.供试品溶液制备：取待测定的精制甘草多糖粉末，加流动相制成2.6mg/mL溶液，静置2h使其充分溶解，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。

标准品溶液的制备：取右旋糖酐标准品D4～D8，用流动相配制成2.6mg/mL溶液，4000r/min离心除去杂质后作为对照品溶液。

4.标准曲线的制备：分别精密量取上述右旋糖酐系列对照品溶液20μL注入液相色谱仪，记录洗脱峰得保留时间，采用岛津GPC软件绘制标准曲线，以对照品标准分子量的对数值为纵坐标、相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性拟合，得回归方程。

5.样品测定将甘草多糖供试品溶液，按上述色谱条件测定，每个样品平行测3次。

Claims (7)

1.一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 

1）对甘草药材进行脱脂； 

2）制备甘草粗多糖，将脱脂后的甘草药材加水煮沸提取2次，每次2小时，将过滤后的上清液每100ml用0.4g活性炭60℃脱色1～3小时，浓缩后再用70～80%浓度乙醇醇沉沉淀4小时，离心，干燥得到甘草粗多糖； 

3）进行分级醇沉：将得到的甘草粗多糖加水稀释成浓度为2～5%甘草粗多糖溶液，在室温下溶胀、离心提取上清液，然后浓缩，用浓度50～60%乙醇醇沉沉淀4小时，离心、除掉沉淀的大分子多糖，取除掉大分子多糖后的上清液进行浓缩至该除掉大分子多糖后的上清液体积的1/6～1/8，再将溶液的乙醇浓度调至75～85%后沉淀，然后以4500r/min速度离心15～25分钟，取沉淀物用95%浓度乙醇淋洗后，干燥； 

4）纯化：依次进行用sevage法除去蛋白、超滤除盐和冷冻干燥，即得到小分子甘草多糖。 

2.根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的脱脂是：将甘草药材切片，用95%浓度乙醇提取2次，每次2小时，然后滤除渣自然风干。

3.根据权利要求2所述的一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法，其特征在于，每次的提取是选用5～8倍量的95%浓度乙醇进行提取。 

4.根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法，其特征在于，在步骤2）所述的加水煮沸提取2次中，每一次煮沸所加的水是脱脂后的甘草药材5～15倍量。 

5.根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法，其特征在于，步骤3）中所述的溶胀时间为2～3小时。 

6.根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的制备方法，其特征在于，步骤3）中所述的将溶液的乙醇浓度调至75～85%后沉淀6小时。 

7.一种权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的小分子甘草多糖的用途，其特征在于，所述小分子甘草多糖用于治疗肿瘤药物的用途。