CN104686809A - 一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物及其制备方法和应用，涉及大豆分离蛋白改性领域，解决了现有的大豆分离蛋白由于具有抗原性，用做畜禽饲料时会引起幼龄动物的过敏性腹泻，甚至造成其死亡的技术问题。本发明的主要技术方案为：甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法包括如下步骤：将大豆分离蛋白和甘草多糖加入水中，充分溶解后得到溶液；对溶液进行冷冻干燥处理，得到冻干粉；使冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应，得到甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。本发明主要利用甘草多糖对大豆分离蛋白进行糖基化改性，以改良大豆蛋白的抗原性，进而改善大豆分离蛋白对幼龄动物的食源致敏性，降低幼龄动物的腹泻率及死亡率。

Description

一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及大豆分离蛋白改性领域，尤其涉及一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物及其制备方法和应用。

背景技术

大豆是一种重要的植物蛋白质资源，其含有40％的优质蛋白质。大豆蛋白富含各种氨基酸,从其氨基酸组成和必须氨基酸的含量来看，大豆蛋白是为数不多的能取代动物蛋白的理想营养佳品之一。目前，国内外生产的大豆蛋白按其加工设备、工艺条件和蛋白含量不同，基本上分为大豆分离蛋白、浓缩蛋白、脱脂豆粉等9个品种。其中，大豆分离蛋白是脱皮脱脂的大豆进一步取出所含的非蛋白质成分后，所得的一种精制大豆蛋白产品。大豆分离蛋白由于具有较高的营养价值而被广泛应用于动物的饲料中。但是，大豆分离蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)亦是过敏原之一，会引起幼龄动物的过敏性腹泻，甚至造成其死亡。所以，降低大豆分离蛋白的致敏性对大豆分离蛋白的应用及饲料加工领域具有重要的意义。

糖基化方法因其操作相对简单、安全、无需添加化学试剂等优点，而被广泛应用在蛋白改性领域中。目前，已有相关研究证实以果糖为糖基化供体，对大豆分离蛋白进行干热糖基化改性可以降低大豆分离蛋白的抗原性。此外，也有相关研究证实以单糖或者寡糖作为糖基化供体，对大豆分离蛋白进行改性，也可以降低大豆分离蛋白的抗原性。

但是，本发明的发明人发现采用干热糖基化反应(果糖与大豆分离蛋白发生糖基化反应)的反应时间太长(长达457h)。且大豆分离蛋白与单糖或者发生糖基化反应后，大豆分离蛋白的许多氨基酸(尤其是赖氨酸)参与了反应，且并失去了原有功能，造成了营养成分的流失；并且在反应过程中产生了醛、杂环胺等有害中间产物，对动物机体的安全性构成极大隐患。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物及其制备方法和应用，主要目的是利用甘草多糖对大豆分离进行糖基化改性，以获得安全、抗原性低的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。

为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将大豆分离蛋白和甘草多糖加入水中，充分溶解后，得到溶液；

对所述溶液进行冷冻干燥处理，得到冻干粉；

使所述冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应，得到甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。

前述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，所述溶液中的大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为1:1-5：1。

前述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，所述溶液的浓度为8-14％。

前述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，在45-55℃的温度及65-75％相对湿度的条件下，所述冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应，得到甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。

前述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，所述冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应的步骤在盛装有饱和的溴化钾溶液的干燥器内进行。

前述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，所述冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应的时间为12-72h。

前述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，还包括制备甘草多糖的步骤，具体为：

将甘草粉料加入水中，进行超声或/和煎煮处理，得到滤液；

对所述滤液进行浓缩处理，得到浓缩液；

向所述浓缩液中加入乙醇，使浓缩液和乙醇的混合液中析出沉淀；

将所述沉淀进行洗涤、干燥处理，得到甘草粗多糖；

对甘草粗多糖进行去色素、脱蛋白、透析、纯化处理，得到甘草多糖。

另一方面，本发明实施例提供一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物，所述甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物由甘草多糖和大豆分离蛋白经糖基化反应偶合而成。

前述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物，所述甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物由上述任一项所述的方法制备而成。

前述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物，所述甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物用于制备畜禽饲料。

与现有技术相比，本发明实施例提出一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物及其制备方法和应用至少具有如下优点：

本发明实施例采用甘草多糖对大豆分离蛋白进行糖基化改性，以制备一种抗原性低的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。其中，在甘草多糖对大豆分离蛋白偶合物进行糖基化改性反应中，基本不会造成蛋白的营养成分流失，极少产生醛、杂环胺等有害物质，安全性高。另外，本发明实施例的甘草多糖与大豆分离蛋白与糖基化反应时间短，只需反应12-72h便可得到抗原性较低的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物，所以采用甘草多糖与对大豆分离蛋白进行改性的效率高。另外，本发明实施例所制备的这种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物不仅保留了大豆蛋白自身的营养成分，而且还具有甘草多糖的功效(如，提高免疫力、抗敏性及增强动物的生长性能)，从而本发明实施例制备的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物用于饲料中时，在一定程度上提高了饲料的营养价值、安全性，并提高动物的免疫力、生长性能及幼龄动物的成活率。

附图说明

图1为本发明一实施例在反应温度为45℃下制备的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的抗原性随着原料比例、糖基化反应时间的变化曲线图；

图2为本发明另一实施例在反应温度为50℃下制备的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的抗原性随着原料比例、糖基化反应时间的变化曲线图；

图3为本发明另一实施例在反应温度为55℃下制备的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的抗原性随着原料比例、糖基化反应时间的变化曲线图；

图4为本发明另一实施例提供的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物紫外扫描图谱；

图5为甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物与大豆分离蛋白的乳化活性的对比图；

图6为甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物与大豆分离蛋白的乳化稳定性的对比图；

图7为甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物与大豆分离蛋白的溶解度的对比图；

图8为甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物与大豆分离蛋白的热稳定性的对比图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物及其制备方法和应用，详细说明如后。

本发明是基于以下思路提出的：大豆分离蛋白由于具有较高的营养价值，而被广泛应用于动物的饲料中。但是，大豆分离蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)亦是过敏原之一，会引起幼龄动物的过敏性腹泻，甚至会造成其死亡。虽然已有相关研究人员采用糖基化方法对大豆分离蛋白进行改性，以降低其抗原性。但是在采用糖基化方法对大豆分离蛋白进行改性中存在：反应时间太长、效果不佳、产生毒副作用等缺点。

另外，本发明的发明人发现甘草的化学成分主要有甘草黄铜、甘草多糖、三萜皂苷类化合物；甘草多糖是一种免疫调节剂，能激活免疫细胞，提高抗补体的活性和非特异性免疫系统中自然杀伤细胞的活性、调节多种细胞因子的生成与分泌、治疗和预防病毒感染、并对细菌有较强的抑菌作用。与此同时，甘草多糖还具有抗过敏、抗溃疡、抗氧化、保护胃肠道等药理学活性。甘草多糖既可以作为药物开发应用于畜牧业中的疾病防治，又可以作为饲料添加剂，增强动物的生长性能、提高免疫力，对抗饲料中的致敏源，符合畜牧业绿色生产的要求，具有广阔的应用前景。

基于上述问题及甘草多糖的功效，本发明的发明人首次提出采用甘草多糖作为大豆分离蛋白的糖基化供体，对大豆分离蛋白进行糖基化改性，以获得安全及营养价值高的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。

具体地，本发明的实施例提出一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，包括如下步骤：

1、制备出以大豆分离蛋白和甘草多糖为溶质、以水为溶剂的溶液。

该步骤具体为：将大豆分离蛋白与甘草多糖加入至水中，充分溶解后，得到以大豆分离蛋白和甘草多糖为溶质、以水为溶剂的溶液。

较佳地，所制备的溶液中，大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为1:1-5:1，优选为3:1。

较佳地，所制备的溶液的浓度为8％-14％，优选为11％。

另外，该步骤中所用的甘草多糖是发明人由以下步骤制备而成：

A、将甘草粉碎成甘草粉料。

较佳地，该步骤中的甘草选用新疆乌拉尔甘草。使用药用机械粉碎机对新疆乌拉尔甘草进行高速粉碎，得到粒度为20-30目的甘草粉料。

B、利用水提醇沉法从甘草粉料中提取甘草多糖，得到甘草粗多糖。

该步骤具体为：将甘草粉料加入至超纯水中，进行高温超声处理，得到一次滤液和一次滤渣；再将滤渣加入超纯水中进行煎煮处理，得到二次滤液和二次滤渣。将一次滤液和二次滤液合并后进行浓缩处理，得到浓缩液。向浓缩液中加入乙醇(边加边搅拌，选用质量分数为95％的乙醇)，使浓缩液和乙醇的混合液逐渐析出沉淀。采用乙醇洗涤沉淀2-3次后，进行干燥处理，得到甘草粗多糖。

C、对甘草粗多糖进行去色素、脱蛋白、透析、纯化处理，得到较纯的精致甘草多糖。

较佳地，该步骤主要采用大孔树脂去除甘草粗多糖中的色素；采用sevag法脱去甘草粗多糖中的蛋白；采用去离子水对甘草粗多糖进行透析处理，将甘草粗多糖中的小分子杂质除去；最后采用二乙基氨基纤维素(DEAE-32)、葡聚糖凝胶(SephadexG-75)柱层析对甘草粗多糖进一步纯化后，得到精制的甘草多糖。

通过上述步骤所提取的甘草多糖的纯度高。

2、对溶液进行冷冻干燥处理，得到冻干粉；

该步骤主要对以大豆分离蛋白和甘草多糖为溶质、以水为溶剂的溶液进行真空冷冻干燥处理，得到大豆分离蛋白和甘草多糖的混合冻干粉。

上述步骤通过先制备出以大豆分离蛋白和甘草多糖为溶质、以水为溶剂的溶液、再对溶液进行干燥处理，主要目的是使大豆分离蛋白和甘草多糖实现均匀混合的目的，使两者在充分进行糖基化反应时，尽可能的提高两者的糖基化偶合率。

3、使冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应，得到甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。

较佳地，在45-55℃的温度及65-75％的湿度下，冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应，得到甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。

较佳地，冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应的步骤在盛装有饱和盐溶液的干燥器内进行。其中，饱和盐溶液为饱和的溴化钾溶液。

较佳地，该步骤中，冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应的反应时间为0.5-72h。

本发明实施例还提供一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物，该甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物，由甘草多糖和大豆分离蛋白经糖基化反应偶合而成。较佳地，甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物由上述方法制备而成。另外，本发明实施例提供的草多糖-大豆分离蛋白偶合物用于优化及制备幼龄畜禽饲料。

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

分别制备出以大豆分离蛋白和甘草多糖为溶质，蒸馏水为溶剂的三组溶液，三组溶液的浓度均为11％。其中，第一组溶液中大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为1:1；第二组溶液中大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为3:1；第三组溶液中大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为5:1。将三组溶液进行真空冷冻干燥处理，得到三组冻干粉。

将第一组冻干粉(大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为1:1)置于锡纸盒中，并将锡纸盒放入干燥器内，使冻干粉中的大豆分离蛋白和甘草多糖在相对湿度为72％(以饱和的溴化钾溶液保持干燥器内的相对湿度为72％)、温度为45℃的条件下进行糖基化反应，每隔12h取样一次，得到不同反应时间(反应时间为0、12、24、36、48、60、72h)的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物。

将第二组冻干粉(大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为3:1)置于锡纸盒中，并将锡纸盒放入干燥器内，使冻干粉中的大豆分离蛋白和甘草多糖在相对湿度为72％、温度为45℃的条件下进行糖基化反应，每隔12h取样一次，得到不同反应时间的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物。

将第三组冻干粉(大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为5:1)置于锡纸盒中，并将锡纸盒放入干燥器内，使冻干粉中的大豆分离蛋白和甘草多糖在相对湿度为72％、温度为45℃的条件下进行糖基化反应，每隔12h取样一次，得到不同反应时间的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物。

实施例2

本实施例同样制备出三组冻干粉，再使冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应，制备出得到不同反应时间的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物。与实施例1不同的是：第一组冻干粉(大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为1:1)、第二组冻干粉(大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为3:1)及第二组冻干粉(大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为5:1)的进行糖基化反应的温度为50℃，其他步骤及反应条件完全一致。

实施例3

本实施例同样制备出三组冻干粉，再使冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应，制备出得到不同反应时间的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物。与实施例1不同的是：第一组冻干粉(大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为1:1)、第二组冻干粉(大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为3:1)及第三组冻干粉(大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为5:1)的进行糖基化反应的温度为55℃，其他步骤及反应条件完全一致。

实施例4

本实施例主要对实施例1-实施例3制备的多种甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物进行抗原性测试，具体测试方法如下：

以0.5μg/mL的β-伴大豆球蛋白标准抗原包被96孔酶标板，每孔中加100μL的β-伴大豆球蛋白标准抗原。同时，将1:3000稀释度的抗β-conglycinin兔血清与蛋白浓度为2mg/mL的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物等体积加入离心管中，混合均匀后，在4℃过夜。次日甩去酶标板孔内的液体，并用PBST洗涤4次，每次洗涤3min，洗涤结束后进行拍干处理。向拍干后的酶标板的每一孔内加100μL的孔封闭液(脱脂奶粉)进行封闭，37℃孵育1h后，用PBST洗涤4次，洗涤结束后进行拍干处理。抗原抗体反应：将离心管中的混合液加入拍干处理后酶标板孔内，每孔100μL，在37℃孵育1h后，用PBST洗涤4次，洗涤结束后进行拍干处理；向拍干的酶标板的孔内加入1:12000稀释度的酶标二抗，每孔100μL，在37℃孵育1h后，用PBST洗涤4次，拍干处理；然后加入TMB单组份显色液，每孔100μL，37℃显色10min后，每孔加入50μL的2mol/L H₂SO₄终止反应。利用酶标仪双波长测定各孔的OD值，实际OD值＝OD₄₀₅-OD₆₂₀。

抗原性的大小用抑制率来表示，抑制率表示样品中β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)抑制兔抗血清与酶标板上包被的β-伴大豆球蛋白标准抗原结合能力的大小，可记为β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)抗原抑制率；抑制率越低，则样品的抗原性越低，二者呈正比关系；计算公式如下：β-伴大豆球蛋白抗原抑制率(％)＝(1-OD/OD₀)×100。其中，OD表示被测样品的吸光值，OD₀为无竞争体系的吸光值。

采用上述测试方法对实施例1-实施例3所制备出的多种甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物进行抗原性测试，测试结果如图1、图2和图3所示。

从图1、图2和图3可以看出：

(1)随着糖基化反应时间的增加，甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物中的β-伴大豆球蛋白抗原抑制率均呈下降趋势，即甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的抗原性降低。

(2)随着糖基化反应温度的增加，甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的β-伴大豆球蛋白抗原抑制率大体上也呈逐渐降低的趋势，即甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的抗原性降低。

(3)当大豆分离蛋白与甘草多糖质量比为3:1时，β-伴大豆球蛋白抗原抑制率降低效果最好，随反应时间的延长，β-伴大豆球蛋白抗原抑制率从89.33％降低到14.44％。

(4)在反应温度为55℃，反应时间为72h时，大豆分离蛋白与甘草多糖质量比1:1、3:1、5:1下，β-伴大豆球蛋白抗原抑制率分别降低到42.73％、14.44％、40.28％。大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比直接影响糖基化反应的进程，适当的大豆分离蛋白与甘草多糖质量比可以提高反应速率。

综上，本发明实施例的最佳的糖基化反应条件：大豆分离蛋白与甘草多糖质量比为3:1，反应温度为55℃，反应时间为72h。

实施例5

本实施例主要是对甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的结构进行测定。

(1)紫外光谱测试：将甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物用Tris-HC缓冲液(50mmol/L，pH 7.0)溶解，得到浓度为0.1％的溶液，然后在190-350nm范围内进行波长扫描，分析蛋白质结构的变化。如图4所示，用紫外光谱分别测定了实施例3中的由第二组冻干粉在55℃制备出的不同反应时间的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物。

从图4可以看出甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的紫外扫描曲线变化相似。与大豆分离蛋白相比，发生了极显著的变化：表现为260-280nm附近基本无吸收峰，210nm附近的吸收峰向短波方向移动，即发生了蓝移。多糖链的引入，易于蛋白质肽链的展开暴露分子内部的氨基酸，其中的助色团与多糖链中的羰基产生共轭，进而所在电子轨道能级有所提高，电子跃迁所需能量变大，引起吸收带蓝移。

(2)红外光谱扫描：将实施例3中的由第二组冻干粉在55℃制备出的不同反应时间的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物样品分别与干燥的溴化钾以1:100混合，用研钵均匀研成粉末，压成薄片后，用傅立叶红外分光光度计作全波段(4000-400cm^-1)扫描，分析蛋白质的二级结构的变化。

傅里叶红外光谱是常用的分析蛋白质结构的方法之一，可以灵敏反应出肽链结构的变化。其中能够反应蛋白质二级结构变化的为蛋白质的特征吸收光谱带酰胺Ⅰ区1600-1700cm^-1范围。1600-1640cm^-1为β-折叠结构；1640-1650cm^-1为无序结构；1650-1660cm^-1为α-螺旋结构；1660-1700cm^-1为β-转角结构。由PeakFit 4.12软件进行去卷积二阶导数拟合分析得糖基化产物的酰胺Ⅰ频率，并计算出蛋白二级结构含量的变化如表1所示。

表1甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物红外光谱扫描

从表1中可知，与大豆分离蛋白相比，甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的α-螺旋、β-折叠、无序结构含量减少，同时β-转角结构含量增加。蛋白的二级结构如β-折叠和α-螺旋结构稍有降低，理论上说由于糖基化反应过程中，随着加热时间的增加，会使蛋白的部分有序结构转变为无序结构；但同时糖基化产物中无序结构的减少以及β-转角结构的增加，蛋白中的无序结构转变为有序结构，使得整体上，糖基化改性后的蛋白质的有序结构增加。可见糖基化反应对蛋白的结构有一定的影响。蛋白质中α-螺旋、β-折叠等结构通常包埋在多肽链的内部，糖的交联导致蛋白分子的展开以及空间结构的改变，进而屏蔽IgE结合表位，改变了大豆分离蛋白的抗原性。

实施例6

本实施例主要测试甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物对幼龄小鼠过敏性腹泻的影响。具体步骤如下：

选取1周龄昆明小鼠140只。喂饲条件：温度18℃，湿度50-70％，自由饮水，随机分为7组，每组20只。其中，第一组中每只小鼠每天灌服100mg的大豆分离蛋白，连续灌服7d。第二组中的每只小鼠每天灌服100mg的由实施例3中第二组冻干粉制备的反应时间为12h的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物，连续灌服7d。第三组中的每只小鼠每天灌服100mg的由实施例3中第二组冻干粉制备的反应时间为24h的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物，连续灌服7d。第四组中的每只小鼠每天灌服100mg的由实施例3中第二组冻干粉制备的反应时间为36h的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物，连续灌服7d。第五组中的每只小鼠每天灌服100mg的由实施例3中第二组冻干粉制备的反应时间为48h的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物，连续灌服7d。第六组中的每只小鼠每天灌服100mg的由实施例3中第二组冻干粉制备的反应时间为60h的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物，连续灌服7d。第七组中的每只小鼠每天灌服100mg的由实施例3中第二组冻干粉制备的反应时间为72h的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物，连续灌服7d。记录小鼠每天的腹泻率及7d后死亡率，如表2所示。

表2 甘草多糖－大豆蛋白偶合物对幼龄小鼠过敏性腹泻的影响

从表2中可以看出：

(1)不同反应时间的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物均不同程度的降低了大豆分离蛋白导致的小鼠过敏性腹泻的发生率。

(2)以糖基化时间60-72h的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物组效果最佳，小鼠的腹泻发生率和死亡率均为最低。

实施例7

蛋白质的乳化性、乳化稳定性、溶解性及热稳定性是影响和评价蛋白质的营养及利用价值的重要指标。

本实施例主要对由实施例3中的将第二组冻干粉所制成的反应时间为72h的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物进行乳化活性、乳化稳定性、溶解性及热稳定性测定，并与大豆分离蛋白的性能进行对比。

第一，乳化活性测试

乳化活性的测定方法为：将甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物和大豆分离蛋白分别溶于0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中，测定溶液的乳化活性。测定结果如图5所示。

从图5可以看出：甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的乳化性明显高于大豆分离蛋白。甘草多糖－大豆蛋白偶合物乳化活性为72.6％，与偶合前大豆蛋白相比提高41.9％。这是由于大豆分离蛋白与甘草多糖发生偶合后，提高了其溶解性，同时偶合后的蛋白侧链残基具有一定的疏水性，从而使得糖基化大豆分离蛋白能够快速较好地吸附在油水界面，显著的提高了大豆蛋白的乳化性。

第二，乳化稳定性测试

乳化稳定性主要指的是蛋白质维持乳状液分散体系而不被破坏的能力。按照常规实验方法测定出甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物和大豆分离蛋白的乳化稳定性，测定结果如图6所示。

从图6可以看出，与大豆分离蛋白相比，甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的乳化稳定性显著提高，提高了18.54％。这是由于甘草多糖的添加，增加油/水乳化系统中水相的黏度，同时也会稍微下降油/水界面张力，从而增加了乳化液的乳化稳定性。大豆分离蛋白与甘草多糖的偶合可以使蛋白质分子展开，暴露出疏水基团，使其有利于吸附到空气－水界面上，提高泡沫的稳定性。

第三，溶解性的测定

将甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物和大豆分离蛋白的溶解性测试结果如图7所示。

从图7可以看出，甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物在较宽的pH条件下具有较好的溶解性，且相对于大豆分离蛋白具有明显的提高。

第四，热稳定性的测定

将甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物、大豆分离蛋白分别溶于0.1mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，在不同温度(25-85℃)中水浴1h，4℃冷却15min，10000×g离心30min。分别测定其热稳定性，结果如图8所示。

从图8可以看出，甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的热稳定性显著高于未偶合大豆分离蛋白。在高于50℃时，甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物还保持着良好的热稳定性，而此时未经糖基化的大豆分离蛋白热稳定性则明显下降。

实施例8

分别制备出以大豆分离蛋白和甘草多糖为溶质，蒸馏水为溶剂的七组溶液，其中第一组溶液的浓度为8％，第二组溶液的浓度为9％，第三组溶液的浓度为10％，第四组溶液的浓度为11％，第五组溶液的浓度为12％，第六组溶液的浓度为13％，第七组溶液的浓度为14％。每一组溶液中的大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为3:1。将七组溶液进行真空冷冻干燥处理，得到七组冻干粉。

将七组冻干粉分别置于锡纸盒中，并将锡纸盒放入干燥器内，使冻干粉中的大豆分离蛋白和甘草多糖在相对湿度为75％(以饱和的溴化钾溶液保持干燥器内的相对湿度为75％)、温度为55℃的条件下进行糖基化反应，反应72h后得到七组的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物。

对七组甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的氨基酸结合率进行测定，测定结果如表3所示。

表3

从表3可以看出，在溶液浓度为11％时，甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的氨基酸结合率最佳。

实施例9

分别制备出以大豆分离蛋白和甘草多糖为溶质，蒸馏水为溶剂的七组溶液，每一组溶液中的大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为3:1。将七组溶液进行真空冷冻干燥处理，得到七组冻干粉。

将七组冻干粉分别置于锡纸盒中，并将锡纸盒放置在不同的干燥器内，使每一组冻干粉中的大豆分离蛋白和甘草多糖在不同的相对湿度(其中，第一组的相对湿度为64％、第二组的相对湿度为66％、第三组的相对湿度为68％、第四组的相对湿度为70％、第五组的相对湿度为72％、第六组的相对湿度为74％、第七组的相对湿度为76％)、温度为55℃的条件下进行糖基化反应，反应72h后得到七组的甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物。

对七组甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的氨基酸结合率进行测定，测定结果如表4所示。

表4

从表4可以看出，在相对湿度为72％的条件下，甘草多糖－大豆分离蛋白偶合物的氨基酸结合率最佳。

综上，本发明实施例采用甘草多糖对大豆分离蛋白进行糖基化改性，制备出一种抗原性低的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。在甘草多糖对大豆分离蛋白偶合物进行糖基化改性反应中，基本不会造成蛋白的营养成分流失，极少产生醛、杂环胺等有害物质产生，安全性高。另外，本发明实施例的甘草多糖与大豆分离蛋白与糖基化反应时间短，只需反应12-72h便可得到抗原性较低的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。本发明实施例所制备的种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物不仅保留了大豆分离蛋白自身的营养成分，还具有甘草多糖的功效(如，提高免疫力)，而且其性能优异与大豆分离蛋白，从而本发明实施例制备的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物用于饲料中时，在一定程度上提高了饲料的营养价值、安全性，并提高动物的免疫力、生长性能及幼龄动物的成活率。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将大豆分离蛋白和甘草多糖加入水中，充分溶解后，得到溶液；

对所述溶液进行冷冻干燥处理，得到冻干粉；

使所述冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应，得到甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。

2.根据权利要求1所述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，其特征在于，所述溶液中的大豆分离蛋白与甘草多糖的质量比为1:1-5：1。

3.根据权利要求1所述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，其特征在于，所述溶液的浓度为8-14％。

4.根据权利要求1所述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，其特征在于，在45-55℃的温度及65-75％的相对湿度的条件下，所述冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应，得到甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物。

5.根据权利要求4所述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，其特征在于，所述冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应的步骤在盛装有饱和的溴化钾溶液的干燥器内进行。

6.根据权利要求4所述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，所述冻干粉中的大豆分离蛋白与甘草多糖进行糖基化反应的时间为12-72h。

7.根据权利要求1所述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物的制备方法，其特征在于，还包括制备甘草多糖的步骤，具体为：

将甘草粉料加入水中，进行超声或/和煎煮处理，得到滤液；

对所述滤液进行浓缩处理，得到浓缩液；

向所述浓缩液中加入乙醇，使浓缩液和乙醇的混合液中析出沉淀；

将所述沉淀进行洗涤、干燥处理，得到甘草粗多糖；

对甘草粗多糖进行去色素、脱蛋白、透析、纯化处理，得到甘草多糖。

8.一种甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物，其特征在于，所述甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物由甘草多糖和大豆分离蛋白经糖基化反应偶合而成。

9.根据权利要求8所述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物，其特征在于，所述甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物由权利要求1-7任一项所述的方法制备而成。

10.根据权利要求8所述的甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物，其特征在于，所述甘草多糖-大豆分离蛋白偶合物用于制备畜禽饲料。