CN103652316A - 高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，涉及一种改性大豆分离蛋白的制备方法。所述制备方法步骤如下：将一定量的大豆分离蛋白和葡萄糖用蒸馏水配制成混合均匀的溶液，控制溶液中蛋白与葡萄糖的质量比为0.5～4∶1，蛋白浓度为8％(w/v)；将上述溶液密封后在70～90℃的条件下进行糖基化反应1～6h。本发明采用湿法糖基化改性来制备高溶解性和乳化性的改性大豆分离蛋白，容易操作，一步处理即可达到效果，节约成本和能源，为拓宽其在食品工业中的应用提供了理论依据。

Description

高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种改性大豆分离蛋白的制备方法，具体涉及一种利用湿热法糖基化改性大豆分离蛋白提高其溶解性和乳化性的方法。

背景技术

大豆分离蛋白(soybean protein isolate，SPI)是以低温豆粕为原料分离提取的一种高纯度植物蛋白质，由于其具有良好的功能性质和较高的营养价值，成为最重要的植物蛋白资源之一。但它常常由于缺乏良好的溶解性及乳化能力使其在某些食品中的应用受到限制，因此为了拓宽大豆分离蛋白的应用范围，需要对其进行改性处理。

蛋白质糖基化改性是以美拉德反应为理论基础的。美拉德反应，又称“非酶褐变反应”，是蛋白质、多肽、氨基酸与还原糖之间的复杂反应。法国生物化学Louis Camile Maillard于1912年发现了该反应，美国化学家Hodge等人于1953年正式将该反应命名为“Maillard(美拉德)反应”，并提出了美拉德反应的网络系统分类图解，系统地阐述了反应机理。

美拉德反应可分为三个阶段：

(a)初级阶段：还原糖(如葡萄糖)的羰基与具有自由氨基的化合物(如氨基酸、蛋白质中赖氨酸侧链上的ε-氨基及末端氨基酸的α-氨基)之间进行加成反应生成N-糖基胺(Glycosilamine)，经Amadori重排形成1-氨基-1-脱氧-2-酮糖。在Amadori产物形成之后，其降解取决于体系的pH值：pH≤7，Amiadori产物在1，2位置上烯醇化产生糠醛或经甲基糠醛(Hydroxymethylfurfural HMF)；pH≥7，Amiadori产物在2，3位置上烯醇化产生还原酮类和一类裂解产物。产生的这些高活性的物质将参与后面阶段的反应。

(b)中级阶段：主要发生Strecker降解。羰基和自由氨基发生缩合反应后，将氮引入终产物中。二羰基化合物继续与氨基酸反应生成醛和α-氨基酮。

(c)高级阶段：成环、脱水、重排、异构等一系列反应均在进行；在最终反应阶段，高级美拉德反应阶段形成的众多活性中间体，又可继续与氨基酸反应，最终都生成类色素-褐色含氮色素，此过程包括醇醛缩合、醛氨聚合、环化合反应等。

目前用于蛋白质改性的方法很多，包括物理改性、化学改性和酶法改性等。糖基化改性是化学改性的一种类型，是蛋白质的ε-氨基酸与多羟基化合物之间发生美拉德反应，生成糖基化蛋白。由于该方法不需要外加化学试剂，是一个自然、自发的反应，因此成为一种理想的改性方法。国内外已有许多学者研究发现经糖基化改性后的蛋白质其溶解性和乳化能力均发生较大改变。Saeki等人在40℃条件下将鱼肌原纤维蛋白与葡萄糖反应12h，它的溶解性得到显著改善；苏志光等人将大豆分离蛋白与甘露聚糖利用干法糖基化生成糖蛋白，经测定其溶解性显著提高。Moreno等人将酪蛋白与乳糖在40℃下进行糖基化反应，其产物的乳化性得到明显改善。赵海贤等人经研究表明在干热条件下生成的大豆分离蛋白与葡聚糖共价结合物的乳化能力显著提升。目前对大豆分离蛋白进行糖基化改性研究主要用干热法制备多糖-蛋白复合物，耗时较长。

发明内容

针对现有大豆分离蛋白功能性比较低的问题，本发明提供一种利用湿热法糖基化改性大豆分离蛋白提高其溶解性和乳化性的方法。

本发明提供的利用湿热法糖基化改性大豆分离蛋白提高其溶解性和乳化性的方法，具体步骤如下：

将一定量的大豆分离蛋白和葡萄糖用蒸馏水配制成混合均匀的溶液，溶液中大豆分离蛋白与葡萄糖的质量比为0.5～4∶1，大豆分离蛋白浓度为8％(w/v)；将上述溶液密封后在70～90℃的条件下进行糖基化反应1～6h，将样品冷冻干燥后置于4℃下保存备用。

研究证明：美拉德反应的程度和温度、时间、系统中的组分及反应物浓度有关。湿热法进行的接枝反应是指蛋白质与糖在溶液的条件下加热进行，一般是单糖或双糖，因此选择葡萄糖这种价格低廉的单糖为反应底物。湿热接枝反应是在一个密闭的装置里放入蛋白质和糖的混合液，水浴或者油浴来控制反应的温度从而调节反应的速度，在温度≤90℃时反应速度较慢，温度≥100℃时较快。当温度≥100℃时，反应速度很快，反应不易控制，并且在工业生产中不易达到温度要求，同时在高温下容易形成蛋白与蛋白的聚合物，从而影响蛋白与糖的反应，因此选择70～90℃。又由于在≤90℃条件下反应速度较慢，因此选择反应时间为1～6h。不同配比的反应底物也会对糖基化反应速度和产物的功能性质产生一定的影响，因此选择多个底物配比进行研究。之前研究表明，在高水分活度食品中，反应底物浓度被稀释，不易发生美拉德反应，但在反应底物浓度较高时，又会由于溶液粘度过高而不易流动，从而影响反应的进行，因此选择蛋白浓度为8％。

201210540762.5公开了一种复合改性制备高效蛋白乳化剂的方法，该方法是利用物理改性(超声波处理)与化学改性(糖基化改性)相结合的方式来制备高效蛋白乳化剂。而本发明中只单一用了湿法糖基化改性来制备高溶解性和乳化性的改性大豆分离蛋白，只经此一种化学改性同样显著改善了大豆分离蛋白的溶解性和乳化性。与201210540762.5相比，本发明优点在于容易操作，一步处理即可达到效果，节约成本和能源，并且超声波处理由于其成本较高，一般在实验室使用，目前工业上还较少使用。同时，本发明与201210540762.5在反应底物的浓度、配比及反应温度和时间范围均有不同。201210540762.5中使用缓冲溶液是要使反应在固定的pH值下进行，而本发明中是在自然条件下研究大豆分离蛋白糖基化改性对其溶解性和乳化性的影响，本发明使用去离子水同时也是为了排除离子对糖基化反应的影响。

本发明通过测定各糖基化产物的溶解度、乳化活性和乳化稳定性，研究糖基化温度和时间、蛋白-葡萄糖质量比对大豆分离蛋白溶解性和乳化能力的影响。结果表明：蛋白与葡萄糖质量比为1∶2，反应温度为80℃，反应时间为2h制得的糖基化大豆分离蛋白的溶解度最高，高达92.93％，是未改性SPI的4.38倍；蛋白与葡萄糖质量比为1∶1，反应温度为90℃，反应时间为6h制得的糖基化大豆分离蛋白的乳化活性最高，高达0.63，是未改性SPI的3.94倍；蛋白与葡萄糖质量比为1∶2，反应温度为90℃，反应时间为3h制得的糖基化大豆分离蛋白的乳化稳定性最高，高达50.92，是未改性SPI的1.98倍。糖基化改性可显著提高大豆分离蛋白的溶解性和乳化性能，这为拓宽其在食品工业中的应用提供了理论依据。

附图说明

图1为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(4∶1)对大豆分离蛋白溶解性的影响；

图2为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(2∶1)对大豆分离蛋白溶解性的影响；

图3为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(1∶1)对大豆分离蛋白溶解性的影响；

图4为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(1∶2)对大豆分离蛋白溶解性的影响；

图5为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(4∶1)对大豆分离蛋白乳化活性的影响；

图6为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(2∶1)对大豆分离蛋白乳化活性的影响；

图7为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(1∶1)对大豆分离蛋白乳化活性的影响；

图8为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(1∶2)对大豆分离蛋白乳化活性的影响；

图9为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(4∶1)对大豆分离蛋白乳化稳定性的影响；

图10为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(2∶1)对大豆分离蛋白乳化稳定性的影响；

图11为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(1∶1)对大豆分离蛋白乳化稳定性的影响；

图12为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(1∶2)对大豆分离蛋白乳化稳定性的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明利用湿热法制备葡萄糖-SPI复合物，通过测定产物的溶解度、乳化活性和乳化稳定性，研究糖基化温度和时间、蛋白与葡萄糖质量比对大豆分离蛋白溶解性和乳化能力的影响，确定最佳工艺条件。

1、材料与方法

1.1材料与试剂

大豆分离蛋白(蛋白含量≥90％)：哈尔滨高科大豆食品公司；九三非转基因大豆油：九三集团哈尔滨惠康食品有限公司；牛血清白蛋白：Sigma公司；SDS：Solarbio公司；葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

AL-104型精密电子天平：上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司；DK-8B型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；QT-1旋涡混合器：上海琪特分析仪器有限公司；TGL-16C型高速离心机：上海安亭科学仪器厂；721型可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；T18高速匀浆机：德国IKA公司。

1.3试验方法

1.3.1糖基化大豆分离蛋白的制备

将一定量的大豆分离蛋白和葡萄糖用蒸馏水配制成混合均匀的溶液，溶液中蛋白与葡萄糖的质量比分别为4∶1、2∶1、1∶1、1∶2，其中蛋白浓度为8％(w/v)。将上述溶液用保鲜膜密封放置在70℃、80℃和90℃的恒温水浴锅中进行糖基化反应，分别在反应开始的0、1、2、3、4、5、6h取出一定量的样品，将样品冷冻干燥后置于4℃下保存备用。双缩脲法测定样品中蛋白质含量。

1.3.2糖基化大豆分离蛋白溶解性的测定

参照孙焕等人的双缩脲法，并稍作修改。将制备得到的样品配制成蛋白浓度1％(w/v)的溶液，充分搅拌后，3000r/min离心30min，取上清液1mL于试管中，加入双缩脲试剂4mL，振荡后放置30min，于540nm处进行比色测定，根据标准曲线计算出上清液中蛋白含量。

1.3.3糖基化大豆分离蛋白乳化能力的测定

参照Tang等人的浊度法，并稍作修改。将样品溶于0.2mol/L(pH7.0)的磷酸盐缓冲溶液中，使蛋白浓度为1mg/mL，将2mL大豆油和8mL样品溶液放入直径为2.5cm的塑料离心管中高速匀浆1min，分别于0和10min从离心管底部吸取50μL匀浆液加入到5mL0.1％SDS溶液中，振荡混匀后在500nm处测定吸光值，记作A₀和A₁₀。用0.1％SDS溶液作为空白对照。用零时刻的吸光值A₀表示乳化活性(emulsifyingactivity，EA)，乳化稳定性(emulsifying stability，ES)用如下公式表示：

$\mathrm{ES}=\frac{A_0\×10}{A_0-A_{10}}.$

1.4统计分析

每个试验平行三次。数据统计分析采用Statistix8.1(分析软件，StPaul，MN)软件进行，使用Tukey HSD程序进行差异显著性(P＜0.05)分析，采用Sigmaplot10.0软件作图。

2、结果与讨论

2.1糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比对大豆分离蛋白溶解性的影响

溶解性是大豆分离蛋白最主要的功能特性之一，是其可应用性、应用的范围、提取及加工工艺条件等的前提和基础。从图1-4中可以看出，与未改性SPI相比，制得的所有的糖基化SPI的溶解性均显著提高(P＜0.05)。这与Achouri等人的研究结果相符，他们研究发现经糖基化改性的11S大豆球蛋白与未改性大豆蛋白相比溶解度增幅较大。这是由于经糖基化反应后含有多亲水羟基的糖链被引入，使得亲水基团数目增多，从而提高了SPI的溶解性。

从图1-4中还可以看出，在一定的加热时间内，糖基化反应温度越高，产物的溶解性越好。这可能是由于反应温度越高，糖基化反应的速度越快，在相同的反应时间内，SPI结合的亲水糖链越多。

姜元荣等人认为蛋白质与糖的比列是影响蛋白聚糖溶解性的主要因素。图1和图2中三个温度反应体系产物的溶解度随着加热时间的延长而不断提高，但图3和图4中的则呈现先上升后下降的趋势，并且随着葡萄糖比列的不断增大，溶解度提升的幅度越大，蛋白与葡萄糖之比4∶1、2∶1、1∶1、1∶2体系中SPI的溶解度分别从21.23％最高提升到38.7％、78.13％、85％、92.93％。这是因为当反应体系中糖含量增多时，在单位体积内每个蛋白质分子可接触的糖分子数量增多，为加快糖基化反应创造了条件，这样可以提高糖蛋白的生成量和生成速率，但是反应过快，会在短时间内产生不溶副产物，并且糖分子消耗完后，在高温下蛋白与蛋白之间会聚合形成大分子物质，这些都会导致溶解度的下降，从而出现了先上升后下降的趋势。

2.2糖基化改性对大豆分离蛋白乳化性能的影响

乳化性是指将油和水混合在一起形成乳状液的性能。蛋白质具有两亲性质，既能亲水又能亲油，可以快速吸附在油水界面上，是优良的乳化剂。但由于大豆分离蛋白为球状蛋白，通常在水中的溶解性不好，大多疏水基团不能暴露，影响了SPI的乳化性能，限制了其在一些食品中的应用。糖基化改性可以使蛋白分子结构改变较小的情况下，尽可能多的增加蛋白中亲水性基团的数量，使蛋白达到更好的亲水亲油性的平衡，提高SPI的乳化性能。

2.2.1糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比对大豆分离蛋白乳化活性的影响

乳化活性(emulsifying activity，EA)是指蛋白质参与乳浊液形成的能力。图5-8反映了糖基化反应条件对糖基化SPI乳化活性的影响。从该图中可以看出，经糖基化反应后的SPI，乳化活性显著提高(P＜0.05)。Nri等曾研究发现，大豆蛋白乳化性的增加与蛋白质溶解性增加、溶液粘度增加、疏水性基团暴露程度增加等因素有关。所以糖基化SPI乳化活性的提高是由于通过糖基化反应，SPI与葡萄糖发生相互作用，使其溶解性提升，同时使SPI球状分子伸展，疏水基团暴露，并且葡萄糖的加入增加了溶液的粘度。从图中还可以发现，仅添加糖而未进行加热的葡萄糖-SPI混合物的乳化活性几乎没有提高甚至降低。这与齐军茹等人的研究结果一致，他们研究发现未经加热的葡聚糖与SPI混合物的乳化活性比原SPI的低。这可能是由于混合物未经加热不能使亲水基团结合到SPI上，但亲水葡萄糖的存在又影响了SPI在油水界面的吸附。

从图5-8中均可以看出，在同一底物比例和糖基化反应时间下，糖基化反应温度越高，其产物的乳化活性提高幅度越大(蛋白与葡萄糖质量比为1∶2，在90℃下反应6h的产物除外)。

同时，除蛋白与葡萄糖质量比为1∶2的混合物随着加热时间的延长，其产物乳化活性呈现先上升后趋于平稳或下降的趋势外，图5-7中三个反应体系产物的乳化活性均随着反应时间的延长而不断增加，并且随着葡萄糖比重的不断加大，产物乳化活性增加更为显著，蛋白与葡萄糖之比4∶1、2∶1、1∶1体系中SPI的乳化活性分别从0.16最高提升到0.57、0.57、0.63。得到这一结果可能是因为在底物比例适当时，随着反应的不断进行有更多的亲水基团引入到SPI上，并暴露出更多的疏水基团来维持表面活性，使得乳化活性提高。但葡萄糖比重继续加大，糖基化反应到一定程度后，过量的糖分子基团可能会影响SPI在油水界面的吸收及内部的展开和复位，降低乳化活性。

2.2.2糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比对大豆分离蛋白乳化稳定性的影响

乳化稳定性(emulsifying stability，ES)是指乳化液滴保持分散，在一定时间内没有发生脂肪上浮、絮凝和聚沉的能力。图9-12中反映了糖基化反应条件对糖基化SPI乳化稳定性的影响，从该图中可以看出，所有条件下的糖基化SPI的乳化稳定性均得到显著提高(P＜0.05)。蛋白在与糖反应后，亲水性增强，同时糖链的空间位阻效应，可以有效地阻止油相的聚集；并且添加糖不仅可增加油/水乳化系统中水相的黏度，还会稍微下降油/水界面张力，从而SPI的乳化稳定性得到提高。

从图9-12中还可以发现，随着糖基化反应时间的延长，产物的乳化稳定性都呈现先上升后下降的趋势；在一定反应时间内，加热温度越高，乳化稳定性提升越大；并且蛋白与葡萄糖之比4∶1、2∶1、1∶1、1∶2体系中产物的乳化稳定性分别从25.75最高提升到39.6、41.96、50.39、50.92。得到以上结果是由于随着糖量的增加、糖基化反应的不断进行，SPI带有的静电荷增多，静电排斥作用增强，使其分散较好，油水界面形成较后的保护层，并且糖的添加还可增强溶液的黏度，从而增加其乳化稳定性；但随着反应时间的进一步延长，由于葡萄糖分子量较小，其与SPI的糖基化产物不能提供足够的空间稳定作用^[19]，使乳化稳定性下降，并且高温条件下在反应后期产生的蛋白聚合物、不溶副产物，也会降低溶液的乳化稳定性。

3、结论

通过对个反应体系糖基化大豆分离蛋白溶解度、乳化活性和乳化稳定性的研究发现，糖基化改性可显著提高SPI的溶解性和乳化能力。结果表明：(1)蛋白与葡萄糖质量比为1∶2，反应温度为80℃，反应时间为2h制得的糖基化大豆分离蛋白的溶解度最高，是未改性SPI的4.38倍；(2)蛋白与葡萄糖质量比为1∶1，反应温度为90℃，反应时间为6h制得的糖基化大豆分离蛋白的乳化活性最高，是未改性SPI的3.94倍；(3)蛋白与葡萄糖质量比为1∶2，反应温度为90℃，反应时间为3h制得的糖基化大豆分离蛋白的乳化稳定性最高，是未改性SPI的1.98倍。这为糖基化大豆分离蛋白应用于不同的食品体系提供了理论支持。

Claims (5)

1.高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于所述制备方法步骤如下：将一定量的大豆分离蛋白和葡萄糖用蒸馏水配制成混合均匀的溶液，控制溶液中大豆分离蛋白与葡萄糖的质量比为0.5～4∶1；将上述溶液密封后在70～90℃的条件下进行糖基化反应1～6h。

2.根据权利要求1所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于所述大豆分离蛋白浓度为8％(w/v)。

3.根据权利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于所述大豆分离蛋白与葡萄糖质量比为1∶2，反应温度为80℃，反应时间为2h。

4.根据权利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于所述大豆分离蛋白与葡萄糖质量比为1∶1，反应温度为90℃，反应时间为6h。

5.根据权利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于所述大豆分离蛋白与葡萄糖质量比为1∶2，反应温度为90℃，反应时间为3h。

Images