CN101361532A - 一种复合蛋白起泡剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种复合蛋白起泡剂的制备方法，属于食品生物技术领域。本发明以大豆分离蛋白、小麦面筋蛋白、大米蛋白以及乳清蛋白为原料，分别采用碱性蛋白酶Alcalase将其适度水解，水解液按一定比例混合后进行超滤获得10kDa以上分子量的蛋白肽段，采用疏水性分级分离后获得不同疏水性的肽段，再通过谷氨酰胺转移酶(TGase)交联将不同疏水性蛋白肽段进行重组，交联产物经浓缩、冷冻干燥，得到复合蛋白起泡剂。本发明涉及蛋白质结构与功能性质的改造，制备的产品起泡能力和泡沫稳定性均好于蛋清蛋白，起泡能力比蛋清蛋白提高10％～30％。本发明将有力促进天然食品起泡剂在食品加工中的广泛应用和大大提高各类低值蛋白资源的利用率和附加值，将产生很好的经济效益。

Description

一种复合蛋白起泡剂的制备方法

技术领域

本发明提供了一种复合蛋白起泡剂的制备方法，涉及蛋白质结构与功能性质的改造，属于食品生物技术领域。

背景技术

大豆蛋白、小麦面筋蛋白和大米蛋白是食品加工工业中常用的原料，资源丰富，品质优良，价格低廉，胆固醇较低，具有较高的营养价值，但目前国内，此类蛋白的应用都是集中在附加值相对比较低的场合，而附加值略高的食品蛋白类配料功能产品较少，分析造成这种局面的主要原因是此类蛋白尽管价格便宜，也具有一定的功能性质，但是各种性质例如乳化性、胶凝性、起泡性等与动物源蛋白如酪蛋白、肌纤维蛋白、蛋清蛋白等天然优良性能的蛋白质相比，仍然有相当大的差距，导致其在现代食品加工中的应用受到一定限制。

大豆分离蛋白、小麦面筋蛋白和大米蛋白与蛋清蛋白相比具有较差的起泡性，在起泡性能方面的应用也远远不及蛋清蛋白。蛋清蛋白作为起泡性能最佳的蛋白起泡剂在蛋糕等焙烤类食品中的应用相当普遍。但是，蛋清蛋白中含有较多的胆固醇，并且蛋清蛋白价格远高于一般的谷物蛋白，因此改善大豆、小麦和大米等谷物蛋白的起泡性与泡沫稳定性具有重要的社会意义和经济意义。

对于大豆蛋白、小麦蛋白等谷物蛋白的结构改造以及进一步提高功能性质的研究一直是国内外研究的热点。目前谷物蛋白质的改性方法主要有物理改性、化学改性、酶法改性以及生物工程改性。酶法改性技术是利用蛋白酶内切作用及外切作用将蛋白分子切割成较小分子，使其蛋白功能特性有所改变。同物理、化学改性相比，酶法改性由于具有反应条件相对温和、反应进程及结果可控等多方面的优点而愈加受到重视。目前，许多研究者使用单一或复合蛋白酶对蛋白进行水解，以期改善蛋白的起泡性，如专利CN101011101A(改善蛋白质的起泡性的方法)采用米曲蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶水解大豆蛋白，起泡性比未处理前提高了83.3％。专利CN1944662A(一种应用于啤酒的泡沫活性蛋白的制备与应用方法)采用蛋白酶水解大豆蛋白、小麦蛋白、大米蛋白和乳清蛋白，并经过超滤方法获得起泡性较好的蛋白组合物。但前人研究表明，酶法水解虽然可使得蛋白质构象展开，显著提高蛋白的起泡能力，但同时也会降低其泡沫稳定性。一般来说，提高起泡特性既要提高其起泡能力又要提高其泡沫稳定性，而对于蛋白质来说，提高其泡沫稳定性更有意义。有报道表明采用谷氨酰胺转移酶(TGase)进行交联，可以显著提高蛋白质的泡沫稳定性。另外，许多研究也表明，疏水性与蛋白质的功能性质有显著联系，由于蛋白质具有四级结构，其具有疏水性的残基原则上处于分子内部，但并不是绝对的，严格地说，整个蛋白质分子由里到外，疏水性残基是逐渐减少的。而肽段具有更少的氨基酸序列，限制了蛋白质分子的折叠，使得更多的具有疏水性的氨基酸残基暴露在外，增大了表面疏水性。表面疏水性与表面张力、乳化性、起泡性都有密切的关系，而且高的表面疏水性可以使得粘度升高分散性变好，而这些都是好的起泡性的适应条件，因此，表面疏水性对于提高蛋白的起泡性和乳化性有很重要的意义。

关于大豆蛋白、小麦蛋白、大米蛋白和乳清蛋白起泡性质的改良，前人大部分研究集中在只使用蛋白酶水解或只使用TGase交联，起泡能力和泡沫稳定性并没有同时得到明显的改善。因此，通过控制疏水性对于蛋白起泡性的影响，先将蛋白质水解，水解液根据分子量和疏水性分级分离，再采用TGase对不同疏水性肽段进行交联，制备复合蛋白起泡剂，以实现更加有目的性地对蛋白质进行改性，大幅度提高蛋白质的起泡性和泡沫稳定性，为谷物蛋白的结构与功能性质改造方法提供新思路，拓宽其在现代食品加工中的应用。目前还尚未有将大豆蛋白、小麦蛋白、大米蛋白等混合蛋白水解物按照疏水性分级和进行TGase交联制备复合起泡剂产品的报道。

发明内容

本发明的目的：就是提出一种复合蛋白起泡剂的制备方法。以大豆分离蛋白、小麦面筋蛋白、大米蛋白以及乳清蛋白为原料，采用酶法水解各类蛋白，并通过超滤方法，从各类蛋白混合水解液中获得10kDa以上分子量的蛋白肽段，经疏水性分离分级后，不同疏水性肽段再经酶法交联，得到高起泡性和泡沫稳定性的复合蛋白起泡剂产品，提高谷物类蛋白产品的附加值，以拓宽其在现代食品加工中的应用。

本发明的技术方案：一种复合蛋白起泡剂的制备方法，以大豆分离蛋白、小麦面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白为原料，先用碱性蛋白酶Alcalase将各类蛋白分别水解，然后通过超滤方法从各类蛋白混合水解液中获得10kDa以上分子量的蛋白肽段，经疏水性分级分离后，再通过谷氨酰胺转移酶(TGase)对不同疏水性肽段进行交联重组，交联后的产物经浓缩、冷冻干燥，得到复合蛋白起泡剂产品，步骤为：

(1)蛋白质的水解

将大豆分离蛋白、小麦面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的蛋白质分别进行水解：各类蛋白加水搅拌溶解，配成80g/L的蛋白溶液，用1mol/L NaOH溶液调整pH值至8.0，温度保持55℃，加入溶液体积量0.2％的碱性蛋白酶Alcalase进行水解反应，期间维持蛋白溶液pH值8.0，当蛋白水解度达到3％时终止反应，水解液在沸水浴中加热15min灭酶，经5000r/min离心20min后收集上清液；

(2)蛋白水解液的超滤

将大豆分离蛋白、小麦面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的水解液按体积比3∶3∶3∶1混合，使用截留分子量为10kDa的聚砜超滤膜将混合蛋白水解液进行超滤，收集截留部分，获得分子量大于10kDa的混合蛋白水解肽液；

(3)分子量大于10kDa的混合蛋白水解液的疏水性分级

使用超纯水将C18柱浸润充满，将分子量大于10kDa的混合蛋白水解肽液上柱进行分离，肽液每次上样200mL，待肽液充满C18柱之后，使用600mL超纯水清洗，流速2mL/min，收集流出液旋转蒸发即得亲水性肽段；再用600mL甲醇清洗，流速2mL/min，收集流出液旋转蒸发即得疏水性肽段；

(4)不同疏水性肽段的酶法交联

将分级得到的疏水性肽段和亲水性肽段按重量比1∶1混合作为酶反应底物，底物多肽含量为50g/L，往底物溶液中加入3～5g/L的谷氨酰胺转移酶进行交联反应，反应温度为40～45℃、pH6.0～6.5，反应2～4h后，放置80℃水浴中保温30min灭酶，然后在25℃水浴中冷却，交联产物经真空浓缩、冷冻干燥后得到复合蛋白起泡剂产品，测得产品的起泡能力比蛋清蛋白提高了10％～30％。

所述的真空浓缩处理是45～50℃的真空浓缩，所述的冷冻干燥处理是在-50～-55℃温度下的冷冻干燥。

水解用的碱性蛋白酶Alcalase的酶活单位为400000u/mL，交联所用的谷氨酰胺转移酶的酶活单位为100u/g。

蛋白质的起泡能力和泡沫稳定性的测定是按如下方法进行：将10g/L的蛋白溶液100mL置于500mL量筒(口径6cm，高为20cm)中，使用高速乳化均质机以17500r/min的转速均质40s，连续3次共计2min，记录均质后液面高度并计算溶液体积为V₀(mL)，静置30min后记录液面高度并计算溶液体积为V_30min(mL)。蛋白的起泡能力(FC)和泡沫稳定性(FS)的计算公式分别为：

$\mathrm{FC}(\%)=\frac{V_0-100}{100}\×100\%;$ $\mathrm{FS}(\%)=\frac{V_{30\min }-100}{V_0-100}\×100\%.$

本发明的有益效果：本发明提供了一种复合蛋白起泡剂的制备方法。通过对各类谷物蛋白进行酶法改性，大幅度提高了蛋白的起泡性和泡沫稳定性，为谷物蛋白的结构与功能性质改造方法提供了新思路，提高了低值植物蛋白产品的附加值，拓宽了谷物蛋白在现代食品加工中的应用，具有很好的市场前景和经济效益。

本发明制备的复合蛋白起泡剂，起泡能力和泡沫稳定性远好于蛋清蛋白，而且比蛋清蛋白具有价格优势，可以替代蛋清蛋白广泛应用于食品加工中，并且大豆蛋白、小麦蛋白、大米蛋白及乳清蛋白改性组成的复合蛋白起泡剂天然、营养，食用安全性好。

本发明方法可以适用于其它一些植物蛋白的结构与功能性质的改造，这对于高效利用植物蛋白资源生产高附加值产品和促进农业经济发展都具有积极和重要的现实意义。

具体实施方式

对照实施例

准确称取蛋清蛋白1g，加水搅拌溶解，配成1％(w/v)的蛋白溶液，经测试，蛋清蛋白的起泡能力为240％，泡沫稳定性为95％。

实施例1

准确称取大豆分离蛋白50g，加水搅拌溶解，配成80g/L的蛋白溶液，用1mol/L NaOH溶液调整pH值至8.0，温度保持在55℃，加入溶液体积量0.2％的碱性蛋白酶Alcalase进行水解反应，期间维持蛋白溶液pH值8.0，当蛋白水解度达到3％时，终止反应，水解液在沸水浴中加热15min灭酶，经5000r/min离心20min后收集上清液。小麦面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的水解操作步骤同大豆分离蛋白。

将大豆分离蛋白、小麦面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的水解液按3∶3∶3∶1(v/v/v/v)混合，使用截留分子量为10kDa的聚砜超滤膜将混合蛋白水解液进行超滤，收集截留部分，获得分子量大于10kDa的蛋白肽段。

使用超纯水将实验室自组装的C18柱浸润充满，将分子量大于10kDa的混合蛋白水解肽液上C18柱进行疏水性分离，肽液上样量为200mL，待肽液充满C18柱之后，使用600mL超纯水清洗，流速2mL/min，收集流出液旋转蒸发即得亲水性肽段，超纯水清洗过后使用600mL甲醇清洗，流速2mL/min，收集流出液旋转蒸发即得疏水性肽段。

将分级得到的疏水性肽段和亲水性肽段按1∶1(w/w)混合作为酶反应底物，底物多肽含量为50g/L，往底物溶液中加入3g/L的TGase进行交联反应，反应温度为40℃、pH6.0，反应2h后，放置80℃水浴中保温30min灭酶，然后在25℃水浴中冷却，交联产物经45～50℃真空浓缩、在-50～-55℃温度下冷冻干燥后得到复合蛋白起泡剂产品，测得交联后产物的起泡能力为265％，泡沫稳定性为91％，起泡能力比蛋清蛋白提高了10％。

实施例2

按实施例1的操作步骤制备得到分级的疏水性肽段和亲水性肽段。

将分级得到的疏水性肽段和亲水性肽段按1∶1(w/w)混合作为酶反应底物，底物多肽含量为50g/L，往底物溶液中加入4g/L的TGase进行交联反应，反应温度为40℃、pH6.5，反应3h后，放置80℃水浴中保温30min灭酶，然后在25℃水浴中冷却，交联产物经45～50℃真空浓缩、在-50～-55℃温度下冷冻干燥后得到复合蛋白起泡剂产品，测得交联后产物的起泡能力为284％，泡沫稳定性为96％，起泡能力比蛋清蛋白提高了18％。

实施例3

按实施例1的操作步骤制备得到分级的疏水性肽段和亲水性肽段。

将分级得到的疏水性肽段和亲水性肽段按1∶1(w/w)混合作为酶反应底物，底物多肽含量为50g/L，往底物溶液中加入4g/L的TGase进行交联反应，反应温度为45℃、pH6.5，反应3.5h后，放置80℃水浴中保温30min灭酶，然后在25℃水浴中冷却，交联产物经45～50℃真空浓缩、在-50～-55℃温度下冷冻干燥后得到复合蛋白起泡剂产品，测得交联后产物的起泡能力为293％，泡沫稳定性为97％，起泡能力比蛋清蛋白提高了22％。

实施例4

按实施例1的操作步骤制备得到分级的疏水性肽段和亲水性肽段。

将分级得到的疏水性肽段和亲水性肽段按1∶1(w/w)混合作为酶反应底物，底物多肽含量为50g/L，往底物溶液中加入5g/L的TGase进行交联反应，反应温度为45℃、pH6.0，反应4h后，放置80℃水浴中保温30min灭酶，然后在25℃水浴中冷却，交联产物经45～50℃真空浓缩、在-50～-55℃温度下冷冻干燥后得到复合蛋白起泡剂产品，测得交联后产物的起泡能力为312％，泡沫稳定性为99％，起泡能力比蛋清蛋白提高了30％。

实施例5

按实施例1的操作步骤制备得到分级的疏水性肽段和亲水性肽段。

将分级得到的疏水性肽段和亲水性肽段按1∶1(w/w)混合作为酶反应底物，底物多肽含量为50g/L，往底物溶液中加入5g/L的TGase进行交联反应，反应温度为40℃、pH6.5，反应3h后，放置80℃水浴中保温30min灭酶，然后在25℃水浴中冷却，交联产物经45～50℃真空浓缩、在-50～-55℃温度下冷冻干燥后得到复合蛋白起泡剂产品，测得交联后产物的起泡能力为303％，泡沫稳定性为98％，起泡能力比蛋清蛋白提高了26％。

Claims (3)

1.一种复合蛋白起泡剂的制备方法，其特征是以大豆分离蛋白、小麦面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白为原料，先用碱性蛋白酶Alcalase将各类蛋白分别水解，然后通过超滤方法从各类蛋白混合水解液中获得10kDa以上分子量的蛋白肽段，经疏水性分级分离后，再通过谷氨酰胺转移酶对不同疏水性肽段进行交联重组，交联后的产物经浓缩、冷冻干燥得到复合蛋白起泡剂产品，步骤为：

(1)蛋白质的水解

将大豆分离蛋白、小麦面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的蛋白质分别进行水解：各类蛋白加水搅拌溶解，配成80g/L的蛋白溶液，用1mol/L NaOH溶液调整pH值至8.0，温度保持55℃，加入溶液体积量0.2％的碱性蛋白酶Alcalase进行水解反应，期间维持蛋白溶液pH值8.0，当蛋白水解度达到3％时终止反应，水解液在沸水浴中加热15min灭酶，经5000r/min离心20min后收集上清液；

(2)蛋白水解液的超滤

将大豆分离蛋白、小麦面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的水解液按体积比3∶3∶3∶1混合，使用截留分子量为10kDa的聚砜超滤膜将混合蛋白水解液进行超滤，收集截留部分，获得分子量大于10kDa的混合蛋白水解肽液；

(3)分子量大于10kDa的混合蛋白水解液的疏水性分级

使用超纯水将C18柱浸润充满，将分子量大于10kDa的混合蛋白水解肽液上柱进行分离，肽液每次上样200mL，待肽液充满C18柱之后，使用600mL超纯水清洗，流速2mL/min，收集流出液旋转蒸发即得亲水性肽段；再用600mL甲醇清洗，流速2mL/min，收集流出液旋转蒸发即得疏水性肽段；

(4)不同疏水性肽段的酶法交联

将分级得到的疏水性肽段和亲水性肽段按重量比1∶1混合作为酶反应底物，底物多肽含量为50g/L，往底物溶液中加入3～5g/L的谷氨酰胺转移酶进行交联反应，反应温度为40～45℃、pH 6.0～6.5，反应2～4h后，放置80℃水浴中保温30min灭酶，然后在25℃水浴中冷却，交联产物经真空浓缩、冷冻干燥后得到复合蛋白起泡剂产品，测得产品的起泡能力比蛋清蛋白提高了10％～30％。

2.根据权利要求1所述的复合蛋白起泡剂的制备方法，其特征是所述的真空浓缩处理是45～50℃的真空浓缩，所述的冷冻干燥处理是在-50～-55℃温度下的冷冻干燥。

3.根据权利要求1所述的复合蛋白起泡剂的制备方法，其特征是水解用的碱性蛋白酶Alcalase的酶活单位为400000u/mL，交联所用的谷氨酰胺转移酶的酶活单位为100u/g。