CN108299528B - 一种金线莲苷的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物有效成分提取领域，具体涉及一种金线莲苷的提取方法。本发明采用超声波辅助法进行提取，超高效液相色谱方法测定含量，并利用响应面法对提取工艺进行优化。本发明得出最佳提取工艺条件为：温度为35.00℃，甲醇浓度为16.33%，料液比为1:10.83，在此条件下，金线莲苷提取率达到33%DW。

Description

一种金线莲苷的提取方法
技术领域
本发明涉及植物有效成分提取领域，具体涉及一种金线莲苷的提取方法。
背景技术
金线莲为兰科植物花叶开唇兰Anoectochilusroxburghii(Wall)Lindl，味甘，性寒，归肺、肝、肾、膀胱经，具有清热凉血，祛风利湿，解毒的功效，主治肺热咳嗽，咯血，尿血，小儿急惊风，黄疸，水肿，淋证，消渴，风湿痹痛，跌打损伤，毒蛇咬伤，现代用于肝炎，肾炎，膀胱炎，糖尿病，支气管炎，风湿性关节炎等病。金线莲主要分布在我国的福建、台湾、云南等省，在印度、日本、尼泊尔和斯里兰卡等国也有分布。金线莲其主要成分为糖苷、生物碱、甾体、黄酮、牛磺酸、氨基酸、微量元素等。具相关文献表明金线莲能直接作用于肝细胞膜，保护肝细胞膜的完整，防止有害物质破坏肝细胞膜，并防止肝细胞之病变性坏死。而起到这种作用的物质主要为金线莲苷，同时金线莲苷也为花叶开唇兰的特有化合物。
张超等(《HPLC-ELSD法测定三种植物基原金线莲的金线莲苷含量》)研究33批次金线莲的金线莲苷含量在6.37％～22.66％之间，平均含量为15.00％。张锦文等(《高效液相色谱法测定金线莲中金线莲苷的含量》中公开了提取获得的野生金线莲中金线莲苷含量为16.57％，目前来看关于金线莲苷的具体提取工艺的报道，提取率都比较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金线莲苷的提取方法。本发明采用超声波辅助法进行提取，超高效液相色谱方法测定含量，并利用响应面法对提取工艺进行优化。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
所述金线莲苷的提取方法，具体为：
(1)将金线莲冻干粉末0.5g按1:20料液比用2mL甲醇溶解，在功率为420W，温度为30℃条件下超声波辅助提取45min，离心(10000rpm/min,10min)后吸取上清液，重复2次，合并上清液，用甲醇定容至2ml。过0.22μm滤膜，放入棕色色谱瓶中待用。
(2)金线莲植株冻干粉末分别对提取液甲醇浓度、料液比、超声功率、时间、温度和提取次数等单因素进行优化，各因素水平设计见表1。
表1 单因素试验设计
Figure BDA0001558988900000021
(3)通过响应面法设计试验最终确定金线莲苷的提取工艺参数。
本发明的显著优点在于：
本发明采用超声波辅助法进行提取，超高效液相色谱方法测定含量，并利用响应面法对提取工艺进行优化。结果表明，甲醇浓度为20％，超声波功率360W，料液比为1:15，在40℃下超声20min并提取2次，是单因素试验的最佳结果。为研究各工艺参数之间的交互作用对金线莲苷得率的影响，选用中心复合模型，采用3因素3水平共17个试验点(5个中心点用以估计试验误差)的响应面分析试验，将所得的数据用Design-Expert 8.0软件进行分析，以超声温度(A)、甲醇浓度(B)和料液比(C)为自变量，以金线莲苷的得率(％)为响应值，经回归拟合得到二次回归方程Y＝30.31-3.11A-1.69B-2.26C-0.082AB+1.95AC+0.94BC-7.64A2-3.80B2-0.038C2。方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对指标值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。由此得出最佳提取工艺条件为：温度为35.00℃，甲醇浓度为16.33％，料液比为1:10.83，在此条件下，金线莲苷提取率达到33％DW。
附图说明
图1为料液比对金线莲苷提取得率的影响(图中不同字母表示差异显著(P<0.05))；
图2为超声温度对金线莲苷提取得率的影响(图中不同字母表示差异显著(P<0.05))；
图3为超声时间对金线莲苷提取得率的影响(图中不同字母表示差异显著(P<0.05))；
图4为超声功率对金线莲苷提取得率的影响(图中不同字母表示差异显著(P<0.05))；
图5为甲醇浓度对金线莲苷提取得率的影响(图中不同字母表示差异显著(P<0.05))；
图6为超声温度和甲醇浓度交互影响的响应面图；
图7为超声温度和甲醇浓度交互影响的等高线图；
图8为料液比和超声温度交互影响的响应面图；
图9为料液比和超声温度交互影响的等高线图；
图10为料液比和甲醇浓度交互影响的响应面图；
图11为料液比和甲醇浓度交互影响的等高线图。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
1材料和方法
1.1材料
金线莲材料(品种为贡享2号)由福建贡享生态农业科技有限公司提供，经福建农林大学园艺学院鉴定，鲜样于2016年11月份采摘，经冷冻干燥机干燥后，用粉碎机粉碎，过40目筛得金线莲药材粉末，保存于-40℃冰箱内备用。金线莲苷对照品98％，购自美国Amresco公司。
1.2试剂及仪器
乙腈和甲醇均为色谱级溶剂、超纯水、Waters Acquity超高效液相色谱(色谱柱为C18，17μm，2.1*100mm)、FW200型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)、低温离心机(Eppendorf 5430R，德国)、KQ-600DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、AKWL-IV-50艾柯超纯水系统(成都康氏康宁科技发展有限公司)、BS214D电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、LGJ-S24型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)。
1.3金线莲苷的提取制备
将金线莲冻干粉末0.5g按1:20料液比用2mL甲醇溶解，在功率为420W，温度为30℃条件下超声波辅助提取45min，离心(10000rpm/min,10min)后吸取上清液，重复2次，合并上清液，用甲醇定容至2ml。过0.22μm滤膜，放入棕色色谱瓶中待用。
1.4测定方法
1.4.1色谱条件的选择
测定金线莲苷的色谱条件：采用超高效液相色谱进行优化，以C18(17μm，2.1*100mm)为色谱柱；流动相为水：乙腈：甲醇为90:5:5；流速为0.2mL/min；检测波长为215nm；柱温为30℃；进样为5μL。
1.4.2标准曲线及线性范围
配制不同含量的标准溶液，按选定的色谱条件进样，以标样浓度为横坐标，以对应的相对峰面积为纵坐标，得出金线莲苷标样的线性回归方程为Y＝84911X+192050；相关系数为0.995；线性范围在5μg～500μg，能满足金线莲苷定量分析的需要。
1.5提取工艺单因素优化试验
金线莲植株冻干粉末分别对提取液甲醇浓度、料液比、超声功率、时间、温度和提取次数等单因素进行优化，各因素水平设计见表1。
表1 单因素试验设计
Table1 Design of single factor experiment
Figure BDA0001558988900000041
1.6响应面法设计试验
在单因素试验的基础上，利用响应面法确定影响水平，根据Box-Behnken的中心组合试验设计，固定浸提溶剂，设计3因素3水平的响应面分析试验(表2)。试验数据使用Design-Expert 8.0软件进行分析[3]，得到响应面分析图和方差分析表，确定金线莲苷提取的最佳条件。采用响应面试验确定的优化条件对金线莲金线莲苷提取工艺进行验证。
表2 响应面试验因素水平
Table2 Factors in RSM experiment
Figure BDA0001558988900000051
1.7数据处理
采用Excel 2007、Design-Expert 8.0和Origin 9.0软件进行数据分析及作图，并用DPS 15.10进行单因素方差分析，Tukey检验法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。
2结果和分析
2.2单因素试验
通过对甲醇浓度、超声功率、料液比、超声时间、温度和提取次数等因素进行试验，结果表明，甲醇浓度为20％，超声波功率360W，料液比为1:15，在40℃下超声20min是单因素试验的最佳结果。从图5可见，随甲醇浓度的升高，金线莲中金线莲苷的提取得率先逐渐提高，甲醇浓度为20％时的得率最高，然后不断下降。随超声波功率的升高，提取得率呈现先提高后快速下降的趋势，在360W时达到最大值，表明当超声波功率过大会加速提取液的流动，破壁作用随之减弱，使胞内金线莲苷的溶出速率减缓。随料液比的升高，提取得率呈现先提高后下降的趋势，说明若溶剂太少，会导致超声波在液相中的吸收大于固相，超过1:15后，由于金线莲苷被稀释，有机溶剂接触的机会减少而导致得率降低。随超声时间的延长，提取得率也呈现先提高后下降的趋势，以超声20min的得率最高这表明超声时间过短，金线莲苷溶解不充分，而过长的超声波时间可能使金线莲苷发生降解作用，从而导致金线莲苷得率下降。金线莲苷提取得率以40℃时最高，温度继续升高后提取得率出现快速下降，表明高温会造成金线莲苷的分解，影响其生物活性。
2.3提取次数的影响
随着提取次数的增加金线莲苷的得率也相应地增加，第一次提取得率为18.7％，第二次提取得率达到33.2％DW，而第三次(得率为36.3％DW)第四次(得率为39.1％DW)提取得率变化不大，说明提取次数超过2次后对得率的变化影响不大，从能耗、时间以及提取剂的经济角度来看，已没有多少实际意义，故提取次数以2次为佳。
2.4响应面法优化
响应面试验结果及回归分析 为研究各工艺参数之间的交互作用对金线莲金线莲苷得率的影响，选用中心复合模型，采用3因素3水平共17个试验点(5个中心点用以估计试验误差)的响应面分析试验，按表3的顺序进行试验，将所得的数据用Design-Expert 8.0软件进行分析，超声温度(A)、甲醇浓度(B)和料液比(C)为自变量，以金线莲苷的得率(％)为响应值，经回归拟合得到二次回归方程：Y＝30.31-3.11A-1.69B-2.26C-0.082AB+1.95AC+0.94BC-7.64A2-3.80B2-0.038C2。方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对指标值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。由此得出最佳提取工艺条件为：温度为35.00℃，甲醇浓度为16.33％，料液比为1:10.83，在此条件下，金线莲苷提取率达到33％DW。
利用Design-Expert 8.0软件对金线莲金线莲苷提取的响应值进行回归分析，结果表明，一次项A、B、C、AC、以及二次项A2、B2对得率的影响均达极显著水平，表明试验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值有很大的影响，说明各因素对金线莲苷得率的影响存在一定的交互作用。这和模型回归中的线性和平方项影响显著项对应，各因素的F值可评价其对试验指标的影响程度，在所选取的各因素水平范围内，根据F值和P值的大小，得出各因素对结果的影响依次为pH>温度>料液比>时间。失拟项(F＝0.13)不显著，说明试验误差很小。回归方程的F值为117.59，P<0.0001，达到极显著水平。相关系数R2＝0.9934，说明该回归方程拟合程度较好。变异系数(CV＝2.71％)<5％，说明模型的重现性较好。这说明该回归模型是合理的，试验具有很高的可信度和准确性，可以用于金线莲金线莲苷得率的预测。
表3 中心组合试验设计及结果
Figure BDA0001558988900000071
表4 中心组合试验的方差分析
Figure BDA0001558988900000072
Figure BDA0001558988900000081
注：表中**表示差异极显著(P<0.01)；*表示差异显著(P<0.05)。
响应曲面与等高分析 根据金线莲金线莲苷得率的回归模型作出三维响应面图和等高曲线图(图6～11)，每个响应面对其中两个因素进行分析，另外一个因素固定在零水平。通过三维图与二维图，可以看出试验水平与每个变量或变量之间的交互影响的响应值之间的关系。等高线的形状(圆形、椭圆形)反映变量之间的交互影响是否显著，圆形的等高线表明两变量之间的交互影响不显著。从图6～11可以看出，超声温度、料液比和甲醇浓度的等高线图呈椭圆状，表明3个因素具有交互作用，且甲醇浓度和超声温度交互作用最显著，其它因素间的交互作用其次。
结合表4的回归方差分析，由图6～7可知，金线莲苷得率随着超声温度的增大呈先上升后下降的趋势，有极大值；金线莲苷得率随着甲醇浓度的增大呈先上升后下降的趋势，有极大值。此外，甲醇浓度的变化坡度较超声温度的大(图6)，且甲醇浓度的等高线变化数量多于超声温度的，说明甲醇浓度对金线莲苷得率的影响大于超声温度(图7)；
由图8可知，金线莲苷得率随着超声温度的增大呈先上升后下降的趋势，有极大值；金线莲苷得率随着料液比变化趋势较为平缓。此外，料液比的变化坡度较超声温度的大(图8)，且料液比的等高线变化数量多于超声温度的，料液比对金线莲苷得率的影响大于超声温度(图9)；
由图10～11可知，金线莲苷得率随着甲醇浓度的增大呈先上升后下降的趋势，有极大值；金线莲苷得率随着料液比变化趋势较为平缓。此外，料液比的变化坡度较甲醇浓度的大，且料液比的等高线变化数量多于甲醇浓度的，料液比对金线莲苷得率的影响大于甲醇浓度(图11)；料液比的变化坡度较甲醇浓度的大(图11)，且料液比的等高线变化数量多于甲醇浓度的，说明料液比对金线莲金线莲苷得率的影响大于甲醇浓度。
根据响应面试验所得的优化提取工艺进行验证试验，准确称取0.5g干燥的金线莲叶片粉末，以料液比1∶10.83加入16.33％甲醇5.4mL，在35℃下以360W的超声功率提取20min，提取次数2次。重复试验3次，金线莲苷的平均得率为32.24％DW，与模型预测值(33.00％DW)的相对误差仅为2.3％，说明此模型有效，采用响应面法得到的金线莲金线莲苷提取工艺参数可靠，重现性好，具有实用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种金线莲苷的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：将金线莲冻干粉末用甲醇溶解，在功率为360 W，温度为35℃条件下超声波辅助提取20min，以10000rpm/min离心10min，后吸取上清液，重复1~4次，合并上清液，用甲醇定容至2ml；过0.22µm滤膜；采用超高效液相色谱进行分析，以C18为色谱柱；流动相为水：乙腈：甲醇为90:5:5；流速为0.2 mL/min；检测波长为215nm；柱温为30℃；进样为5µL；金线莲冻干粉末与甲醇的料液比为1:10.83，单位为g/ml；甲醇浓度为16.33%。
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