CN110343188A - 一种甘草多糖的提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甘草多糖的提取纯化方法，其特征在于：将甘草粉碎，水煎提取，除杂，脱蛋白、醇沉，将沉淀烘干即得。本发明的提取纯化方法操作简单，便捷，多糖收率大。
Description
技术领域
本发明涉及一种甘草有效成分的提取，特别涉及一种甘草多糖的提取纯化方法。
背景技术
甘草为多年生草本植物,又名甜草根、红甘草、粉甘草、粉草。喜生于沙滩、草原,主产于新疆、内蒙、山西、甘肃等地,是传统常用中草药,有“十方九草”之称。甘草多糖是甘草的主要活性成分之一,具有抗肿瘤、抗辐射、抗病毒、抗溃疡、降血糖抗衰老和免疫调节等作用,因此对甘草多糖的研究越来越受到人们的重视。甘草中的主要化学成分甘草多糖(Glycyrrhiza Polysaccharide)具有免疫调节、增强巨噬细胞吞噬功能、抗氧化等多种生物活性。甘草粗多糖可以用不同方法分离提取，例如水提醇沉法、超声辅助法、微波、酶法等。
目前的甘草多糖的提取方法比较复杂，步骤繁琐，因此成本较高，得到的成品量较少，且容易混入新的杂质，从而限制了批量生产和使用。
发明内容
本发明涉及一种甘草有效成分的提取，特别涉及一种甘草多糖的提取纯化方法。
本发明目的是公开一种简单，便捷，相对纯度较高，收率较大的甘草多糖的制备提取方法。
本发明的技术方案为：
一种甘草多糖的提取纯化方法，将甘草粉碎，水煎提取，除杂，脱蛋白、醇沉，将沉淀烘干即得。
所述的甘草多糖的提取纯化方法，步骤如下：
(1)将甘草粉碎，过40-60目筛；
(2)将过筛后的甘草加入8-10倍水，第一次煎0.5-1.5h，第2次煎0.5-1h，取水煎液浓缩至生药量的2-3倍；
(3)量取提取液体积15-30％的吸附剂倒入浓缩后的水煎液中，搅拌均匀后，放于80-82℃恒温水浴锅中保温40-50min，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；
(4)sevag法除蛋白，(多糖中的游离蛋白)浓缩液与氯仿：正丁醇＝12～20：3～6：0.5～2混合，振荡时间为15-30min，保留水层，重复1-3次；
(5)加入乙醇，使含乙醇量为30-40％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为45-55％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为60-80％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
进一步的，步骤(4)中浓缩液与氯仿：正丁醇＝15：4：1混合，振荡时间为20min，保留水层，重复2次。
优选的，所述的吸附剂为硅藻土、和/或活性炭。
进一步的，量取提取液体积20％的吸附剂，吸附剂为硅藻土。
优选的，步骤(2)为将过筛后的甘草加入8倍水，第一次煎0.5h，第2次煎0.5h，，取水煎液浓缩至生药量的2倍。
优选的，步骤(4)中浓缩液与氯仿：正丁醇＝15：4：1混合，振荡时间为25min，保留水层，重复1次。
优选的，步骤(5)中，加入乙醇，使含乙醇量为30％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为45％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为70％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
优选的，步骤(5)中，加入乙醇，使含乙醇量为35％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为50％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为75％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
优选的，加入乙醇，使含乙醇量为40％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为55％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为80％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
本发明的有益效果为：
本发明首先将甘草进行破碎，过40-60目，粗粉有利于甘草多糖的提取，缩短提取时间，也有利于避免过多杂质析出。使用吸附剂进行脱色处理，可显著改善成品多糖的颜色。sevag法除蛋白，可有效去除多糖中的游离蛋白，避免蛋白过敏体质的人群服用甘草多糖带来的过敏反应，经过发明人研究发现，重复一次的除蛋白操作，可以减少多糖的损耗，同时减少蛋白的含量。本发明采用了3级纯沉操作，实现了水溶性和脂溶性的多糖的最大范围的提去，从而提高产量。
综上所述，本发明的提取纯化方法操作简单，便捷，多糖收率大。
具体实施方式
以下实验例和实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：一种甘草多糖的提取纯化方法，步骤如下：
(1)将甘草粉碎，过40-60目筛；
(2)为将过筛后的甘草加入8倍水，第一次煎0.5h，第2次煎0.5h，，取水煎液浓缩至生药量的2倍；
(3)量取提取液体积20％的硅藻土倒入浓缩后的水煎液中，搅拌均匀后，放于80-82℃恒温水浴锅中保温40-50min，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；
(4)sevag法除蛋白，(多糖中的游离蛋白)浓缩液与氯仿：正丁醇＝15：4：1混合，振荡时间为25min，保留水层，重复1次。
(5)加入乙醇，使含乙醇量为30％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为45％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为70％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
优选的，步骤(5)中，加入乙醇，使含乙醇量为35％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为50％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为75％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
优选的，加入乙醇，使含乙醇量为40％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为55％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为80％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
实施例2：
一种甘草多糖的提取纯化方法，步骤如下：
(1)将甘草粉碎，过40-60目筛；
(2)为将过筛后的甘草加入8倍水，第一次煎0.5h，第2次煎0.5h，，取水煎液浓缩至生药量的2倍；
(3)量取提取液体积20％的硅藻土倒入浓缩后的水煎液中，搅拌均匀后，放于80-82℃恒温水浴锅中保温40-50min，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；
(4)sevag法除蛋白，(多糖中的游离蛋白)浓缩液与氯仿：正丁醇＝15：4：1混合，振荡时间为25min，保留水层，重复1次。
(5)加入乙醇，使含乙醇量为35％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为50％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为75％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
实施例3
一种甘草多糖的提取纯化方法，步骤如下：
(1)将甘草粉碎，过40-60目筛；
(2)为将过筛后的甘草加入8倍水，第一次煎0.5h，第2次煎0.5h，，取水煎液浓缩至生药量的2倍；
(3)量取提取液体积20％的硅藻土倒入浓缩后的水煎液中，搅拌均匀后，放于80-82℃恒温水浴锅中保温40-50min，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；
(4)sevag法除蛋白，(多糖中的游离蛋白)浓缩液与氯仿：正丁醇＝15：4：1混合，振荡时间为25min，保留水层，重复1次。
(5)加入乙醇，使含乙醇量为40％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为55％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为80％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
对照例1：
一种甘草多糖的提取纯化方法，步骤如下：
(1)将甘草粉碎，过40-60目筛；
(2)为将过筛后的甘草加入8倍水，第一次煎0.5h，第2次煎0.5h，，取水煎液浓缩至生药量的2倍；
(3)量取提取液体积20％的硅藻土倒入浓缩后的水煎液中，搅拌均匀后，放于80-82℃恒温水浴锅中保温40-50min，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；
(4)sevag法除蛋白，(多糖中的游离蛋白)浓缩液与氯仿：正丁醇＝15：4：1混合，振荡时间为25min，保留水层，重复1次。
(5)加入乙醇，使含乙醇量为40％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为55％，静置后离心，沉淀待用。
对照例2：
一种甘草多糖的提取纯化方法，步骤如下：
(1)将甘草粉碎，过40-60目筛；
(2)为将过筛后的甘草加入8倍水，第一次煎0.5h，第2次煎0.5h，，取水煎液浓缩至生药量的2倍；
(3)量取提取液体积20％的硅藻土倒入浓缩后的水煎液中，搅拌均匀后，放于80-82℃恒温水浴锅中保温40-50min，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；
(4)sevag法除蛋白，(多糖中的游离蛋白)浓缩液与氯仿：正丁醇＝15：4：1混合，振荡时间为25min，保留水层，重复1次。
(5)加入乙醇，上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为80％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
实验结果：总糖测定
采用苯酚－硫酸法绘制葡萄糖标准曲线，以葡萄糖浓度x为横坐标(μg/mL)，光吸收值Y为纵坐标，在490nm处测定葡萄糖和硫酸苯酚溶液反应后的吸光度，拟合回归方程为Y＝0.0083x+0.0075，R2＝0.9983，在0～50μg/mL范围内线性良好。
取上述实施例和对比例的甘草多糖的成品0.1g，加水3ml，研磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用12ml的蒸馏水冲洗研钵3次，洗出液转入三角烧瓶中。向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10ml，搅拌均匀后在沸水浴中水解30min，冷却后用10％NaOH溶液中和，PH呈中性。然后用蒸馏水定容至100ml，过滤，取滤液10ml，用蒸馏水定容100ml，成稀释1000倍的总糖水解液。取1ml总糖水解液，测定其还原糖含量：吸取1ml总糖类溶液置于试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出冷却后比色，测得的吸光度值由标准曲线查算除样品液的糖含量。
还原糖质量＝(C1V1/m)×100％
总糖＝(C2V2/m)×0.9×100％
其中，C1：还原糖的质量浓度(mg/mL)；
C2：水解后还原糖的质量浓度(mg/mL)；
V1：样品中还原糖提取液的体积(mL)；
V2：样品中总糖提取液的体积(mL)；
m：样品质量(mg)。
表1中总糖含量
| 药材总质量(g) | 产品总质量(g) | 总糖纯度(％) | |
| 实施例1 | 1000 | 42 | 57.2 |
| 实施例2 | 1000 | 40 | 57.4 |
| 实施例3 | 1000 | 45 | 56.6 |
| 对照例1 | 1000 | 28 | 50.8 |
| 对照例2 | 1000 | 31 | 55.2 |
Claims (10)
1.一种甘草多糖的提取纯化方法，其特征在于：将甘草粉碎，水煎提取，除杂，脱蛋白、醇沉，将沉淀烘干即得。
2.如权利要求1所述的甘草多糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将甘草粉碎，过40-60目筛；
(2)将过筛后的甘草加入8-10倍水，第一次煎0.5-1.5h，第2次煎0.5-1h，取水煎液浓缩至生药量的2-3倍；
(3)量取提取液体积15-30％的吸附剂倒入浓缩后的水煎液中，搅拌均匀后，放于80-82℃恒温水浴锅中保温40-50min，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；
(4)sevag法除蛋白，(多糖中的游离蛋白)浓缩液与氯仿：正丁醇＝12～20：3～6：0.5～2混合，振荡时间为15-30min，保留水层，重复1-3次；
(5)加入乙醇，使含乙醇量为30-40％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为45-55％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为60-80％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
3.如权利要求2所述的甘草多糖的提取纯化方法，其特征在于：步骤(4)中浓缩液与氯仿：正丁醇＝15：4：1混合，振荡时间为20min，保留水层，重复2次。
4.如权利要求2所述的甘草多糖的提取纯化方法，其特征在于：所述的吸附剂为硅藻土、和/或活性炭。
5.如权利要求2所述的甘草多糖的提取纯化方法，其特征在于：量取提取液体积20％的吸附剂，吸附剂为硅藻土。
6.如权利要求2所述的甘草多糖的提取纯化方法，其特征在于：步骤(2)为将过筛后的甘草加入8倍水，第一次煎0.5h，第2次煎0.5h，，取水煎液浓缩至生药量的2倍。
7.如权利要求2所述的甘草多糖的提取纯化方法，其特征在于：步骤(4)中浓缩液与氯仿：正丁醇＝15：4：1混合，振荡时间为25min，保留水层，重复1次。
8.如权利要求2所述的甘草多糖的提取纯化方法，其特征在于：步骤(5)中，加入乙醇，使含乙醇量为30％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为45％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为70％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
9.如权利要求2所述的甘草多糖的提取纯化方法，其特征在于：步骤(5)中，加入乙醇，使含乙醇量为35％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为50％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为75％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
10.如权利要求2所述的甘草多糖的提取纯化方法，其特征在于：加入乙醇，使含乙醇量为40％，静置后离心，沉淀待用；上清液加入乙醇，使含乙醇量为55％，静置后离心，沉淀待用；上清液继续加入乙醇，使含乙醇量为80％，静置后离心，取所有沉淀烘干，即得。
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