CN109988795A - 一种甘草多糖的分离纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：(1)将甘草切成片；(2)将甘草片加水浸泡；(3)弃掉浸泡液，再加入甘草片重量2‑4倍的水，重复提取2‑4次，减压浓缩；(4)加体积分数92‑97％乙醇，静置4‑12h，离心，过滤，干燥得到初提取物；向初提取物中加体积分数92‑97％乙醇浸泡2‑6h，离心，过滤，干燥，重复2‑4次，得到甘草多糖。本发明甘草多糖的分离纯化工艺，对甘草进行冷冻，并进行超声酶解，破坏甘草的细胞壁以利于甘草多糖的浸出，再经发酵工艺，后续分离纯化，提取工艺简单易行，甘草多糖的得率与含量较高，得到甘草多糖的活性较高，蛋白质残余率低，甘草多糖的纯度高，具有调节机体免疫功能、抗疲劳的作用。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种甘草多糖的分离纯化工艺。
背景技术
多糖是指由许多单糖分子以糖苷键结合而成的高分子碳水化合物，是除核酸和蛋白质之外，存在于所有生命有机体的重要组成部分之一。近年来，已有多种植物的多糖被提取分离鉴定出来，此类多糖来源广泛、无细胞毒性，应用于生物体毒副作用小，因此多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃。糖生物学也被称为“生物化学最后的巨大前沿之一”。
甘草，学名：Glycyrrhiza uralensis Fisch，别名：国老、甜草、乌拉尔甘草、甜根子。豆科、甘草属多年生草本，根与根状茎粗壮，是一种补益中草药。对人体很好的一种药，药用部位是根及根茎，药材性状根呈圆柱形，长25～100厘米，直径0.6～3.5厘米。外皮松紧不一，表面红棕色或灰棕色。根茎呈圆柱形，表面有芽痕，断面中部有髓。气微，味甜而特殊。功能主治清热解毒、祛痰止咳、脘腹等。喜阴暗潮湿，日照长气温低的干燥气候。甘草多生长在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠边缘和黄土丘陵地带。根和根状茎供药用。甘草含有多种化学成分，主要成分有甘草酸、甘草甙等。甘草的化学组成极为复杂，目前为止从甘草中分离出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、异甘草甙、新甘草甙、新异甘草甙、甘草素、异甘草素以及甘草西定、甘草醇、异甘草醇、7-甲基香豆精、伞形花内酯等数十种化合物，但这些成分和数量通常会随甘草的种类、种植区域、采收时间等因素的不同而异。大量的研究表明，甘草甜素和黄酮类物质是甘草中最重要的生理活性物质，主要存在于甘草根表皮以内的部分。
甘草多糖是甘草重要的活性成分之一，具有抑瘤、抗病毒、控制血糖、降胆固醇、降血脂等生理功能。甘草多糖的提取方法有水提、微波提取、酶法提取、超声提取等。
申请号：200910061357.X的中国专利公开了一种从甘草中提取多糖的方法及应用。它包括下列步骤：a、将干燥的甘草用粉碎；b、置入提取罐中，加入石油醚回流脱脂，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；c、向残渣中加入蒸馏水常压下提取，水煮提取重复三次，合并三次提取液；d、减压浓缩提取液，使溶液体积为所用a步骤甘草粉末，得到浓缩物；e、向d步骤浓缩物中加入浓缩物，静置过夜，沉淀；f、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗；g、水中用截留分子量1000～10000的半透膜透析，冷冻干燥得到甘草多糖。但该方法需要使用较多有机溶剂。
现有甘草多糖提取方法繁杂，所用流程多，有必要进行甘草多糖提取工艺研究，以提高甘草多糖的提取率，优化甘草多糖提取方法。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种甘草多糖的分离纯化工艺，甘草多糖的得率与含量较高，甘草多糖的活性较高。
本发明目的通过以下技术方案予以实现：
一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片，得到甘草片；
(2)将甘草片加甘草片重量1-5倍的水浸泡1-4h；
(3)弃掉浸泡液，再加入甘草片重量2-4倍的水，升温至80-105℃，提取2-8h，重复提取2-4次，合并提取液，静置2-8h，取静置后的上清液减压浓缩至相对密度为1.055-1.075得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数92-97％乙醇，使乙醇体积分数达到70-80％，静置4-12h，离心，过滤，干燥得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量2-4倍体积分数92-97％乙醇浸泡2-6h，离心，过滤，干燥，重复2-4次，得到甘草多糖。
优选地，一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片得到甘草片，将甘草片粉碎至30-100目，得到甘草粉；
(2)将甘草粉加甘草粉重量1-5倍的水浸泡1-4h，过滤，得到浸泡后的甘草粉；
(3)将浸泡后的甘草粉加浸泡后的甘草粉重量10-20的水置于温度为-20～-10℃冷冻2-3h，然后置于温度为45-55℃解冻至温度为45-55℃，再加入浸泡后的甘草粉重量0.4-1％的果胶酶和甘草粉重量0.1-0.5％的木瓜蛋白酶在温度为45-55℃超声酶解3-9h，升温至94-98℃保温8-12min灭酶活，得到酶解混合物；向酶解混合物中加入发酵剂，在摇床温度为32-38℃，转速为120-180r/min，发酵时间10-20h，过滤，将滤液升温至94-98℃保温8-12min灭菌，静置2-8h，取静置后的上清液减压浓缩至相对密度为1.055-1.075得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数92-97％乙醇，使乙醇体积分数达到70-80％，静置4-12h，离心，过滤，干燥得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量2-4倍体积分数92-97％乙醇浸泡2-6h，离心，过滤，干燥，重复2-4次，得到甘草多糖。
所述步骤(1)中甘草片的厚度控制在1-5mm。
所述步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中过滤用的滤网均为400目-1200目的滤网。
所述步骤(3)中酶解混合物、发酵剂的质量比为1：(0.005-0.015)。
所述步骤(3)中发酵剂的制备方法为：将2-5重量份玉米粉、2-5重量份发酵助剂、0.5-2重量份磷酸氢二钾、0.5-2重量份硫酸镁、0.5-2重量份海藻酸钠、0.5-2重量份柠檬酸铵加入950-990重量份水中混合均匀，升温至94-98℃保温8-12min灭菌，再加入10-20重量份酵母菌混合均匀，得到发酵剂。
所述发酵助剂为蓝莓汁和/或葡萄汁。优选地，所述发酵助剂为蓝莓汁、葡萄汁按质量比为1：(2-3)组成。所述蓝莓汁的制备方法为：取新鲜蓝莓洗净，榨汁，过滤，得到蓝莓汁。所述葡萄汁的制备方法为：取新鲜葡萄洗净，榨汁，过滤，得到葡萄汁。
所述步骤(4)中离心的转速为1500-2500r/min、时间为10-30min。
所述步骤(4)中干燥的温度为60-90℃，时间为10-20h。
本发明的有益效果是：
本发明甘草多糖的分离纯化工艺，对甘草进行冷冻，并进行超声酶解，破坏甘草的细胞壁以利于甘草多糖的浸出，再经发酵工艺，后续分离纯化，提取工艺简单易行，甘草多糖的得率与含量较高，得到甘草多糖的活性较高，蛋白质残余率低，甘草多糖的纯度高，具有调节机体免疫功能、抗疲劳的作用，同时其抗病毒、抗肿瘤及抑菌作用显著，此外还可以清除自由基，提高抗氧化能力。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些举例性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
使用材料介绍如下：甘草，产地新疆。果胶酶由郑州雪泉聚合材料有限公司提供，酶活力5万U/g。木瓜蛋白酶由陕西森弗天然制品有限公司提供，酶活力5万U/g。玉米粉由江苏萃谷食品有限公司提供。酵母菌由山东苏柯汉生物工程股份有限公司提供，菌数：10亿CFU/克。葡萄，品种：夏黑，产地：云南。蓝莓，品种：奥尼尔，产地：山东。
实施例1
一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将甘草切成2-3mm厚片，得到甘草片；
(2)将甘草片用水洗净后加甘草片重量3倍的水浸泡2h；
(3)弃掉浸泡液，再加入甘草片重量3倍的水，升温至95℃，提取5h，重复提取3次，合并提取液，静置6h，取静置后的上清液减压浓缩至相对密度为1.060(25℃)得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数95％乙醇，使乙醇体积分数达到75％，静置10h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，干燥得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量3倍体积分数95％乙醇浸泡4h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，70℃干燥15h，重复3次，得到甘草多糖。
实施例2
一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片得到甘草片，将甘草片粉碎至60目，得到甘草粉；
(2)将甘草粉加甘草粉重量2倍的水浸泡2h，600目滤网过滤，得到浸泡后的甘草粉；
(3)将浸泡后的甘草粉加浸泡后的甘草粉重量15的水置于温度为-15℃冷冻2.5h，然后置于温度为50℃解冻至温度为50℃，再加入浸泡后的甘草粉重量0.6％的果胶酶和甘草粉重量0.25％的木瓜蛋白酶在温度为50℃、超声功率为200W、超声频率为20kHz进行超声酶解6h，升温至96℃保温10min灭酶活，得到酶解混合物；向酶解混合物中加入发酵剂，在摇床温度为35℃，转速为150r/min，发酵时间15h，600目滤网过滤，将滤液升温至96℃保温10min灭菌，静置6h，取静置后的上清液在温度为80℃、绝对压强为0.01MPa减压浓缩至相对密度25℃时为1.060得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数95％乙醇水溶液，使乙醇体积分数达到75％，静置10h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量3倍体积分数95％乙醇水溶液浸泡4h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h，重复3次，得到甘草多糖。
所述步骤(1)中甘草片的厚度控制在2-3mm。
所述步骤(3)中酶解混合物、发酵剂的质量比为1：0.01。
所述步骤(3)中发酵剂的制备方法为：将3重量份玉米粉、3重量份发酵助剂、1重量份磷酸氢二钾、1重量份硫酸镁、0.8重量份海藻酸钠、0.7重量份柠檬酸铵加入980重量份水中混合均匀，升温至96℃保温10min灭菌，再加入15重量份酵母菌混合均匀，得到发酵剂。
所述发酵助剂为葡萄汁。所述葡萄汁的制备方法为：取新鲜葡萄洗净，以转速为2200r/min榨汁3min，500目滤网过滤，得到葡萄汁。
对比例1
一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片得到甘草片，将甘草片粉碎至60目，得到甘草粉；
(2)将甘草粉加甘草粉重量2倍的水浸泡2h，600目滤网过滤，得到浸泡后的甘草粉；
(3)将浸泡后的甘草粉加浸泡后的甘草粉重量15的水在温度为50℃、超声功率为200W、超声频率为20kHz进行超声6h，升温至96℃保温10min，得到超声处理后的混合物；向超声处理后的混合物中加入发酵剂，在摇床温度为35℃，转速为150r/min，发酵时间15h，600目滤网过滤，将滤液升温至96℃保温10min灭菌，静置6h，取静置后的上清液在温度为80℃、绝对压强为0.01MPa减压浓缩至相对密度25℃时为1.060得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数95％乙醇水溶液，使乙醇体积分数达到75％，静置10h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量3倍体积分数95％乙醇水溶液浸泡4h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h，重复3次，得到甘草多糖。
所述步骤(1)中甘草片的厚度控制在2-3mm。
所述步骤(3)中超声处理后的混合物、发酵剂的质量比为1：0.01。
所述步骤(3)中发酵剂的制备方法为：将3重量份玉米粉、3重量份发酵助剂、1重量份磷酸氢二钾、1重量份硫酸镁、0.8重量份海藻酸钠、0.7重量份柠檬酸铵加入980重量份水中混合均匀，升温至96℃保温10min灭菌，再加入15重量份酵母菌混合均匀，得到发酵剂。
所述发酵助剂为葡萄汁。所述葡萄汁的制备方法为：取新鲜葡萄洗净，以转速为2200r/min榨汁3min，500目滤网过滤，得到葡萄汁。
对比例2
一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片得到甘草片，将甘草片粉碎至60目，得到甘草粉；
(2)将甘草粉加甘草粉重量2倍的水浸泡2h，600目滤网过滤，得到浸泡后的甘草粉；
(3)将浸泡后的甘草粉加浸泡后的甘草粉重量15的水置于温度为-15℃冷冻2.5h，然后置于温度为50℃解冻至温度为50℃，再加入浸泡后的甘草粉重量0.6％的果胶酶和甘草粉重量0.25％的木瓜蛋白酶在温度为50℃、超声功率为200W、超声频率为20kHz进行超声酶解6h，升温至96℃保温10min灭酶活，600目滤网过滤，将滤液静置6h，取静置后的上清液在温度为80℃、绝对压强为0.01MPa减压浓缩至相对密度25℃时为1.060得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数95％乙醇水溶液，使乙醇体积分数达到75％，静置10h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量3倍体积分数95％乙醇水溶液浸泡4h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h，重复3次，得到甘草多糖。
所述步骤(1)中甘草片的厚度控制在2-3mm。
对比例3
一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片得到甘草片，将甘草片粉碎至60目，得到甘草粉；
(2)将甘草粉加甘草粉重量2倍的水浸泡2h，600目滤网过滤，得到浸泡后的甘草粉；
(3)将浸泡后的甘草粉加浸泡后的甘草粉重量15的水置于温度为-15℃冷冻2.5h，然后置于温度为50℃解冻至温度为50℃，再加入浸泡后的甘草粉重量0.6％的果胶酶在温度为50℃、超声功率为200W、超声频率为20kHz进行超声酶解6h，升温至96℃保温10min灭酶活，得到酶解混合物；向酶解混合物中加入发酵剂，在摇床温度为35℃，转速为150r/min，发酵时间15h，600目滤网过滤，将滤液升温至96℃保温10min灭菌，静置6h，取静置后的上清液在温度为80℃、绝对压强为0.01MPa减压浓缩至相对密度25℃时为1.060得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数95％乙醇水溶液，使乙醇体积分数达到75％，静置10h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量3倍体积分数95％乙醇水溶液浸泡4h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h，重复3次，得到甘草多糖。
所述步骤(1)中甘草片的厚度控制在2-3mm。
所述步骤(3)中酶解混合物、发酵剂的质量比为1：0.01。
所述步骤(3)中发酵剂的制备方法为：将3重量份玉米粉、3重量份发酵助剂、1重量份磷酸氢二钾、1重量份硫酸镁、0.8重量份海藻酸钠、0.7重量份柠檬酸铵加入980重量份水中混合均匀，升温至96℃保温10min灭菌，再加入15重量份酵母菌混合均匀，得到发酵剂。
所述发酵助剂为葡萄汁。所述葡萄汁的制备方法为：取新鲜葡萄洗净，以转速为2200r/min榨汁3min，500目滤网过滤，得到葡萄汁。
对比例4
一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片得到甘草片，将甘草片粉碎至60目，得到甘草粉；
(2)将甘草粉加甘草粉重量2倍的水浸泡2h，600目滤网过滤，得到浸泡后的甘草粉；
(3)将浸泡后的甘草粉加浸泡后的甘草粉重量15的水，再加入浸泡后的甘草粉重量0.6％的果胶酶和甘草粉重量0.25％的木瓜蛋白酶在温度为50℃、超声功率为200W、超声频率为20kHz进行超声酶解6h，升温至96℃保温10min灭酶活，得到酶解混合物；向酶解混合物中加入发酵剂，在摇床温度为35℃，转速为150r/min，发酵时间15h，600目滤网过滤，将滤液升温至96℃保温10min灭菌，静置6h，取静置后的上清液在温度为80℃、绝对压强为0.01MPa减压浓缩至相对密度25℃时为1.060得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数95％乙醇水溶液，使乙醇体积分数达到75％，静置10h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量3倍体积分数95％乙醇水溶液浸泡4h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h，重复3次，得到甘草多糖。
所述步骤(1)中甘草片的厚度控制在2-3mm。
所述步骤(3)中酶解混合物、发酵剂的质量比为1：0.01。
所述步骤(3)中发酵剂的制备方法为：将3重量份玉米粉、3重量份发酵助剂、1重量份磷酸氢二钾、1重量份硫酸镁、0.8重量份海藻酸钠、0.7重量份柠檬酸铵加入980重量份水中混合均匀，升温至96℃保温10min灭菌，再加入15重量份酵母菌混合均匀，得到发酵剂。
所述发酵助剂为葡萄汁。所述葡萄汁的制备方法为：取新鲜葡萄洗净，以转速为2200r/min榨汁3min，500目滤网过滤，得到葡萄汁。
实施例3
一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片得到甘草片，将甘草片粉碎至60目，得到甘草粉；
(2)将甘草粉加甘草粉重量2倍的水浸泡2h，600目滤网过滤，得到浸泡后的甘草粉；
(3)将浸泡后的甘草粉加浸泡后的甘草粉重量15的水置于温度为-15℃冷冻2.5h，然后置于温度为50℃解冻至温度为50℃，再加入浸泡后的甘草粉重量0.6％的果胶酶和甘草粉重量0.25％的木瓜蛋白酶在温度为50℃、超声功率为200W、超声频率为20kHz进行超声酶解6h，升温至96℃保温10min灭酶活，得到酶解混合物；向酶解混合物中加入发酵剂，在摇床温度为35℃，转速为150r/min，发酵时间15h，600目滤网过滤，将滤液升温至96℃保温10min灭菌，静置6h，取静置后的上清液在温度为80℃、绝对压强为0.01MPa减压浓缩至相对密度25℃时为1.060得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数95％乙醇水溶液，使乙醇体积分数达到75％，静置10h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量3倍体积分数95％乙醇水溶液浸泡4h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h，重复3次，得到甘草多糖。
所述步骤(1)中甘草片的厚度控制在2-3mm。
所述步骤(3)中酶解混合物、发酵剂的质量比为1：0.01。
所述步骤(3)中发酵剂的制备方法为：将3重量份玉米粉、3重量份发酵助剂、1重量份磷酸氢二钾、1重量份硫酸镁、0.8重量份海藻酸钠、0.7重量份柠檬酸铵加入980重量份水中混合均匀，升温至96℃保温10min灭菌，再加入15重量份酵母菌混合均匀，得到发酵剂。
所述发酵助剂为蓝莓汁。所述蓝莓汁的制备方法为：取新鲜蓝莓洗净，以转速为2200r/min榨汁3min，500目滤网过滤，得到蓝莓汁。
实施例4
一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片得到甘草片，将甘草片粉碎至60目，得到甘草粉；
(2)将甘草粉加甘草粉重量2倍的水浸泡2h，600目滤网过滤，得到浸泡后的甘草粉；
(3)将浸泡后的甘草粉加浸泡后的甘草粉重量15的水置于温度为-15℃冷冻2.5h，然后置于温度为50℃解冻至温度为50℃，再加入浸泡后的甘草粉重量0.6％的果胶酶和甘草粉重量0.25％的木瓜蛋白酶在温度为50℃、超声功率为200W、超声频率为20kHz进行超声酶解6h，升温至96℃保温10min灭酶活，得到酶解混合物；向酶解混合物中加入发酵剂，在摇床温度为35℃，转速为150r/min，发酵时间15h，600目滤网过滤，将滤液升温至96℃保温10min灭菌，静置6h，取静置后的上清液在温度为80℃、绝对压强为0.01MPa减压浓缩至相对密度25℃时为1.060得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数95％乙醇水溶液，使乙醇体积分数达到75％，静置10h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量3倍体积分数95％乙醇水溶液浸泡4h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h，重复3次，得到甘草多糖。
所述步骤(1)中甘草片的厚度控制在2-3mm。
所述步骤(3)中酶解混合物、发酵剂的质量比为1：0.01。
所述步骤(3)中发酵剂的制备方法为：将3重量份玉米粉、3重量份发酵助剂、1重量份磷酸氢二钾、1重量份硫酸镁、0.8重量份海藻酸钠、0.7重量份柠檬酸铵加入980重量份水中混合均匀，升温至96℃保温10min灭菌，再加入15重量份酵母菌混合均匀，得到发酵剂。
所述发酵助剂为蓝莓汁、葡萄汁按质量比为1：2混合得到。所述蓝莓汁的制备方法为：取新鲜蓝莓洗净，以转速为2200r/min榨汁3min，500目滤网过滤，得到蓝莓汁。所述葡萄汁的制备方法为：取新鲜葡萄洗净，以转速为2200r/min榨汁3min，500目滤网过滤，得到葡萄汁。
实施例5
一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片得到甘草片，将甘草片粉碎至60目，得到甘草粉；
(2)将甘草粉加甘草粉重量2倍的水浸泡2h，600目滤网过滤，得到浸泡后的甘草粉；
(3)将浸泡后的甘草粉加浸泡后的甘草粉重量15的水置于温度为-15℃冷冻2.5h，然后置于温度为50℃解冻至温度为50℃，再加入浸泡后的甘草粉重量0.6％的果胶酶和甘草粉重量0.25％的木瓜蛋白酶在温度为50℃、超声功率为200W、超声频率为20kHz进行超声酶解6h，升温至96℃保温10min灭酶活，得到酶解混合物；向酶解混合物中加入发酵剂，在摇床温度为35℃，转速为150r/min，发酵时间15h，600目滤网过滤，将滤液升温至96℃保温10min灭菌，静置6h，取静置后的上清液在温度为80℃、绝对压强为0.01MPa减压浓缩至相对密度25℃时为1.060得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数95％乙醇水溶液，使乙醇体积分数达到75％，静置10h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量3倍体积分数95％乙醇水溶液浸泡4h，2000r/min离心20min，600目滤网过滤，取沉淀在温度为70℃干燥15h，重复3次，得到甘草多糖。
所述步骤(1)中甘草片的厚度控制在2-3mm。
所述步骤(3)中酶解混合物、发酵剂的质量比为1：0.01。
所述步骤(3)中发酵剂的制备方法为：将3重量份玉米粉、1重量份磷酸氢二钾、1重量份硫酸镁、0.8重量份海藻酸钠、0.7重量份柠檬酸铵加入980重量份水中混合均匀，升温至96℃保温10min灭菌，再加入15重量份酵母菌混合均匀，得到发酵剂。
测试例1
将实施例和对比例得到甘草多糖进行多糖含量测试。具体结果见表1。
苯酚-硫酸法对甘草多糖的含量测定
1、标准曲线的绘制
1.1标准系列溶液的配制
称取干燥至恒重(105℃)的葡萄糖50mg，置于50mL容量瓶(1mg/mL)，加水溶解稀释至刻度制成储备液，从储备液中分别精密移取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL分别置于6个50mL的容量瓶中，定容，配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/mL的葡萄糖标准系列溶液。
1.2苯酚溶液的配制
称取苯酚40g，加入蒸馏水10mL，即为80％的苯酚溶液，冰箱中密封避光长期保存。取密封避光保存的80％苯酚溶液，放置于室温，精密移取1.5mL，再精密移取18.5mL的蒸馏水，即为6％的苯酚溶液，临用前现配。
1.3标准曲线的绘制
精密移取葡萄糖标准系列溶液各1.0mL，空白取1.0mL。分别置于洁净的试管中，各加6％的苯酚1.0mL后充分振摇，再迅速加入浓硫酸5.0mL，迅速振摇，后置于沸水浴中约10min，取出摇匀放置室温(约25min)，后于490nm下测定吸光度。以吸光度(Y)对葡萄糖浓度(X)进行线性回归，得回归方程。
2、换算因子的计算
精密称定精制甘草多糖50mg，定容于50mL容量瓶中，配制成浓度1mg/mL的储备液，从中移取1mL置于50mL的容量瓶中，定容，配制成0.02mg/mL的待测液。苯酚-硫酸比色法测定其吸光度，由回归方程求出此精制甘草多糖储备液中葡萄糖的质量浓度，按下式计算换算因子：
换算因子(f)＝C样品/C葡萄糖
3、多糖的含量测定
精密称定甘草多糖50mg，定容于50mL容量瓶中，配制成浓度为1mg/mL的储备液。从中取出2.5mL置于50mL容量瓶中，定容，配制成0.05mg/mL的待测液。精密移取待测液1.0mL，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，根据标准曲线计算其中的多糖浓度，按照以下公式算出多糖的含量：
多糖含量(％)＝C×D×f×V/W×100％
C：供试品中葡萄糖浓度(g/mL)；D：供试品的稀释因素；f：换算因子；V：供试品体积(mL)；W：供试品的重量(g)。
每个样品测试5次，取平均值。
表1：多糖含量测试结果表
测试例2
将实施例和对比例得到甘草多糖进行抗疲劳测试。具体结果见表2。
动物：SPF级昆明小鼠，雄性，体重20±2g，由中国食品药品检定研究院提供，实验动物生产许可证：SCXK(京)2014-0013。
方法：实验环境下适应性喂养3天后随机分为10组，每组10只。将甘草多糖用甘草多糖4倍的水溶解得到多糖液，正常对照组每天灌胃150mg/kg·d生理盐水28天，其余各组连续灌胃150mg/kg·d多糖液28天，每天下午灌胃，灌胃前进行体重的测定。
负重游泳实验：于末次灌胃30min后，将尾根部负荷小鼠自身体重6％铁丝的小鼠置于游泳箱(尺寸：长60cm×宽60cm×高50cm)中游泳，水深30cm，水温25℃左右，记录小鼠从游泳到其头部沉入温水中8s后，不能再露出水面的时间，即为小鼠的力竭游泳时间。各组与对照组相比P<0.05，有显著性差异。
表2：力竭游泳时间结果表
本发明甘草多糖的分离纯化工艺，对甘草进行冷冻，并进行超声酶解，破坏甘草的细胞壁以利于甘草多糖的浸出，再经发酵工艺，后续分离纯化，提取工艺简单易行，甘草多糖的得率与含量较高，得到甘草多糖的活性较高，,某市售的甘草多糖小鼠力竭游泳时间仅为9.6min，蛋白质残余率低，甘草多糖的纯度高，具有调节机体免疫功能、抗疲劳的作用。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种甘草多糖的分离纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片，得到甘草片；
(2)将甘草片加甘草片重量1-5倍的水浸泡1-4h；
(3)弃掉浸泡液，再加入甘草片重量2-4倍的水，升温至80-105℃，提取2-8h，重复提取2-4次，合并提取液，静置2-8h，取静置后的上清液减压浓缩至相对密度为1.055-1.075得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数92-97％乙醇，使乙醇体积分数达到70-80％，静置4-12h，离心，过滤，干燥得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量2-4倍体积分数92-97％乙醇浸泡2-6h，离心，过滤，干燥，重复2-4次，得到甘草多糖。
2.如权利要求1所述甘草多糖的分离纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将甘草切成片得到甘草片，将甘草片粉碎至30-100目，得到甘草粉；
(2)将甘草粉加甘草粉重量1-5倍的水浸泡1-4h，过滤，得到浸泡后的甘草粉；
(3)将浸泡后的甘草粉加浸泡后的甘草粉重量10-20的水置于温度为-20～-10℃冷冻2-3h，然后置于温度为45-55℃解冻至温度为45-55℃，再加入浸泡后的甘草粉重量0.4-1％的果胶酶和甘草粉重量0.1-0.5％的木瓜蛋白酶在温度为45-55℃超声酶解3-9h，升温至94-98℃保温8-12min灭酶活，得到酶解混合物；向酶解混合物中加入发酵剂，在摇床温度为32-38℃，转速为120-180r/min，发酵时间10-20h，过滤，将滤液升温至94-98℃保温8-12min灭菌，静置2-8h，取静置后的上清液减压浓缩至相对密度为1.055-1.075得到浓缩物；
(4)向浓缩物中加体积分数92-97％乙醇，使乙醇体积分数达到70-80％，静置4-12h，离心，过滤，干燥得到初提取物；向初提取物中加初提取物重量2-4倍体积分数92-97％乙醇浸泡2-6h，离心，过滤，干燥，重复2-4次，得到甘草多糖。
3.如权利要求2所述甘草多糖的分离纯化工艺，其特征在于，所述步骤(1)中甘草片的厚度控制在1-5mm。
4.如权利要求2所述甘草多糖的分离纯化工艺，其特征在于，所述步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中过滤用的滤网均为400目-1200目的滤网。
5.如权利要求2所述甘草多糖的分离纯化工艺，其特征在于，所述步骤(3)中酶解混合物、发酵剂的质量比为1：(0.005-0.015)。
6.如权利要求2所述甘草多糖的分离纯化工艺，其特征在于，所述步骤(3)中发酵剂的制备方法为：将2-5重量份玉米粉、2-5重量份发酵助剂、0.5-2重量份磷酸氢二钾、0.5-2重量份硫酸镁、0.5-2重量份海藻酸钠、0.5-2重量份柠檬酸铵加入950-990重量份水中混合均匀，升温至94-98℃保温8-12min灭菌，再加入10-20重量份酵母菌混合均匀，得到发酵剂。
7.如权利要求6所述甘草多糖的分离纯化工艺，其特征在于，所述发酵助剂为蓝莓汁和/或葡萄汁。
8.如权利要求7所述甘草多糖的分离纯化工艺，其特征在于，所述蓝莓汁的制备方法为：取新鲜蓝莓洗净，榨汁，过滤，得到蓝莓汁。
9.如权利要求7所述甘草多糖的分离纯化工艺，其特征在于，所述葡萄汁的制备方法为：取新鲜葡萄洗净，榨汁，过滤，得到葡萄汁。
10.如权利要求2所述甘草多糖的分离纯化工艺，其特征在于，所述步骤(4)中离心的转速为1500-2500r/min、时间为10-30min；所述步骤(4)中干燥的温度为60-90℃，时间为10-20h。
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