CN104231096B

CN104231096B - 一种采用超声波辅助脱脂提取厥麻多糖的方法

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Publication number: CN104231096B
Application number: CN201310233865.8A
Authority: CN
Inventors: 段玉虎; 田晓柱
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-06-13
Filing date: 2013-06-13
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2033-06-13
Also published as: CN104231096A

Abstract

本发明提供一种采用超声波辅助脱脂提取厥麻多糖的方法，它以厥麻为原料，加入石油醚后，采用不同温度回流脱脂，挥干溶媒后用乙醇常温浸泡洗涤，加入蒸馏水，转入超声波提取设备，超声提取过滤，收集水提液，滤渣再加水超声提取两次，合并水提液，旋转蒸发浓缩后加入木瓜蛋白酶液酶解，离心后取上清液，用微抽滤仪抽滤，进一步除去较细的滤渣，浓缩收集到的滤液，再用正丁醇和氯仿的混合液,萃取3～5次,收集上层水相，向水相中加入乙醇，静置后离心收集沉淀，冷冻干燥将得到纯化的蕨蔴多糖。

Description

一种采用超声波辅助脱脂提取厥麻多糖的方法

技术领域

本发明涉及医药化工技术领域，具体涉及一种采用超声波辅助脱脂提取厥麻多糖的方法。

背景技术

蕨麻是青藏高原的一种特有经济作物，常用作保健品以及藏药使用。食用蕨麻系列食品能消除疲劳，恢复体力，提高抗应激能力和抗缺氧能力，并可调节人体免疫功能。蕨麻的药用有效成分取决于其中含有的蕨麻多糖、酚酸以及黄酮类化合物，因此这些有效成分的提取对于蕨麻的药用价值至关重要。

目前，对于蕨麻的提取方法已有很多报道。蕨麻多糖是水溶性的，因此常用的方法是水提醇沉，具体是指采用热水提取、乙醇沉淀法从蕨麻中提取多糖组分，采用酶法脱去粗多糖中含有的淀粉等类似物，然后用蛋白酶脱去蛋白，就能得到蕨麻粗多糖，最后再对蕨麻粗多糖进行进一步的理化性质分析。

为了进一步提高蕨麻多糖的产率，通过单因素和正交实验，优化热水浸提的方法提取蕨麻多糖，并比较其与微波辅助提取法的提取产率，结果发现，用微波法提取蕨麻多糖的方法，优于热水浸提的方法。利用闪式提取法提取蕨麻中的酚酸，结果显示，闪式提取法比热水回流法和超声波法所提取的厥麻中的总酚酸含量高，并且具有用时短、无成分破坏、常温提取节能的优点。另外，蕨麻的粉碎物用90%的乙醇回流提取，减压除净乙醇得到的乙醇提取物具有抗氧化和抗缺氧的作用。

传统的蕨麻多糖的提取方法具有耗时比较长，溶剂用量大，产率低、成本高等缺点，因此，在提取过程中，如何能避免上述技术问题、克服现有技术缺陷，得到目标生物活性物质是有待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有提取方法耗时较长，溶剂用量大，产率低、成本高等缺点的不足，采用超声波辅助脱脂提取厥麻多糖的方法，研究蕨麻多糖的抗疲劳和疲劳恢复作用，为科学体育运动提供有价值的参考。

为了实现上述目的，本发明一种采用超声波辅助脱脂提取厥麻多糖的方法，所采用的技术方案具体如下：

一：厥麻多糖的提取方法

（1）取200g蕨麻干粉，置于1000ml烧瓶中，加入400ml石油醚，采用70℃_~90℃回流脱脂1h；

（2）挥干溶媒后加入400ml、50%_~90%的乙醇，常温浸泡洗涤2次，每次4h，挥干溶媒后加入200ml蒸馏水，转入超声波提取设备，40℃超声（功率80W_~160W）提取20min_~40min，过滤，收集水提液，滤渣再加水超声提取两次，合并水提液，旋转蒸发浓缩至200ml；

（3）向其中加入10μg/ml木瓜蛋白酶液2ml，在40℃下酶解10h，将酶解液于1000r/min离心5min，取上清液，用微抽滤仪抽滤（压力为0.05-0.1MPa），进一步除去较细的滤渣，浓缩收集得到的滤液；

（4）再用正丁醇和氯仿体积比为1∶2～4的混合液,萃取3～5次,收集上层水相，向水相中加入80%的乙醇，静置10h，然后在4000r/min的转速下离心5min,收集沉淀，冷冻干燥得到纯化的蕨蔴多糖。

二：厥麻多糖的检测

（1）使用碘—碘化钾反应法证实提取的蕨麻多糖中不含淀粉，具体操作为：在白瓷板的凹槽中加入200u1蕨麻多糖水溶液，加入碘—碘化钾溶液50u1，观察颜色变化，以蒸馏水做阴性对照，1%淀粉溶液做阳性对照，结果显示蕨麻多糖水溶液显阴性，说明该方法提取的蕨麻多糖中不含淀粉；

（2）通过茚三酮反应检测蕨麻多糖中是否含有氨基酸或蛋白质，具体操作为：取1%蕨麻多糖水溶液1ml，加入0.1%茚三酮溶液0.5ml，混匀，煮沸5min，观察颜色变化，以蒸馏水做阴性对照，0.5%甘氨酸溶液做阳性对照，颜色反应显示，蕨麻多糖中不含氨基酸或蛋白质等杂质。

三：厥麻多糖提取方法的优化

通过单因素法和正交法，选择合适的温度和乙醇浓度（表1），然后在最佳温度和乙醇浓度条件下，选择最优的功率和提取时间（表2）。通过不同的提取方法，每一条件下平行做5组，统计分析比较，优化提取方法，脱脂温度在70℃，90%乙醇浸泡洗涤2次，超声功率选择80W提取时间30min条件下，蕨麻多糖的提取率为12.38%，苯酚-硫酸法测得总糖含量超过95%。常规的超声波提取方法，蕨麻多糖的提取率为11.89%，总糖含量为92.44%；水提醇沉法蕨麻多糖的提取率为11.47%，苯酚-硫酸法测得总糖含量为82.19%。与已报道的超声波提取方法相比，本方法对蕨麻先脱脂处理，这个过程也有利于蕨麻多糖从有机质中脱落，进一步提高产率。另外，功率和提取时间上都有所降低，进一步节约时间和成本。

表 1 提取温度与乙醇浓度为变量条件下比较提取率与总糖含量

实验	温度（℃）	乙醇浓度（%）	时间（min）	功率（W）	提取率（%）	总糖含量（%）
							1	70	50	20	80	8.11±0.37	88.66±1.02
2	80	50	20	80	8.24±0.46	88.78±1.71
							3	90	50	20	80	7.97±0.39	88.61±1.75
4	70	70	20	80	8.55±0.41	89.26±1.22
							5	80	70	20	80	8.17±0.66	91.47±1.37
6	90	70	20	80	8.64±0.29	91.03±1.89
							7	70	90	20	80	11.07±0.71	91.44±1.49
8	80	90	20	80	10.89±0.61	92.36±1.08
							9	90	90	20	80	11.01±0.48	91.45±1.22

表 2 提取时间与超声波功率为变量条件下比较提取率与总糖含量

实验	温度（℃）	乙醇浓度（%）	时间（min）	功率（W）	提取率（%）	总糖含量（%）
							1	70	90	20	80	11.07±0.71	91.44±1.49
2	70	90	20	120	11.01±0.39	93.19±1.21
							3	70	90	20	160	10.94±0.69	93.61±1.06
4	70	90	30	80	12.38±0.41	95.26±0.55
							5	70	90	30	120	12.17±0.59	95.47±0.92
6	70	90	30	160	12.64±1.19	96.03±0.78
							7	70	90	40	80	11.87±0.88	95.07±1.01
8	70	90	40	120	12.89±1.66	95.49±0.78
							9	70	90	40	160	12.19±1.37	96.12±0.69

四：厥麻多糖的抗疲劳测试原理

抗疲劳常用的指标包括运动耐力、血清尿素(BUN)、肝糖原。其中运动耐力是反映机体疲劳最直接、最客观的指标。运动耐力的测定方法为运动跑台、爬杆和游泳，以小鼠为研究对象的评价选择负重游泳为衡量的指标，血清尿素氮含量可反映体内蛋白质分解情况。长时间较大强度运动时，血清尿素氮的变化范围明显，血清尿素氮与机体机能、疲劳程度以及负荷量的大小呈正相关关系，用来作为评定运动量的指标，糖原的含量说明疲劳发生的快慢和程度。如果受试物组肝糖原明显高于对照组，且差异有显著性，则说明该受试物能够通过增加肝糖原储备或减少运动时肝糖原的消耗，从而为机体提供更多的能量，达到抗疲劳的目的。因此，肝糖原含量是一个较敏感的指标。血清乳酸是研究者用来评价抗疲劳功效的指标之一，若一项以上(含1项)耐力运动试验和二项以上(含2项)生化指标为阳性，即可以判定受试物具有抗疲劳潘陛酸脱氢酶(LDH)的催化下还原为酸生代谢产物血清乳酸，血清乳酸水平可以反映有氧代谢能力、疲劳的产生和消除速度。

本发明一种采用超声波辅助脱脂提取厥麻多糖的方法，其有益效果是对蕨麻多糖的提取方法进行了改进，研究了蕨麻多糖在抗缺氧、抗疲劳以及疲劳恢复上的作用，明确了蕨麻多糖的药理作用。

使用超声波辅助法提取蕨麻多糖，实现了蕨麻多糖提取率高、节能、节时的目标，总糖含量超过95%，可用来做药理学研究。蕨麻多糖对小鼠抗缺氧的作用，意义明显，长期喂食蕨麻多糖，能够提高小鼠的血氧饱和度，进一步说明蕨麻具有抗缺氧的作用，从而表明能够提高人的抗缺氧能力，揭示高原地区蕨麻作为食品的应用价值，很好的解释高原地区生活的人们对缺氧环境的适应。

蕨麻多糖对运动小鼠的抗疲劳以及疲劳恢复作用，统计学都有显著性意义，从而为开发价格低廉的天然产物，提高全民的身体素质提供依据；利用蕨麻的多糖成分对疲劳产生的生理机制的抑制作用，将蕨麻多糖运用在体育训练的疲劳恢复中，提高运动员疲劳恢复能力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明：

实施例1：

称取200.00g蕨麻干粉，置于1000ml烧瓶中，加入400ml石油醚，70℃回流脱脂一小时，挥干溶媒后加入400ml、50%的乙醇，常温浸泡洗涤2次，每次4h，挥干溶媒后加200ml蒸馏水，转入超声波提取设备，40℃超声、功率为80W提取20min，过滤，收集水提液，滤渣再加水超声提取两次，合并水提液，旋转蒸发浓缩至200ml，向其中加入10μg/ml木瓜蛋白酶液2ml在温度40℃下酶解10h，然后将酶解液于1000r/min离心5分钟，取上清液，用微抽滤仪抽滤（压力为0.05MPa），进一步除去较细的滤渣，浓缩收集到的滤液，再用正丁醇和氯仿体积比为1∶2的混合液,萃取5次,收集上层水相，向水相中加入80%乙醇，静置10h，然后在4000r/min的转速下离心5min,收集沉淀，冷冻干燥将得到纯化的蕨蔴多糖，提取率为8.11%，总糖含量为88.66%。

实施例2：

称取200.00g蕨麻干粉，置于1000ml烧瓶中，加入400ml石油醚，80℃回流脱脂一小时，挥干溶媒后加入400ml、70%的乙醇常温浸泡洗涤2次，每次4h，挥干溶媒后加200ml蒸馏水，转入超声波提取设备，40℃超声，功率为80W提取20min，过滤，收集水提液，滤渣再加水超声提取两次，合并水提液，旋转蒸发浓缩至200ml，向其中加入10μg/ml木瓜蛋白酶液2ml在温度40℃下酶解10h，然后将酶解液于1000r/min离心5分钟，取上清液，用微抽滤仪抽滤（压力为0.05），进一步除去较细的滤渣，浓缩收集到的滤液，再用正丁醇和氯仿体积比为1∶4的混合液,萃取5次,收集上层水相，向水相中加入80%乙醇，静置10h，然后在4000r/min的转速下离心5min,收集沉淀，冷冻干燥将得到纯化的蕨蔴多糖，提取率为8.17%，总糖含量为91.47%。

实施例3：

称取200.00g蕨麻干粉，置于1000ml烧瓶中，加入400ml石油醚，70℃回流脱脂一小时，挥干溶媒后加入400ml、90%的乙醇常温浸泡洗涤2次，每次4h，挥干溶媒后加200ml蒸馏水，转入超声波提取设备，40℃超声、功率为160W提取40min，过滤，收集水提液，滤渣再加水超声提取两次，合并水提液，旋转蒸发浓缩至200ml，向其中加入10μg/ml木瓜蛋白酶液2ml在温度40℃下酶解10h，然后将酶解液于1000r/min离心5分钟，取上清液，用微抽滤仪抽滤（压力为0.05，进一步除去较细的滤渣，浓缩收集到的滤液，再用正丁醇和氯仿体积比为1∶3的混合液,萃取5次,收集上层水相，向水相中加入80%乙醇，静置10h，然后在4000r/min的转速下离心5min,收集沉淀，冷冻干燥将得到纯化的蕨蔴多糖，提取率为12.19%，总糖含量为96.12%。

本发明厥麻多糖抗疲劳效果动物实验：

将300只小鼠放入水深不低于30 cm，水温25±0.5 ℃自制的水槽中进行负重游泳训练，负重重量为其体重的5%，每两天训练一次，每次30 min，共训练三次，根据训练情况将体质弱的淘汰，体质好，游泳耐力时间相差不超过10 min的小鼠作为实验对象，随机分为对照组、低、中、高剂量组，每组50只。蕨麻多糖用0.9%生理盐水溶解稀释成不同的浓度（40 mg/ml、80 mg/ml、160 mg/ml）。小鼠灌胃体积0.2 ml，对照组小鼠用0.9%生理盐水灌胃处理，低、中、高剂量组分别灌胃给予蕨麻多糖0.4 g/kg，0.8 g/kg，1.6 g/kg，每天一次，连续给药28d。

末次给药30 min后，从对照组和实验组分别取10只小鼠，在水温25±0.5 ℃的游泳箱中不负重游泳60 min，分别在游泳前、游泳后立即以及游泳后30 min后尾静脉采血，用乙醛、对羟基联苯比色法测定血清乳酸含量。末次给药30 min后，从对照组和实验组分别取10只小鼠，在水温25±0.5 ℃的游泳箱中不负重游泳60 min，分别在游泳前、游泳后立即以及游泳后30 min后尾静脉采血，离心取血清用二乙酰—肟法测定血清尿素氮含量。

实验结果表明（表3），运动前小鼠血清乳酸含量实验组与对照组相比没有显著性差异，运动后立即测定小鼠血清乳酸含量，中剂量和高剂量组都比对照组有明显的降低，低剂量则没有显著性差异，运动后30min再测定血清乳酸含量，高剂量组与对照组相比，血清乳酸含量明显降低。统计分析显示，此时血清乳酸含量恢复到运动前的水平，而对照组、低剂量和高剂量组没有显著性差异，并且都明显的高于相应的运动前的血清乳酸含量，结果表明蕨麻多糖能够有效的改善运动后血清乳酸的含量。

表3 厥麻多糖对小鼠血清乳酸的影响

注：^*P<0.05，^**P<0.01VS对照组；^#P<0.05VS运动前

表4显示，运动前小鼠血清尿素氮含量实验组与对照组相比没有显著性差异，运动后立即和运动后30 min测定小鼠血清尿素氮含量，与对照组相比，低剂量和中剂量组都没有明显的差异，高剂量组则明显的降低。表明蕨麻多糖能够降低血清尿素氮的水平。

表4厥麻多糖对小鼠血清尿素氮的影响

注：^*P<0.05，^**P<0.01VS对照组；^#P<0.05VS运动前

从本发明厥麻多糖抗疲劳效果的动物实验发现，小鼠灌胃蕨麻多糖28天后，与对照组相比，中、高剂量组能够有效改善运动后血清乳酸的含量，运动后30分钟测得的血清乳酸含量统计分析显示，高剂量组血清乳酸含量基本上恢复到运动前的水平，说明蕨麻多糖对于延缓小鼠疲劳以及疲劳运动后体能的恢复具有显著作用。另外，由于长时间高强度运动，机体需要消耗蛋白来提供能量，这样就会引起血清中尿素氮含量的增加，血清尿素氮与机体机能、疲劳程度以及负荷量的大小密切相关，因此也常用来作为评价运动量的指标。结果显示，蕨麻多糖能够降低血清尿素氮的水平，从而提高小鼠对运动负荷的适应性和机体的运动能力。

试验结果显示，小鼠灌胃蕨麻多糖28天后，其负重游泳时间明显延长，表明蕨麻多糖能够显著的提高小鼠的运动能力，也说明蕨麻多糖能够延缓小鼠的疲劳发生，具有一定的抗疲劳作用。实验还发现，蕨麻多糖溶液能够剂量依赖性的延长密闭条件下小鼠的存活时间，表明蕨麻多糖能够提高小鼠的抗缺氧能力。

Claims

1.一种采用超声波辅助脱脂提取厥麻多糖的方法，其特征是该方法的步骤为：

(1)称取200.00g蕨麻干粉，置于1000ml烧瓶中，加入400ml石油醚，采用70℃回流脱脂1h；

(2)挥干溶媒后加入400ml、90％的乙醇常温浸泡洗涤2次，每次4h，挥干溶媒后加200ml蒸馏水，转入超声波提取设备，40℃超声提取30min，超声功率为80W，过滤，收集水提液，滤渣再加水超声提取两次，合并水提液，旋转蒸发浓缩至200ml；

(3)向其中加入10μg/ml木瓜蛋白酶液2ml在温度40℃下酶解10h，然后将酶解液于1000r/min离心5分钟，取上清液，用微抽滤仪抽滤，压力为0.1MPa，进一步除去较细的滤渣，浓缩收集到的滤液；

(4)再用正丁醇和氯仿体积比为1∶2的混合液,萃取5次,收集上层水相，向水相中加入80％乙醇，静置10h，然后在4000r/min的转速下离心5min,收集沉淀，冷冻干燥将得到纯化的蕨蔴多糖。