CN106636269A - 一种高效提取活性蛋白的方法 - Google Patents

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杨帆
陈子阳
陈常健
宋丽婉
宣丹维
董严
王斌
陈荫
赵玉勤
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Abstract

本发明提供一种高效提取活性蛋白的方法：1）预处理；2）脱脂；3）提取活性蛋白；4）冻干保存。本发明的有益效果是：在提取活性蛋白步骤中加入酶解剂、助溶剂析出剂。酶解剂：木瓜蛋白酶8~15份，半胱氨酸1~2份，亚硫酸钠0.5~0.8份和葡萄糖胺2~4份。可快速水解辣木籽蛋白；助溶剂：水杨酸钠5~10份，氯化镁1~3份和磷酸铵2~5份。可以和辣木籽中的活性蛋白形成水溶性的分子间络合物，提高活性蛋白的溶解度，提高活性蛋白的提取率；析出剂：硫酸铵3~5份，氯化钠1~3份，硝酸钾0.5~1份和维生素C2~5份。所述析出剂的蛋白质析出范围小，析出的活性蛋白纯度高，析出率高达98%以上且蛋白活性高。

Description

一种高效提取活性蛋白的方法
技术领域
本发明涉及活性蛋白提取技术领域，具体是一种高效提取活性蛋白的方法。
背景技术
辣木籽是原产于自然条件极其恶劣的印度辣木树的种子，辣木树被称为“奇迹之树”又称为鼓槌树，含有丰富营养，高维生素 A、B、C、E，高蛋白质、高纤维。据研究，辣木籽中各成分的质量分数为辣木油 33.5%、辣木蛋白 37.9%、淀粉 6.1%、可溶性总糖 17.1%（其中辣木多糖 12.3%）、粗纤维 7.5%及丰富的宏量元素如 ：钙、钾、镁、钠、磷和微量元素如 ：锌、铜、铁等。辣木籽中的活性蛋白具有非常强的抗氧化性，可以去除自由基，起到祛斑美白抗衰老的作用。现有很多从植物中提取蛋白的技术，如授权公告号为CN103976413B的中国发明专利，公开了一种从核桃粕中连续提取蛋白质和膳食纤维的方法。该方法首先将核桃粕在真空度 60kpa~80kpa 和功率100kw~200kw 的条件下 进行微波干燥 30min~40min，经超微粉碎过筛后，采用碱法 - 微波提取与冷冻干燥结合提取核桃蛋白质，并对其沉淀物采用复合酶一步降解并进行醇沉和离心后，在进风温度 120℃ ~180℃，出风温度 60℃ ~80℃和压缩空气流量 500mL/h~800mL/h 的条件下进行气流喷雾干燥得到水溶性和水不溶性膳食纤维。该方法提高了核桃蛋白质的溶出率，保持了蛋白的活性和营养价值 ；提高了酶解效率和膳食纤维的纯度和产率，实现了废料再利用，解决了资源浪费和环境污染等问题。但该方法提取的蛋白纯度不高，蛋白提取率也有待提高且操作步骤繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效提取活性蛋白的方法，所述的方法不但能保持蛋白的活性而且蛋白提取率高，纯度高，活性好，操作简单。
本发明为解决上述背景技术中提出的问题所采取的技术方案为：
预处理：将辣木籽晒干，去皮，得到白色球状的内子，去离子水浸泡，干燥，超微粉碎，过筛。去离子水可有效去除水溶性杂质，为活性蛋白的提取做准备，使提取出的活性蛋白纯度高；脱脂：往内子粉末中加入脱脂剂和活性剂，磁力搅拌，搅拌速率为40~60r/min，持续20~40min，静置1~2天，过滤得块状粉末。再将粉末在吸油纸上平铺开，在通风处自然风干后过60~80目筛。同性相溶，该方法不但能很好的去除油脂，还能保持蛋白活性；
提取活性蛋白：往过筛后的内子粉末中加入料液体积比为1:45~1:55，浓度为1.4~1.6mol/L 的Tris—HCl缓冲液，磁力搅拌，搅拌速率为40~60r/min，水浴加热，持续时间为80~100min，温度为55~65℃。加入酶解剂和助溶剂，酶解时间100~200min，pH为5.7~6.5。离心取上清液，上清液中加入析出剂，静置过滤得印度辣木籽中活性蛋白。得到的活性蛋白纯度高，活性强，具有很高的抗氧化性，清除自由基能力强；
冻干保存：所述的冻干操作为二次阶段，第一阶段温度为5~10℃，真空度为10~30Pa，停留时间20min；第二阶段温度为15~20℃，真空度为20~45Pa，停留时间30min 。
酶解剂成份及其重量份为：木瓜蛋白酶8~15份，半胱氨酸1~2份，亚硫酸钠0.5~0.8份和葡萄糖胺2~4份。木瓜蛋白酶对辣木籽蛋白有很强的酶解活性，而且半胱氨酸，亚硫酸钠和葡萄糖胺对木瓜蛋白酶有激活作用，可提高水解速率。
助溶剂成份及其重量份为：水杨酸钠5~10份，氯化镁1~3份和磷酸铵2~5份。助溶剂可以和辣木籽中的活性蛋白形成水溶性的分子间络合物，提高活性蛋白的溶解度，提高活性蛋白的提取率。
析出剂成份及其重量份为：硫酸铵3~5份，氯化钠1~3份，硝酸钾0.5~1份和维生素C2~5份。由于蛋白质在水溶液中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面的水分子数目，即蛋白质表面亲水基团与水分子形成水化膜的程度和带电荷的情况，当硫酸铵、氯化钠和硝酸钾加入蛋白质溶液时，由于中性盐对水分子的亲和力大于活性蛋白质，蛋白质分子周围的水化膜减弱或消失，活性蛋白质溶解度降低。同时由于中性盐的加入，蛋白质溶液的离子强度发生了改变，蛋白质表面电荷被大量中和，更加导致蛋白质溶解度降低，活性蛋白质分子之间互相聚集而发生沉淀。硫酸铵、氯化钠、硝酸钾和维生素C能使活性蛋白的析出率高达98%以上；
本发明的有益效果是：脱脂后的内子粉与Tris—HCl缓冲液反应后加入酶解剂和助溶剂，离心过滤后在上清液中加入析出剂。酶解剂：木瓜蛋白酶8~15份，半胱氨酸1~2份，亚硫酸钠0.5~0.8份和葡萄糖胺2~4份。木瓜蛋白酶对辣木籽蛋白有很强的酶解活性，而且半胱氨酸，亚硫酸钠和葡萄糖胺对木瓜蛋白酶有激活作用，可提高水解速率；助溶剂：水杨酸钠5~10份，氯化镁1~3份和磷酸铵2~5份。助溶剂可以和辣木籽中的活性蛋白形成水溶性的分子间络合物，提高活性蛋白的溶解度，提高活性蛋白的提取率；析出剂：硫酸铵3~5份，氯化钠1~3份，硝酸钾0.5~1份和维生素C2~5份。所述析出剂的蛋白质析出范围小，析出的活性蛋白纯度高，析出率高达98%以上且蛋白活性高。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明方案进行进一步的详细描述。
实施例1：
一种高效提取活性蛋白的方法
1）预处理：将辣木籽晒干，去皮，得到白色球状的内子，去离子水浸泡，干燥，超微粉碎，过筛。去离子水可有效去除水溶性杂质，为活性蛋白的提取做准备，使提取出的活性蛋白纯度高；2）脱脂：往内子粉末中加入脱脂剂和活性剂，磁力搅拌，搅拌速率为40~60r/min，持续20~40min，静置1~2天，过滤得块状粉末，再将粉末在吸油纸上平铺开，在通风处自然风干后过60~80目筛。同性相溶，该方法不但能很好的去除油脂，还能保持蛋白活性；
3）提取活性蛋白：往过筛后的内子粉末中加入料液体积比为1:45~1:55，浓度为1.4~1.6mol/L 的Tris—HCl缓冲液，磁力搅拌，搅拌速率为40~60r/min，水浴加热，持续时间为80~100min，温度为55~65℃。加入酶解剂和助溶剂，酶解时间100~200min，pH为5.7~6.5。离心取上清液，上清液中加入析出剂，静置过滤得印度辣木籽中活性蛋白。得到的活性蛋白纯度高，活性强，具有很高的抗氧化性，清除自由基能力强；
4）冻干保存：所述的冻干操作为二次阶段，第一阶段温度为5~10℃，真空度为10~30Pa，停留时间20min；第二阶段温度为15~20℃，真空度为20~45Pa，停留时间30min 。
酶解剂成份及其重量份为：木瓜蛋白酶8~15份，半胱氨酸1~2份，亚硫酸钠0.5~0.8份和葡萄糖胺2~4份。木瓜蛋白酶对辣木籽蛋白有很强的酶解活性，而且半胱氨酸，亚硫酸钠和葡萄糖胺对木瓜蛋白酶有激活作用，可提高水解速率。
助溶剂成份及其重量份为：水杨酸钠5~10份，氯化镁1~3份和磷酸铵2~5份。助溶剂可以和辣木籽中的活性蛋白形成水溶性的分子间络合物，提高活性蛋白的溶解度，提高活性蛋白的提取率。
析出剂成份及其重量份为：硫酸铵3~5份，氯化钠1~3份，硝酸钾0.5~1份和维生素C2~5份。由于蛋白质在水溶液中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面的水分子数目，即蛋白质表面亲水基团与水分子形成水化膜的程度和带电荷的情况，当硫酸铵、氯化钠和硝酸钾加入蛋白质溶液时，由于中性盐对水分子的亲和力大于活性蛋白质，蛋白质分子周围的水化膜减弱或消失，活性蛋白质溶解度降低。同时由于中性盐的加入，蛋白质溶液的离子强度发生了改变，蛋白质表面电荷被大量中和，更加导致蛋白质溶解度降低，活性蛋白质分子之间互相聚集而发生沉淀。硫酸铵、氯化钠、硝酸钾和维生素C能使活性蛋白的析出率高达98%以上。
实施例2
1）预处理：将辣木籽晒干，去皮，得到白色球状的内子，去离子水浸泡，干燥，超微粉碎，过筛。去离子水可有效去除水溶性杂质，为活性蛋白的提取做准备，使提取出的活性蛋白纯度高；2）脱脂：往内子粉末中加入脱脂剂和活性剂，磁力搅拌，搅拌速率为60r/min，持续20min，静置1~2天，过滤得块状粉末，再将粉末在吸油纸上平铺开，在通风处自然风干后过80目筛。同性相溶，该方法不但能很好的去除油脂，还能保持蛋白活性；
3）提取活性蛋白：往过筛后的内子粉末中加入料液体积比为1:50，浓度为1.5mol/L 的Tris—HCl缓冲液，磁力搅拌，搅拌速率为40r/min，水浴加热，持续时间为90min，温度为60℃。加入酶解剂: 木瓜蛋白酶10份，半胱氨酸1份，亚硫酸钠0.5份和葡萄糖胺3份，助溶剂：水杨酸钠7份，氯化镁2份和磷酸铵5份及0.01~0.03份（优选0.01份）的聚乙二醇。酶解时间150min，pH为6.1。离心取上清液，上清液中加入析出剂：硫酸铵3份，氯化钠2份，硝酸钾0.8份和维生素C4份，静置过滤得印度辣木籽中活性蛋白。采用新的助溶剂组合物能较现有技术具有有益的生产意义，在速度和效率上有显著增效且活性保持更好。所述的析出剂对辣木籽中的活性蛋白针对性强，析出率高达98%以上，得到的活性蛋白纯度高，活性强，具有很高的抗氧化性，清除自由基能力强；
4）冻干保存：所述的冻干操作为二次阶段，第一阶段温度为8℃，真空度为15Pa，停留时间20min；第二阶段温度为20℃，真空度为40Pa，停留时间30min ；
5）蛋白含量测定：通过总蛋白定量测试盒测定总蛋白含量，测定结果是蛋白含量为186066.1μg/g。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (7)

1.一种高效提取活性蛋白的方法，其特征在于以下步骤：
1）预处理：将辣木籽晒干，去皮，得到白色球状的内子，去离子水浸泡，干燥，超微粉碎，过筛；2）脱脂：往内子粉末中加入脱脂剂和活性剂，搅拌，静置，过滤得块状粉末，再将粉末风干后过筛；3）提取活性蛋白：往过筛后的粉末中加入Tris—HCl缓冲液，搅拌，水浴加热，加入酶解剂和助溶剂，继续搅拌，离心取上清液，上清液中加入析出剂，静置过滤得印度辣木籽中活性蛋白；4）冻干保存。
2.根据权利要求1所述的一种高效提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述的酶解剂成份及其重量份为：木瓜蛋白酶8~15份，半胱氨酸1~2份，亚硫酸钠0.5~0.8份，葡萄糖胺2~4份。
3.根据权利要求1所述的一种高效提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述的助溶剂成份及其重量份为：水杨酸钠5~10份、氯化镁1~3份、磷酸铵2~5份和0.01~0.03份的聚乙二醇。
4.根据权利要求1所述的一种高效提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述的析出剂成份及其重量份为：硫酸铵3~5份，氯化钠1~3份，硝酸钾0.5~1份和维生素C2~5份。
5.根据权利要求1所述的一种高效提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述的酶解温度为55~65℃，酶解时间100~200min，pH为5.7~6.5。
6. 根据权利要求1所述的一种高效提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述的Tris—HCl缓冲液浓度为1.4~1.6mol/L ，pH为8.5~9，加入量按料液体积比=1:45~1:55加入。
7. 根据权利要求1所述的一种高效提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤4具体操作为：第一阶段温度为5~10℃，真空度为10~30Pa，停留时间10~25min；第二阶段温度为15~20℃，真空度为20~45Pa，停留时间25~35min 。
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