CN102020695A - 一种从芹菜籽中提取天然活性蛋白质和多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从芹菜籽中提取天然活性蛋白质和多肽的方法，该方法通过超声协助提取、硫酸铵沉淀得到具有生物活性(如抗氧化活性)的蛋白质和多肽，再通过常规方法确定提取的蛋白质和多肽的成分及其分子量和确定蛋白质和多肽的抗氧化活性。为维吾尔药食两用植物芹菜籽的生物活性物质基础研究，并开发相应的产品提供了依据。该方法提取过程简单，又不易使蛋白质和多肽失活，制备的蛋白质和多肽生物活性(如抗氧化活性)高，无毒性、热稳定性好，易于扩大规模生产，降低提取过程的成本，是提取制备生物活性蛋白质和多肽的理想方法之一。通过该方法获得的蛋白质和多肽作为制备食品以及化妆品添加剂的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种从芹菜籽中提取天然活性蛋白质和多肽的方法。
背景技术
生物活性肽又称天然肽(natural peptide)，是生物体内一些具有特殊功能肽的统称，是源于蛋白质的多功能化合物。生物活性肽不仅具有多种人体代谢和生理调节功能，还能为机体提供营养。特别是一些低肽不仅有比蛋白质更好的消化吸收性能，还具有促进免疫、调节激素、抗菌、抗病毒、降血压和降血脂等生理功能，食用安全性极高，是当前食品科技界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。因此，没有肽，就没有活性，也就没有生命。
由于抗氧化多肽的分子小，所以直接从动植物组织中提取天然抗氧化多肽时，天然提取资源有限，工艺复杂，成本昂贵。如何提高生产效率、降低成本成为抗氧化多肽的问题。在国内植物多肽类化合物的研究尚处于初始阶段，研究范围小，对于多肽类化合物的化学研究文献很有限，而且使用的方法中植物多肽类化合物回收低，不适用于大规模制备，这很大程度上限制了抗氧化多肽类活性化合物的应用和工业化生产。因此，寻找安全高效的抗氧化替代品就显得十分重要。
植物中的生物活性蛋白质和多肽经常从植物种子中纯化得到，虽然植物其它部位也能分离到植物种子一样的具有生物活性蛋白质和多肽，但含量很低，给分离纯化工作以及应用带来很大的难度。植物种子作为储存蛋白的重要部位，富集大量的具有活性的多种蛋白质和多肽，因此植物种子常常被选为寻找新的生物活性多肽类化合物的研究对象。
芹菜“Apium graveolens L.”又名香芹、旱芹，是伞形科一年生或两年生草本植物，喜肥沃土壤，全国和世界各地均有栽培。芹菜籽为伞形科植物旱芹的干燥成熟果实，已记载于《中华人民共和国卫生部<药品标准>维吾尔药分册》和《维吾尔药志》等书籍，是新疆资源丰富的药食兼用植物资源。维吾尔医认为芹菜籽能消除寒湿闭阻，消食健胃，消肿散气，消石止痛，调和百药，增强泻药的功能，振奋性欲。用于寒湿性大小关节痛疼，颈项疼痛，胁肋疼痛，体内结石，呕吐血痢，小便不通，月事不行，死胎不下以及内脏寒湿性病变。维吾尔医药临床表明，芹菜籽有散气、消肿、利尿、开通阻滞、降血压等功效，在维吾尔药中主要用于治疗高血压病、关节炎、类风湿关节炎、气滞性子宫炎、腹水、肾脏等疾病。
据大量文献检索可知，有关芹菜子蛋白质、多肽等化合物的研究报道较少，曾有专利(其公开号为201010227463.3)报道过有关芹菜籽多肽的提取方法，其中的提取方法是利用常规搅拌提取；本发明在此基础上对提取方法加以改进，利用超声提取芹菜籽中的蛋白质和多肽，并以芹菜籽中的蛋白质和多肽的提取量为考察指标，并通过ABTS自由基清除法评价其抗氧化能力。利用超声提取芹菜籽中的蛋白质和多肽，不仅没有改变蛋白质和多肽的成分，还可以增加提取产量，而且还可以节约时间，进而节约能源。为植物种子中生物活性多肽类化合物的有效提取以及植物资源的充分利用提供了科学依据。
发明内容
本发明目的在于，提供一种从芹菜籽中提取天然活性蛋白质和多肽的方法，该方法通过超声提取、硫酸铵沉淀得到具有生物活性(如抗氧化活性)的蛋白质和多肽，再通过常规方法确定提取的蛋白质和多肽的成分及其分子量和确定蛋白质和多肽的抗氧化活性。为维吾尔药食两用植物芹菜籽的生物活性物质基础研究，并开发相应的产品提供了依据。该方法提取过程简单，又不易使蛋白质和多肽失活，制备的蛋白质和多肽抗氧化活性高，无毒性、热稳定性好，易于扩大规模生产，降低生产成本，是制备生物活性蛋白质和多肽的理想方法之一。通过该方法获得的蛋白质和多肽作为制备食品、药品以及化妆品添加剂的用途。
本发明所述的一种从芹菜籽中提取天然活性蛋白质和多肽的方法，按下列步骤进行：
a、将采用常规方法脱脂芹菜籽用液氮研磨，再用磷酸缓冲液在温度4-50℃超声提取，时间0.25-2.0小时，过滤，将滤液用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；
b、将上清液加入无水硫酸氨，充分搅拌溶解后放置冰箱静置24小时，低温离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到芹菜籽活性蛋白质和多肽；
c、再利用常规方法十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定提取的蛋白质和多肽的成分及其分子量，并对提取的蛋白质和多肽采用2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除来确定蛋白质和多肽的抗氧化活性。
步骤a、b中的提取、分离、纯化过程所用水均为三蒸水。
步骤a、b中的低温离心速度为12000转/分，20min。
步骤a中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01-0.1mol/L，pH＝4.0-10.0。
步骤b中无水硫酸铵饱和度为30％-80％。
通过本发明所述的方法获得的芹菜籽天然活性蛋白质和多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
附图说明
图1为本发明不同提取条件和时间对芹菜籽多肽的提取量的影响图，其中-■-为本发明超声提取；-Δ-为搅拌提取。
图2为本发明提取蛋白质和多肽的15％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳考马斯染色图
其中：0为标准蛋白标记，甲状旁腺激素(1-34)(4.1kDa)，抑肽酶(6.5kDa)，甲状旁腺激素(1-84)(9.5kDa)，溶菌酶(14.4kDa)，胰蛋白酶抑制剂(20.0kDa)，磷酸丙糖异构酶(27.0kDa)，猪胃蛋白酶(35.0kDa)，卵清蛋白(45.0kDa)，牛血清白蛋白(66.0kDa)；图中1为实施例1；2为实施例2；3为实施例3；4为实施例4；5为实施例5；6为实施例6。
具体实施方式
实施例1
蛋白质和多肽的提取：
采用常规方法对芹菜籽进行脱脂，取100克脱脂的芹菜籽用液氮研磨，再用浓度为0.1mol/L，pH＝6.0的磷酸缓冲液在温度4℃超声提取1.5小时，将提取液先用纱布过滤，将滤液用低温离心机除去沉淀，离心速度为12000转/分，时间20min，得到上清液备用；
蛋白质和多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为30％，充分搅拌溶解后放入冰箱中静置24小时，低温离心，离心速度为12000转/分，时间20min，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐，干燥，得到芹菜籽活性蛋白质和多肽。
所述的方法获得的芹菜籽活性蛋白质和多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
实施例2
蛋白质和多肽的提取：
采用常规方法对芹菜籽进行脱脂，取100克脱脂的芹菜籽用液氮研磨，再用浓度为0.08mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液在温度10℃超声提取2.0小时，将提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心机除去沉淀，离心速度为12000转/分，时间20min，得到上清液备用；
蛋白质和多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为40％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，低温离心，离心速度为12000转/分，时间20min，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐，干燥，得到芹菜籽活性蛋白质和多肽。
通过所述的方法获得的芹菜籽活性蛋白质和多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
实施例3
蛋白质和多肽的提取：
采用常规方法对芹菜籽进行脱脂，取100克脱脂的芹菜籽用液氮研磨，再用浓度为0.05mol/L，pH＝8.0的磷酸缓冲液在温度20℃超声提取0.25小时，将提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心机除去沉淀，离心速度为12000转/分，时间20min，得到上清液备用；
蛋白质和多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为50％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，低温离心，离心速度为12000转/分，时间20min，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐，干燥，得到芹菜籽活性蛋白质和多肽；
通过所述的方法获得的芹菜籽活性蛋白质和多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
实施例4
蛋白质和多肽的提取：
采用常规方法对芹菜籽进行脱脂，取100克脱脂的芹菜籽用液氮研磨，再用浓度为0.01mol/L，pH＝4.0的磷酸缓冲液在温度40℃超声提取1小时，将提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心机除去沉淀，离心速度为12000转/分，时间20min，得到上清液备用；
蛋白质和多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为60％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，低温离心，离心速度为12000转/分，时间20min，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐，干燥，得到芹菜籽活性蛋白质和多肽；
通过所述的方法获得的芹菜籽活性蛋白质和多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
实施例5
蛋白质和多肽的提取：
采用常规方法对芹菜籽进行脱脂，取100克脱脂的芹菜籽用液氮研磨，再用浓度为0.03mol/L，pH＝5.0的磷酸缓冲液在温度50℃超声提取0.5小时，将提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心机除去沉淀，离心速度为12000转/分，时间20min，得到上清液备用；
蛋白质和多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为80％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，低温离心，离心速度为12000转/分，时间20min，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐，干燥，得到芹菜籽活性蛋白质和多肽。
通过所述的方法获得的芹菜籽活性蛋白质和多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
实施例6
蛋白质和多肽的提取：
采用常规方法对芹菜籽进行脱脂，取100克脱脂的芹菜籽用液氮研磨，再用浓度为0.04mol/L，pH＝10.0的磷酸缓冲液在温度30℃超声提取0.75小时，将提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心机除去沉淀，离心速度为12000转/分，时间20min，得到上清液备用；
蛋白质和多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为60％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，低温离心，离心速度为12000转/分，时间20min，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐，干燥，得到芹菜籽活性蛋白质和多肽。
通过所述的方法获得的芹菜籽活性蛋白质和多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
实施例7
通过本发明所述方法获得的芹菜籽活性蛋白质和多肽进行分子量范围的确定(如图2所示)：
试剂配制及样品处理：
样品缓冲液：0.5mL的0.5mol/L的三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(pH：6.8)、2mL的10％十二烷基磺酸钠、1mL甘油、0.5mL的β-巯基乙醇、1mL的水、微量的溴酚蓝；
样品的处理：样品溶液和样品缓冲液等体积混合，隔水煮沸10min，离心10min；
电极缓冲液：将15.1克三羟甲基氨基甲烷、94克甘氨酸、50mL的10％十二烷基磺酸钠溶解并定容至4L。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳储存液：30％(W/V)丙烯酰胺、0.8％(W/V)N，N’-甲叉双丙烯酰胺；
15％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶配制：1.1mL的H2O、2.5mL的30％(V/V)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳储存液、1.3mL的1.5mol/L的三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(pH：8.8)、0.05mL的10％(W/V)十二烷基磺酸钠、0.05mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.002mL的N，N，N′，N′-四甲基乙二胺；
5％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶配制：0.68mL的H2O、0.17mL的30％(V/V)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳储存液、0.13mL的0.5mol/L的三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(pH：6.8)、0.01mL的10％(W/V)十二烷基磺酸钠、0.01mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.001mL的N，N，N′，N′-四甲基乙二胺；
电泳条件：恒压100伏，电泳时间约2小时。
考马斯亮蓝脱色液：25％无水乙醇、8％的冰乙酸。
考马斯亮蓝染色液：将0.6克的考马斯亮蓝G-250溶解在300mL的脱色液中，过滤，棕色瓶储存；
电泳结束后将凝胶片置于考马斯亮蓝染色液中4h，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止。
实施例8
通过本发明所述方法获得的芹菜籽活性蛋白质和多肽活性的确定：
将5mL的2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(简称Abts)(19.2mg)与88μL的7mmoL/L的过硫酸钾水溶液混合，在室温，避光的条件下静置过夜，形成2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基储备液，该储备液在室温，避光的条件下稳定，使用前用0.1M，pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液释放成工作液，要求其在温度30℃，734nm波长下的吸光度为0.7±0.02。
将所得的芹菜籽活性多肽用0.1M，pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液配成溶液，取10μL的多肽溶液，并加入6μL的磷酸盐缓冲溶液，再加入184μL的2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基工作液，准确振30秒，在20℃下测定反应液在734nm处5min的吸光值。实验以Vc为阳性对照，设试剂空白，样品空白和样品实验组。
根据样品的吸光值、样品空白和试剂空白的吸光值，计算所得多肽对2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除的IC50浓度。IC50浓度为当样品对2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除率达到50％时，所需的样品浓度。
表所得多肽的IC50浓度(清除Abts自由基的IC50)
Claims (5)
1.一种从芹菜籽中提取天然活性蛋白质和多肽的方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、将采用常规方法脱脂芹菜籽用液氮研磨，再用磷酸缓冲液在温度4-50℃超声提取，时间0.25-2.0小时，过滤，将滤液用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；
b、将上清液加入无水硫酸氨，充分搅拌溶解后放置冰箱静置24小时，低温离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到芹菜籽活性蛋白质和多肽；
c、再利用常规方法十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定提取的蛋白质和多肽的成分及其分子量，并对提取的蛋白质和多肽采用2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除来确定蛋白质和多肽的抗氧化活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a、b中的提取、分离、纯化过程所用水均为三蒸水。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于步骤a、b中的低温离心速度为12000转/分，20min。
4.根据权利要求2-3所述的方法，其特征在于步骤a中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01-0.1mol/L，pH＝4.0-10.0。
5.根据权利要求2-3所述的方法，其特征在于步骤b中无水硫酸铵饱和度为30％-80％。
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