CN110507677A - 一种羊栖菜总多酚的提取方法 - Google Patents

一种羊栖菜总多酚的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种羊栖菜总多酚的提取方法，属于植物活性成分提取技术领域，该方法包括取干燥的羊栖菜粉末，加入乙醇溶液中，所述羊栖菜粉末与乙醇溶液的比例为1：(40‑70)g/mL，所述乙醇溶液的体积分数为20‑35％；超声处理，超声时间15‑28min，超声完后，过滤；滤液使用AB‑8大孔吸附树脂进行纯化；将纯化后的滤液旋转蒸发浓缩至稠膏，真空干燥，即得；本发明羊栖菜总多酚的平均提取率为10.22％。使用超声法提取羊栖菜中总多酚对比其他提取方法具有提取效率高、节省溶剂和能源成本，设备要求低且操作简便，快速等显著优点，超声法提取天然活性成分是一种极具前景的科研技术。

Description

一种羊栖菜总多酚的提取方法
技术领域
本发明涉及植物活性成分提取领域，特别是涉及一种羊栖菜总多酚的提取方法。
背景技术
在海洋世界里,海藻生物资源非常丰富,据报道种属超过15000种。与陆地植物相比,海藻具有许多生物活性成分,如褐藻酸、甘露醇、马尾藻多糖等成分，现已成为海洋生物活性物质的新来源。海藻有较高的潜在药用价值,其中存在于海藻体内的多酚类物质因其具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等多种生物活性,在大力发展蓝色海洋经济的形势下,越来越受到人们的关注。
羊栖菜(Sargassum fusiforme(Hary)Setehel)属于褐藻门马尾藻科,又名海大麦、海菜芽、羊奶子、鹿角尖等。羊栖菜是一种重要的经济海藻资源,它肉质丰满多汁,味道鲜美,营养丰富,具软坚散结、利水消肿、泻热化痰等功能,有研究发现羊栖菜多糖有明显的抗氧化活性。Wang等研究发现羊栖菜提取物有良好的抑菌作用,其活性与多酚类物质有关。
多酚可广泛应用在农业、环保、食品、医药等领域,多酚的提取方法主要有极性溶剂提取法、超临界提取法等，但常规的溶剂提取法(搅拌提取)，该方法存在耗时长、能耗高和提取率低等缺点。本发明采用乙醇溶液提取羊栖菜多酚,并对其提取工艺参数进行了优化,为羊栖菜多酚类物质的开发和利用提供参考。
发明内容
本发明的目的是提供一种羊栖菜总多酚的提取方法，以解决上述现有技术存在的问题，以提高羊栖菜总多酚提取率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种羊栖菜总多酚的提取方法，包括以下步骤：
(1)取干燥的羊栖菜粉末，加入乙醇溶液中，所述羊栖菜粉末与乙醇溶液的比例为1：(40-70)g/mL，所述乙醇溶液的体积分数为20-35％；
(2)超声处理，超声时间15-28min，超声完后，过滤；
(3)滤液使用AB-8大孔吸附树脂进行纯化；
(4)将纯化后的滤液旋转蒸发浓缩至稠膏，真空干燥，即得。
进一步地，所述超声为槽式超声，功率400W，频率50kHz。
进一步地，所述旋转蒸发的温度为60℃。
进一步地，在步骤(4)中，所述稠膏体积为乙醇溶液体积的1/9-1/11。
进一步地，所述真空干燥温度为60℃，时间8h。
进一步地，所述羊栖菜粉末与乙醇溶液的比例为1：50g/mL，所述乙醇溶液的体积分数为30％，所述超声时间为25min。
进一步地，所述羊栖菜粉末与乙醇溶液的比例为1：55g/mL，所述乙醇溶液的体积分数为25％，所述超声时间为20min。
进一步地，所述干燥的羊栖菜粉末的制备方法：将羊栖菜均匀平铺摊开，鼓风干燥箱干燥48h，干燥温度60℃，粉碎，过40目筛。
本发明公开了以下技术效果：
本发明得到提取羊栖菜总多酚的最佳提取方法为：超声时间20min、乙醇体积分数25％、料液比1:55(g/mL)。在最佳提取方法下，羊栖菜总多酚的平均提取率为10.22％。使用超声法提取羊栖菜中总多酚对比其他提取方法具有提取效率高、节省溶剂和能源成本，设备要求低且操作简便，快速等显著优点，超声法提取天然活性成分是一种极具前景的科研技术。
羊栖菜总多酚对ABTS自由基、OH自由基和DPPH自由基均表现出有效的清除作用：清除50％三种自由基时的浓度(IC50)分别是0.0138mg/mL、0.3320mg/mL、0.0140mg/mL。证明羊栖菜总多酚化合物对DPPH自由基、OH自由基和ABTS自由基均有一定的清除作用，可以为天然抗氧化剂的研究提供一定参考价值。
羊栖菜总多酚在抗氧化活性方面具有自由基清除率高、用量少和样品易制备等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为没食子酸含量C(mg/mL)和吸光度A的标准曲线；
图2为实施例2超声时间-提取率曲线图；
图3为实施例2乙醇体积分数-提取率曲线图；
图4为实施例2料液比-提取率曲线图；
图5为羊栖菜总多酚浓度-ABTS自由基清除率曲线图；
图6为羊栖菜总多酚浓度-OH自由基清除率曲线图；
图7为羊栖菜总多酚浓度-DPPH自由基清除率曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明提供一种超声提取羊栖菜总多酚的方法，包括以下步骤：
(1)取干燥的羊栖菜粉末，加入乙醇溶液中，所述羊栖菜粉末与乙醇溶液的比例为1：(40-70)g/mL，所述乙醇溶液的体积分数为20-35％；
(2)超声处理，超声时间15-28min，超声完后，过滤；
(3)滤液使用AB-8大孔吸附树脂进行纯化；
(4)将纯化后的滤液旋转蒸发浓缩至稠膏，真空干燥，即得。
上述技术方案中，所述超声为槽式超声，功率400W，频率50kHz。
上述技术方案中，所述旋转蒸发的温度为60℃。
上述技术方案中，在步骤(4)中，所述稠膏体积为乙醇溶液体积的1/9-1/11。
上述技术方案中，所述真空干燥温度为60℃，时间8h。
上述技术方案中，所述羊栖菜粉末与乙醇溶液的比例为1：50g/mL，所述乙醇溶液的体积分数为30％，所述超声时间为25min。
上述技术方案中，所述羊栖菜粉末与乙醇溶液的比例为1：55g/mL，所述乙醇溶液的体积分数为25％，所述超声时间为20min。
上述技术方案中，所述干燥的羊栖菜粉末的制备方法：将羊栖菜均匀平铺摊开，鼓风干燥箱干燥48h，干燥温度60℃，粉碎，过40目筛。
下面对本发明的发明过程及具体实施方案进一步解释说明。
实施例1建立标准曲线
以没食子酸含量C(mg/mL)和吸光度A作为横纵坐标轴对没食子酸的标准曲线(如图1)进行绘制。
由图1可知没食子酸标准曲线的回归方程为A＝11.545C+0.0173,相关系数为R2＝0.9986，线性关系良好。在测定羊栖菜总多酚含量时，应保持总多酚在测定吸光度时浓度范围在0～0.6mg/mL，即吸光度范围为0.1～0.8，以此为基础，确保多酚浓度在曲线范围内。若测定时发现样品吸光度>0.8，应进行稀释一定倍数后测定；若测定时发现样品吸光度<0.1，应在预实验中调整提取工艺条件，对浓度进行提高。
实施例2羊栖菜总多酚提取率的影响因素
1.超声时间：
按每克羊栖菜加入60mL体积分数60％的乙醇水溶液的比例，分析不同超声时间对羊栖菜总多酚类化合物提取率的影响，结果如图1所示。
由图1可知，一定的时间范围内(10-25min)，随着超声时间的增加，羊栖菜总多酚的提取率缓慢增加；当超声时间达到一定范围(25min)时，提取率将达到峰值，超过该峰值对应时间后羊栖菜总多酚的提取率开始下降。超声时间-提取率曲线图显示：在其他单因素不变的情况下，超声时间宜选择在25min附近，此时提取效果较好。
2.乙醇体积分数：
按每克羊栖菜加入60mL乙醇水溶液的比例，时间20min，分析不同乙醇体积分数对羊栖菜总多酚类化合物提取率的影响，结果如图2所示。
由图2可知，在一定范围内(10％-30％)随着乙醇体积分数的增加，羊栖菜总多酚的提取率不断快速增加；当乙醇体积分数达到一定范围(30％)后，提取率达到峰值，超过该峰值对应体积分数后羊栖菜总多酚的提取率开始下降。乙醇体积分数-提取率曲线图显示：在其他单因素不变的情况下，乙醇体积分数宜选择在30％范围附近，此时提取效果较好。
3.料液比：
使用体积分数为60％的乙醇水溶液，时间20min，分析不同料液比对羊栖菜总多酚类化合物提取率的影响，结果如图3所示。
由图3可知，羊栖菜总多酚的提取率随液料比的增加，提取率呈现先增加然后缓慢下降趋势。随着一定范围液料比(30-50mL/g)的增加，羊栖菜总多酚的提取率升高；当液料比达到一定范围(50mL/g)后，提取率达到峰值，超过该峰值对应液料比后羊栖菜总多酚的提取率开始下降。液料比-提取率曲线图显示：在其他单因素不变的情况下，液料比宜选择在50mL/g范围附近，此时提取效果较好。
综合各个单因素，设计L9(33)正交实验(正交实验方法为现有技术，可根据实际需要设计，在此不再赘述)，并根据其方差分析得出优化水平方法为超声时间20min，乙醇体积分数0.25，液料比1：55，即在对羊栖菜总多酚提取的影响中，超声时间的影响最大；其次为乙醇体积分数；而液料比的影响最小。
实施例3羊栖菜总多酚提取率的测定
采用福林酚比色法测定羊栖菜总多酚含量，没食子酸溶液和羊栖菜总多酚提取液在761nm处均有最大吸收峰，故可以认为没食子酸标准曲线的绘制和羊栖菜提取液总多酚进行含量测定时合适的紫外吸收测定波长为761nm，取超声后的羊栖菜总多酚提取液滤液，稀释至吸光度在0.1-0.8范围内，用紫外分光光度计于761nm下测定的吸光度A代入回归方程A＝11.545C+0.0173，求得总多酚浓度C，将浓度C代入公式(1)，计算总多酚的提取率。
式(1)中，C为羊栖菜提取液测定的总多酚浓度(mg/mL),V为实际测定提取时的定容体积(mL)，W为羊栖菜原材料粉末质量(g)，D为测定时最后的稀释倍数。
为保证提取率测试结果的可靠性，进行三次测定，精密称取羊栖菜粉末1.0g作为原料，加入2*20cm定制超声管中，设置条件为：超声时间20min，乙醇体积分数0.25，料液比1：55，超声过滤后，测定吸光度，根据公式(1)计算提取率和RSD。
上述所测得羊栖菜总多酚的提取率分别为10.27％，10.12％，10.22％，平均提取率为10.22％，RSD为0.53％。
对大孔吸附树脂纯化后所得羊栖菜总多酚进行纯度测定，其纯度分别为92.56％、93.72％、94.68％。
实施例4羊栖菜总多酚抗氧化活性实验
1.清除ABTS自由基活性测定
精密吸取39.5mL0.1mol/L的氢氧化钠溶液溶解0.68g磷酸二氢钾后用蒸馏水稀释至100mL容量瓶，得PH为7.4的磷酸盐缓冲溶液备用。用蒸馏水溶解2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐0.4060g后配置成每L含有7.4mmolABTS的ABTS溶液100mL，棕色容量瓶避光保存。用蒸馏水溶解过硫酸钾0.0703g后配置成每L含有2.6mmol过硫酸钾的过硫酸钾溶液100mL，棕色容量瓶避光保存。混合均匀上述方法配置成的7.4mmol/L的ABTS溶液和2.6mmol/L的过硫酸钾溶液各2.0mL，在室温避光环境下反应12h，用PH7.4的磷酸缓冲液稀释至A734 nm约为0.7，得ABTS+工作液。精密称取50mg由本发明实施例制备的羊栖菜总多酚样品于100mL棕色容量瓶，加入蒸馏水充分溶解后定容摇匀，根据预实验进行调整稀释合适倍数作为总多酚储备液。将总多酚储备液用95％乙醇稀释为6个不同浓度的多酚样品液，分别取2.0mL多酚样品液6份和2.0mL95％乙醇作空白对照，加入8.0mL ABTS+工作液后混匀并于暗处静置6min，测定多酚样品液组为Ai，空白组A734nm为A0。ABTS自由基的清除率按公式(2)计算并绘制曲线图，如图5所示。
式中Ai为多酚样品液吸光度值；A0为乙醇空白对照组吸光度值；
由图5可知，羊栖菜总多酚可以有效地清除ABTS自由基。当羊栖菜总多酚浓度为0.0382mg/mL时，羊栖菜总多酚对自由基的清除率为93.68％。随着羊栖菜总多酚浓度的逐渐增加，清除作用不断变强。羊栖菜总多酚清除一半ABTS自由基时的浓度运用SPSS软件进行分析计算得IC50为0.0138mg/mL。
2.清除OH自由基活性的测定
将精密称取的七水合硫酸铁0.0210g用蒸馏水配置为每L中含1.5mmol FeSO4的FeSO4溶液50mL，再将水杨酸0.0830g用无水乙醇配置为每L含3mmol的水杨酸-乙醇溶液50mL。将精密称取的25.0mg羊栖菜总多酚样品加入到50mL棕色容量瓶，加入蒸馏水充分溶解后定容摇匀，根据预实验进行调整稀释合适倍数作为总多酚储备液。精密吸取1.5mmol/LFe2+溶液2.00mL和3mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1.00mL于15mL刻度试管中，分别加入总多酚储备液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，用蒸馏水补足至10mL，加入0.3％H2O2溶液2.00mL作为启动反应溶剂，调节水温为37℃，在恒温水浴锅中放置30min，取出试管并冷却至室温后，设置吸收波长为510nm，测定吸光度值Ai；调整上述实验步骤，将过氧化氢溶液换成等量蒸馏水同法测定吸光度值Ai0；将总多酚储备液换成等量蒸馏水同法测定吸光度值A0。OH自由基清除率的按公式(3)计算并绘制曲线图，如图6所示。
式中Ai为总多酚储备液吸光度值；Ai0为总多酚储备液空白对照吸光度值；A0为空白对照组吸光度值。
由图6可知，羊栖菜总多酚可以有效地清除OH自由基。当羊栖菜总多酚浓度为0.7167mg/mL时，羊栖菜总多酚对OH自由基的清除率为88.51％。随着羊栖菜总多酚浓度的逐渐增加，清除作用不断变强。
羊栖菜总多酚清除一半OH自由基时的浓度运用SPSS软件进行分析计算得IC50为0.3320mg/mL。
3.清除DPPH自由基活性测定
将精密称取的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)0.0025g用体积分数为70％的乙醇水溶液配置每mL含0.05mgDPPH·的DPPH试液。将精密称取的25.0mg羊栖菜总多酚样品加入到50mL棕色容量瓶，加入蒸馏水充分溶解后定容摇匀，根据预实验进行调整稀释合适倍数作为总多酚储备液。精密吸取上述总多酚储备液5.00、10.00、15.00、20.00、25.00mL，用70％乙醇定容至25mL，保存上述浓度样品液。取试管11支，将精密吸取的5个浓度样品液各5.00mL依次加到1-5号试管，再依次加到6-10号试管，以70％乙醇为空白对照，1-5号试管加5.00mL上述浓度DPPH试液，6-10号试管加70％乙醇水溶液5.00mL，11号试管加入5.00mLDPPH试液及5.00mL70％乙醇水溶液，设置吸收波长为516nm，各试管内试剂混合均匀后避光反应30min，以70％乙醇为空白测定吸光度，记录1-5号溶液吸光度为Ai，6-10号为Aj，11号为A0.平行测定3次，按公式(4)计算样品液对DPPH自由基清除率并绘制曲线图，如图7所示。
上式Ai依次为1-5号试管样品液与DPPH反应后吸光度值，Aj依次为6-10号试管样品液与乙醇混合后吸光度值，A0为DPPH与乙醇混合后11号试管空白组。
由图7可知，随着总多酚浓度(0-0.0270mg/mL)的增加，溶液清除DPPH自由基的作用不断增强，当多酚浓度增加至一定值(0.0270mg/mL)时，清除率的增加幅度接近平稳(85.82％)。
羊栖菜总多酚清除一半DPPH自由基时的浓度通过SPSS软件进行分析计算得IC50为0.0140mg/mL。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种羊栖菜总多酚的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干燥的羊栖菜粉末，加入乙醇溶液中，所述羊栖菜粉末与乙醇溶液的比例为1：(40-70)g/mL，所述乙醇溶液的体积分数为20-35％；
(2)超声处理，超声时间15-28min，超声完后，过滤；
(3)滤液使用AB-8大孔吸附树脂进行纯化；
(4)将纯化后的滤液旋转蒸发浓缩至稠膏，真空干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的羊栖菜总多酚的提取方法，其特征在于，所述超声为槽式超声，功率400W，频率50kHz。
3.根据权利要求1所述的羊栖菜总多酚的提取方法，其特征在于，所述旋转蒸发的温度为60℃。
4.根据权利要求1所述的羊栖菜总多酚的提取方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述稠膏体积为乙醇溶液体积的1/9-1/11。
5.根据权利要求1所述的羊栖菜总多酚的提取方法，其特征在于，所述真空干燥温度为60℃，时间8h。
6.根据权利要求1所述的羊栖菜总多酚的提取方法，其特征在于，所述羊栖菜粉末与乙醇溶液的比例为1：50g/mL，所述乙醇溶液的体积分数为30％，所述超声时间为25min。
7.根据权利要求1所述的羊栖菜总多酚的提取方法，其特征在于，所述羊栖菜粉末与乙醇溶液的比例为1：55g/mL，所述乙醇溶液的体积分数为25％，所述超声时间为20min。
8.根据权利要求1所述的羊栖菜总多酚的提取方法，其特征在于，所述干燥的羊栖菜粉末的制备方法：将羊栖菜均匀平铺摊开，鼓风干燥箱干燥48h，干燥温度60℃，粉碎，过40目筛。
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