CN117122059A - 一种抗过敏和抗炎症海藻多酚的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗过敏和抗炎症海藻多酚的制备方法与应用，属于食品加工技术领域，本发明通过对马尾藻进行乙醇浸提、大孔树脂动态洗脱以及色谱分离处理，获得了纯度可达97.27％的海藻多酚，该制备方法能够降低提取过程中海藻本身含有的多糖、蛋白质、脂质等杂质对海藻多酚提取及纯化过程的影响，同时增强海藻多酚的抗过敏和抗炎症活性；研究显示，本发明制得的海藻多酚不但能够显著降低RBL‑2H3肥大细胞中组胺、β‑氨基己糖苷酶、IL‑4和TNF‑α的释放量，显著缓解BALB/c小鼠的过敏反应症状、降低小鼠血清中特异性IgE抗体和IgG抗体水平，还能显著降低RAW267.4炎症细胞中NO和TNF‑α的释放量。

Description

一种抗过敏和抗炎症海藻多酚的制备方法与应用
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种抗过敏和抗炎症海藻多酚的制备方法与应用。
背景技术
随着食物加工程度日益加深、食品成分日益复杂，食物中的病原物质越来越多，消费者面临的食物过敏反应和炎症反应日趋严重。过敏反应通常是接触到过敏原引起，如进食了含过敏原的食物，如海鲜类食物，包括鱼、虾、蟹、贝等，就会导致机体产生变态免疫反应，出现过敏症状，可造成皮肤红斑、瘙痒等皮损现象，还可能导致腹泻、恶心、呕吐等胃肠道症状。此外，食物过敏反应和炎症反应往往同时发生，过敏反应的发生也可导致炎症反应，如过敏性肠炎、过敏性皮炎、过敏性哮喘、过敏性鼻炎等，这是由于过敏原刺激皮肤、呼吸道、消化道等器官导致的疾病，属于无菌性炎症，患者可出现皮肤瘙痒、红斑、丘疹、丘疱疹、呼吸困难、腹痛腹泻等症状。然而，至今在医学上还没有根治食物过敏以及过敏性炎症反应的方法。
海藻是一种常见食材，富含多酚、多糖等活性物质。叶托马尾藻(Sargassumcarpophyllum)属褐藻门，圆子纲，墨角藻目，马尾藻科，马尾藻属，是一种可食用海藻。海藻多酚是从海藻中提取出来的高亲水性多酚类化合物的总称，是海藻中一种重要的活性物质，主要由间苯三酚聚合而成。研究表明，海藻多酚具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老及免疫调节等功能活性。
然而，目前针对抗过敏和抗炎症多酚的研究主要聚焦于陆生植物中的多酚物质，对于海藻中具有抗过敏和抗炎症功能多酚物质的相关专利还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗过敏和抗炎症海藻多酚的制备方法与应用，本发明通过对马尾藻进行乙醇浸提、大孔树脂动态洗脱以及色谱分离处理，获得了纯度可达97.27％的海藻多酚，且制得的海藻多酚具有显著的抗过敏活性和抗炎症活性。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种海藻多酚的制备方法，包括如下步骤：
(1)将马尾藻与乙醇混合浸提，过滤，收集滤液获得海藻多酚粗提液；
(2)将所述海藻多酚粗提液过大孔树脂纯化，获得提纯液；
(3)将所述提纯液进行色谱分离，获得纯化的海藻多酚。
优选的，所述马尾藻与乙醇的料液比为1g:12～17ml，所述乙醇的体积分数为70～80％。
优选的，所述浸提时伴随搅拌，所述搅拌的温度为30～50℃，所述搅拌的转速为500～1500r/min，所述搅拌的时间为7～10h。
优选的，所述浸提后进行离心，所述离心的转速为8000～10000r/min，所述离心的时间为5～15min。
优选的，所述纯化的方式为动态洗脱，当洗脱体积为0～90ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；洗脱体积为90～250ml时，每3～5ml收集一管洗脱液；洗脱体积为250～350ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；所述洗脱的流速为3～9BV/h。
进一步优选的，当所述洗脱体积为200～270ml时，对洗脱液进行旋转蒸发浓缩处理。
优选的，所述色谱分离的方法为高效液相色谱法，所述高效液相色谱法包括：以乙腈+0.01％甲酸为A相，以超纯水+0.01％甲酸为B相；在0～30min，以5:95～25:75(A:B，V/V)；在30min～60min，以25:75～45:55(A:B，V/V)的方式进行梯度洗脱。
本发明还提供了一种海藻多酚。
本发明还提供了一种海藻多酚在制备抗过敏和/或抗炎药物中的应用。
本发明还提供了一种海藻多酚在制备抗过敏和/或抗炎保健品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过使用乙醇浸提、大孔树脂动态洗脱以及半制备高效液相色谱法制备海藻多酚，降低了提取过程中海藻本身含有的多糖、蛋白质、脂质等杂质对海藻多酚提取及纯化过程的影响，增强了海藻多酚的抗过敏和抗炎症活性。
(2)本发明制得的海藻多酚的纯度高达97.27％，能够显著降低RBL-2H3肥大细胞中组胺、β-氨基己糖苷酶、IL-4和TNF-α的释放量，显著缓解BALB/c小鼠的过敏反应症状、降低小鼠血清中特异性IgE抗体和IgG抗体水平，还能显著降低RAW267.4炎症细胞中NO和TNF-α的释放量。
(3)本发明通过从马尾藻中制备具有天然抗过敏和抗炎症活性的海藻多酚，实现了海藻的高值化精深加工利用。
附图说明
图1为不同料液比、浸提时间和浸提温度对从马尾藻中提取海藻多酚的提取率的单因素影响结果；
图2为不同料液比、浸提时间和浸提温度对从马尾藻中提取海藻多酚的提取率的响应面影响结果；
图3为测定的不同海藻品种中提取的海藻多酚粗提物的多酚含量结果；
图4为测定的不同海藻品种中提取的海藻多酚粗提物对透明质酸酶的抑制率结果；
图5为半制备高效液相色谱分析纯化海藻多酚的色谱峰示意图，其中，1.871min处色谱峰为溶剂，2.704min处色谱峰为海藻多酚；
图6为分析型高效液相色谱对纯化海藻多酚纯度分析的色谱峰示意图；
图7为海藻多酚对RBL-2H3肥大细胞细胞活力的影响；
图8为海藻多酚对RBL-2H3肥大细胞TNF-α释放量、组胺、IL-4、IL-10和β-氨基己糖苷酶释放率的影响；
图9为小鼠动物免疫及海藻多酚治疗过敏小鼠动物实验流程图；
图10为不同处理组对过敏BALB/c小鼠过敏反应症状的评分和小鼠的体重变化结果；其中，全程腹腔注射和灌胃PBS的处理组为空白组；未使用海藻多酚处理的处理组为阳性组；
图11为不同处理组对过敏BALB/c小鼠血清中原肌球蛋白特异性IgE抗体和血清原肌球蛋白特异性IgG抗体的变化情况；其中，全程腹腔注射和灌胃PBS的处理组为空白组；未使用海藻多酚处理的为阳性组；
图12为不同浓度的海藻多酚对RAW267.4炎症细胞细胞活力的影响；
图13为不同浓度的海藻多酚对RAW267.4炎症细胞NO释放量和TNF-α释放量的影响；
图14为不同细胞通路抑制剂对RAW267.4炎症细胞NO释放量和TNF-α释放量的影响；其中，阳性代表只添加海藻多酚，未添加通路抑制剂；
图15为海藻多酚纯化过程中的大孔树脂动态洗脱曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种海藻多酚的制备方法，包括如下步骤：
(1)将马尾藻与乙醇混合浸提，过滤，收集滤液获得海藻多酚粗提液；
(2)将所述海藻多酚粗提液过大孔树脂纯化，获得提纯液；
(3)将所述提纯液进行色谱分离，获得纯化的海藻多酚。
在本发明中，将马尾藻与乙醇混合浸提，过滤，收集滤液获得海藻多酚粗提液。在本发明中，所述马尾藻优选的经风干后粉碎、过筛，在本发明中，所述风干的温度优选为50～70℃，进一步优选为52～58℃，更进一步优选为55℃；所述风干的时间为20～30h，进一步优选为22～26h，更进一步优选为24h；所述过筛的目数优选为50～70目，进一步优选为55～65目，更进一步优选为60目。本发明优选的收集筛下组分与乙醇混合浸提，离心后收集上清液；所述乙醇的体积分数优选为70～80％，进一步优选为72～78％，更进一步优选为75％；所述马尾藻与乙醇的料液比优选为1g:12～17ml，进一步优选为1g:14～16ml，更进一步优选为1g:15ml；所述浸提时伴随搅拌，所述搅拌的温度优选为30～50℃，进一步优选为35～45℃，更进一步优选为40℃；所述搅拌的转速优选为500～1500r/min，进一步优选为700～1300r/min，更进一步优选为900～1100r/min，再进一步优选为1000r/min；所述搅拌的时间优选为7～10h，进一步优选为8～9h，更进一步优选为8.5h；所述离心的转速优选为8000～10000r/min，进一步优选为8500～9500r/min，更进一步优选为9000r/min；所述离心的时间优选为5～15min，进一步优选为7～13min，更进一步优选为9～11min，再进一步优选为10min；所述离心的温度优选为2～6℃，进一步优选为3～5℃，更进一步优选为4℃。本发明中，所述浸提的次数优选为2～4次，进一步优选为3次；本发明优选的将数次浸提获得的上清液合并后进行过滤，收集滤液获得海藻多酚粗提液。
在本发明中，将所述海藻多酚粗提液过大孔树脂纯化，获得提纯液。在本发明中，所述纯化的方式优选为动态洗脱，当洗脱体积为0～90ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；洗脱体积为90～250ml时，每3～5ml收集一管洗脱液；洗脱体积为250～350ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；当所述洗脱体积为200～270ml时，对洗脱液进行旋转蒸发浓缩处理；所述旋转蒸发浓缩的温度优选为40～60℃，进一步优选为45～55℃，更进一步优选为50℃；所述旋转蒸发浓缩的转速优选为90～110r/min，进一步优选为95～105r/min，更进一步优选为100r/min；所述旋转蒸发浓缩的时间优选为10～20min，进一步优选为12～18min，更进一步优选为15min；所述洗脱的流速优选为3～9BV/h，进一步优选为5～8BV/h，更进一步优选为6BV/h。
在本发明中，将所述提纯液进行色谱分离，获得纯化的海藻多酚。在本发明中，所述色谱分离的方法优选为高效液相色谱法，所述高效液相色谱法优选的包括：以乙腈+0.01％甲酸为A相，以超纯水+0.01％甲酸为B相；在0～30min，以5:95～25:75(A:B，V/V)；在30min～60min，以25:75～45:55(A:B，V/V)的方式进行梯度洗脱；进一步优选的，在10～20min，以10:90～20:70(A:B，V/V)；在40min～50min，以30:70～40:50(A:B，V/V)的方式进行梯度洗脱；更进一步优选的，在13～18min，以15:80(A:B，V/V)；在43～46min，以35:60(A:B，V/V)的方式进行梯度洗脱。
本发明还提供了一种海藻多酚。
本发明还提供了一种海藻多酚在制备抗过敏和/或抗炎药物中的应用。
在本发明中，所述药物的剂型包括丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂和凝胶剂。
本发明还提供了一种海藻多酚在制备抗过敏和/或抗炎保健品中的应用。
在本发明中，所述保健品的剂型包括丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂和凝胶剂。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1海藻多酚的制备
将马尾藻在60℃烘干24h，置于粉碎机中充分粉碎，过60目筛获得细粉，称取10g细粉，加入150ml体积分数为75％的乙醇溶液中，于40℃，1000r/min的转速磁力搅拌9h，在4℃，以9000r/min的转速离心10min，收集上清液；将沉淀转移至锥形瓶中，加入150ml体积分数为75％的乙醇溶液中，于40℃，1000r/min的转速磁力搅拌9h，在4℃，以9000r/min的转速离心10min，收集上清液；将沉淀转移至锥形瓶中，加入150ml体积分数为75％的乙醇溶液中，于40℃，以1000r/min的转速磁力搅拌9h，在4℃，以9000r/min的转速离心10min，收集上清液；合并上述收集的上清液，用双层滤纸对上清液进行抽滤，收集滤液，获得海藻多酚粗提液。
称取500gAB-8大孔树脂(弱极性)，使用体积分数为95％的乙醇浸泡24h，充分溶胀，用去离子水漂洗至排出的水无白色浑浊为止，再依次使用浓度为5％氢氧化钠溶液和5％盐酸溶液分别浸泡12h，用去离子水洗涤树脂至pH为中性。将树脂装于玻璃层析柱(250mm×60mm)中，并保证树脂上方有充足的去离子水以防止柱体干燥。选用多酚含量为1mg/ml的海藻多酚粗提液，以6(床体积)BV/h的流速进样，直至吸附至饱和；再利用体积分数为75％的乙醇洗脱，洗脱的流速为6(床体积)BV/h。当洗脱体积为0～90ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；洗脱体积为90～250ml时，每3～5ml收集一管洗脱液；洗脱体积为250～350ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；所述洗脱的流速为3～9BV/h。当洗脱体积为200～270ml时，在温度为40℃，以90r/min的转速对洗脱液进行旋转蒸发浓缩处理10min。合并洗脱液，获得提纯液。
将提纯液置于半制备型高效液相色谱中进行纯化处理，纯化时以乙腈+0.01％甲酸为A相，以超纯水+0.01％甲酸为B相；在0～30min，以5:95～25:75(A:B，V/V)；在30min～60min，以25:75～45:55(A:B，V/V)的方式进行梯度洗脱，获得纯化的海藻多酚。
实施例2海藻多酚的制备
将马尾藻在50℃烘干20h，置于粉碎机中充分粉碎，过50目筛获得细粉，称取10g细粉，加入120ml体积分数为70％的乙醇溶液中，于30℃，500r/min的转速磁力搅拌7h，在2℃，以8000r/min的转速离心5min，收集上清液；将沉淀转移至锥形瓶中，加入120ml体积分数为70％的乙醇溶液中，于30℃，500r/min的转速磁力搅拌7h，在2℃，以8000r/min的转速离心5min，收集上清液；将沉淀转移至锥形瓶中，加入120ml体积分数为70％的乙醇溶液中，于30℃，以500r/min的转速磁力搅拌7h，在2℃，以8000r/min的转速离心5min，收集上清液；合并上述收集的上清液，用双层滤纸对上清液进行抽滤，收集滤液，获得海藻多酚粗提液。
称取500gAB-8大孔树脂(弱极性)，使用体积分数为95％的乙醇浸泡24h，充分溶胀，用去离子水漂洗至排出的水无白色浑浊为止，再依次使用浓度为5％氢氧化钠溶液和5％盐酸溶液分别浸泡12h，用去离子水洗涤树脂至pH为中性。将树脂装于玻璃层析柱(250mm×60mm)中，并保证树脂上方有充足的去离子水以防止柱体干燥。选用多酚含量为1mg/ml的海藻多酚粗提液，以6(床体积)BV/h的流速进样，直至吸附至饱和；再利用体积分数为75％的乙醇洗脱，洗脱的流速为3(床体积)BV/h。当洗脱体积为0～90ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；洗脱体积为90～250ml时，每3～5ml收集一管洗脱液；洗脱体积为250～350ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；所述洗脱的流速为3～9BV/h。当洗脱体积为200～270ml时，在温度为60℃，以110r/min的转速对洗脱液进行旋转蒸发浓缩处理20min。合并洗脱液，获得提纯液。
将提纯液置于半制备型高效液相色谱中进行纯化处理，纯化时以乙腈+0.01％甲酸为A相，以超纯水+0.01％甲酸为B相；在0～30min，以5:95～25:75(A:B，V/V)；在30min～60min，以25:75～45:55(A:B，V/V)的方式进行梯度洗脱，获得纯化的海藻多酚。
实施例3海藻多酚的制备
将马尾藻在70℃烘干30h，置于粉碎机中充分粉碎，过70目筛获得细粉，称取10g细粉，加入170ml体积分数为80％的乙醇溶液中，于50℃，1500r/min的转速磁力搅拌10h，在6℃，以10000r/min的转速离心15min，收集上清液；将沉淀转移至锥形瓶中，加入170ml体积分数为80％的乙醇溶液中，于50℃，1500r/min的转速磁力搅拌10h，在6℃，以10000r/min的转速离心15min，收集上清液；将沉淀转移至锥形瓶中，加入170ml体积分数为80％的乙醇溶液中，于50℃，以1500r/min的转速磁力搅拌10h，在6℃，以10000r/min的转速离心15min，收集上清液；合并上述收集的上清液，用双层滤纸对上清液进行抽滤，收集滤液，获得海藻多酚粗提液。
称取500gAB-8大孔树脂(弱极性)，使用体积分数为95％的乙醇浸泡24h，充分溶胀，用去离子水漂洗至排出的水无白色浑浊为止，再依次使用浓度为5％氢氧化钠溶液和5％盐酸溶液分别浸泡12h，用去离子水洗涤树脂至pH为中性。将树脂装于玻璃层析柱(250mm×60mm)中，并保证树脂上方有充足的去离子水以防止柱体干燥。选用多酚含量为1mg/ml的海藻多酚粗提液，以6(床体积)BV/h的流速进样，直至吸附至饱和；再利用体积分数为75％的乙醇洗脱，洗脱的流速为9(床体积)BV/h。当洗脱体积为0～90ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；洗脱体积为90～250ml时，每3～5ml收集一管洗脱液；洗脱体积为250～350ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；所述洗脱的流速为3～9BV/h。当洗脱体积为200～270ml时，在温度为50℃，以100r/min的转速对洗脱液进行旋转蒸发浓缩处理15min。合并洗脱液，获得提纯液。
将提纯液置于半制备型高效液相色谱中进行纯化处理，纯化时以乙腈+0.01％甲酸为A相，以超纯水+0.01％甲酸为B相；在0～30min，以5:95～25:75(A:B，V/V)；在30min～60min，以25:75～45:55(A:B，V/V)的方式进行梯度洗脱，获得纯化的海藻多酚。
试验例1利用响应面法优化海藻多酚的浸提工艺
将新鲜马尾藻在60℃烘干24h，置于超微粉碎机中充分粉碎，过60目筛获得细粉，分别称取5.00g细粉于200ml烧杯中，加入不同体积(25ml、50ml、75ml)体积分数为75％的乙醇中，在不同温度(20℃、40℃、60℃)下浸提不同时间(6h、9h、12h)后，将浸提液在4℃，9000r/min的转速下离心15min，保留上清液；将沉淀复溶于100ml体积分数为75％的乙醇中，在室温下浸提12h后，将浸提液在4℃，9000r/min的转速下离心15min，保留上清液，合并两次上清液，用双层滤纸对上清液进行抽滤，获得海藻多酚粗提液。
采用福林酚法测定海藻多酚粗提液中海藻多酚的含量，具体为：取7个洁净小试管，依次加入0.1g/L没食子酸溶液0、50、100、150、200、250、300μL，加入水1000、950、900、850、800、750、700μL，混匀；依次加入0.2N福临酚1000μL、20％碳酸钠500μL，混合反应1h，以没食子酸为0的反应液做空白调零，于765nm波长检测吸光度。以没食子酸的量(X)对吸光度(Y)进行线性回归，绘制标准曲线；取洁净小试管，加入1000μL的样品、0.2N福临酚1000μL、20％碳酸钠500μL，混合反应1h，在765nm波长检测吸光度。将吸光度(Y)带回标准曲线，计算出相应的多酚含量。
根据单因素结果确定出最佳的体积为50ml，温度40℃，时间为9h，因此，以每个因素的最佳值作为水平0，来设计响应面实验。利用响应面法对海藻粗酚提取的因素水平及其交互作用进行评价和优化。通过利用多元回归方程所制作的响应曲面图三维立体图及其等高线图可反映出各因素对响应值的影响大小，在单因素基础上，运用Design-Expert 7.0软件对浸提温度，浸提时间和液料比进行响应面分析，以海藻粗酚提取率作为指标，确定最佳提取参数。响应面影响因素水平表见表1。测定结果如图1和图2所示。
表1乙醇浸提提取海藻粗酚的响应面设计优化表
由图1可知，当料液比为1:15时，获得的海藻多酚的提取得率最高，为80.07mg，在浸提9h时，所得海藻多酚的提取得率最多高，为79.34mg，浸提温度为40℃时，所得海藻多酚的提取得率最多高，为81.99mg。
综合图1和图2的测定结果，确定最佳的提取参数为：料液比1:15，浸提温度为40℃，浸提时间为9h。
试验例2不同海藻品种中海藻多酚粗提物性能的测定
分别将马尾藻、裙带菜、海苔、红石花菜、海茸、海带、龙须菜在60℃烘干24h，置于超微粉碎机中充分粉碎，过60目筛获得细粉，分别称取10g细粉于200ml烧杯中，加入150ml体积分数为75％的乙醇中，在40℃，1000r/min的转速磁力搅拌9h，在4℃，9000r/min的转速下离心10min，保留上清液；将沉淀复溶于100ml体积分数为75％的乙醇中，在室温下浸提12h，在4℃，9000r/min的转速下离心10min，保留上清液，合并两次上清液，用双层滤纸对上清液进行抽滤，获得海藻多酚粗提液。
采用以没食子酸为标准的福林酚法测定不同海藻多酚粗提液中的多酚含量(测定结果如图3所示)，绘制标准曲线。其中，总酚含量的计算方法如式(1)所示：
总酚含量＝CV/M 式(1)
式(1)中，C为提取液中多酚浓度，mg/mL；V为提取液体积，L；M为海藻称样量，g。
采用Morgan-Elson法测定不同海藻多酚粗提物对透明质酸酶的体外抑制活性。并设置A(对照溶液吸光值)、B(对照空白溶液吸光值)、C(样品的吸光值)、D(样品空白的吸光值)四个组别。按照式(2)计算透明质酸酶的体外抑制率。
抑制率(％)＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100％ 式(2)；
将不同品种的海藻多酚粗提液进行梯度稀释，以浓度(mg/ml)为X轴，抑制率(％)为Y轴，绘制拟合曲线。
测定不同海藻品种中海藻多酚粗提物对透明质酸酶的体外抑制活性的方法为：取4个EP管，在A管中加入100μL缓冲液和50μL透明质酸酶，在B管中加入100μL缓冲液和50μL缓冲液，在C管中加入100μL海藻多酚粗提液和50μL透明质酸酶，在D管中加入100μL海藻多酚粗提液和50μL缓冲液；将A、B、C、D 4个管置于37℃孵育20min，加入20μLCaCl2，再次置于37℃孵育20min；向每个管中依次加入50μL透明质酸钠、100μL缓冲液、250μL去离子水，于37℃孵育40min，25℃静置10min；加入100μL碱性硼酸盐溶液，沸水浴10min，冰水浴20min，终止反应；加入1.5ml p-二甲氨基苯甲醛溶液，于37℃孵育20min；使用酶标仪测定585nm波长处的吸光度。测定结果如图4所示。
同时，根据不同浓度海藻多酚的透明质酸酶抑制率拟合曲线，进而计算出海藻多酚的抗过敏活性IC50。计算结果如表2所示。
表2不同海藻品种中海藻多酚的抗过敏活性
表3不同浓度马尾藻中海藻多酚粗提物对透明质酸酶的体外抑制率(％)
由表2可知，从马尾藻中提取的海藻多酚的半数抑制浓度最低，为0.061mg/ml，显著低于从其他品种中提取的海藻多酚的半数抑制浓度；结合表3，可知，从马尾藻中提取的海藻多酚能够在较低浓度下具有较高的透明质酸酶体外抑制率。
试验例3海藻多酚的纯度测定
使用半制备型高效液相色谱仪和分析型高效液相色谱仪分析实施例1中制备的海藻多酚的纯度。结果如图5和图6所示。
由图6可知，采用本发明的方法制备的海藻多酚的纯度达97.27％。
试验例4海藻多酚对RBL-2H3肥大细胞的影响
采用CCK-8试剂盒(购自MedChemExpress有限责任公司)测定从马尾藻中提取的海藻多酚对RBL-2H3肥大细胞活性的影响，利用酶标仪读取450nm处细胞孔板的吸光度值。由图7可知，当多酚浓度≤100μg/ml时，RBL-2H3肥大细胞的细胞活力均在90％以上，没有受到显著影响；当多酚含量大于等于100μg/ml时，细胞活力受到严重抑制，故选择≤100μg/ml的多酚含量进行后续测定。
RBL-2H3肥大细胞的脱颗粒效率(即β-氨基己糖苷酶含量)的检测：用不同浓度(1、5、10、50、100、400、800μg/ml)的海藻多酚培养RBL-2H3肥大细胞1h，回收细胞，培养上清液；在上清液中加入100μL Tyrode’s缓冲液(含0.1％Triton X-100)裂解细胞，获得细胞裂解液；取30μL上清液和30μL细胞裂解液分别加入96孔板，并在每孔中加入100μL 1.2mM 4-methylumbellife-ryl-N-acetyl-b-D-glucosaminide试剂，于37℃反应30min，用酶标仪读取450nm处的吸光度值，根据式(3)计算脱颗粒效率(即β-氨基己糖苷酶的含量)。测定结果如图8所示。
向96孔细胞培养板的每孔中加100μL细胞悬液(1×106cells/ml)，于含有5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养24h，每孔添加100μL 100ng/ml anti-DNP-IgE，于含有5％CO2，37℃的细胞培养箱中孵育12h；用PBS洗孔3次。将从马尾藻中提取的海藻多酚溶于100μLTyrode’s缓冲液中，以每孔100μL按照不同浓度(1、5、10、50、100μg/ml)分别加入培养板中；PBS阴性对照孔中加100μL PBS，培养1h。利用IL-4、IL-10、TNF-α和组胺检测试剂盒(均购自武汉博士德生物工程有限公司)测定细胞培养上清液中IL-4、IL-10、TNF-α和组胺的含量。同时，设置空白对照组。测定结果如图8所示。
由图8可知，细胞上清液中β-氨基己糖苷酶、IL-4、IL-10、TNF-α和组胺的释放量均有所降低且存在明显的剂量依赖性，且存在显著性差异。
试验例5海藻多酚对BALB/c小鼠的影响
将BALB/C小鼠随机分为5组，每组8只，其中，空白对照组为PBS组，阳性组为TM(原肌球蛋白)组，灌胃20mg/kg为高剂量治疗组，灌胃10mg/kg为中剂量治疗组，灌胃5mg/kg为低剂量治疗组。适应性饲养1周后，分别于第0、7、14、21天，对PBS组小鼠腹腔注射200μLPBS缓冲液，其余各组小鼠腹腔注射200μL TM(由200μL TM溶液+100μL氢氧化铝佐剂组成)。从第28天至第35天，按照规定剂量每天给治疗组的小鼠灌胃从马尾藻中提取的海藻多酚。第35天，PBS组灌胃PBS缓冲液200μL，其余各组小鼠灌胃200μL TM。第36至第42天，不同海藻多酚(SCP)处理组小鼠灌胃SCP，第42天灌胃后，对所有小鼠进行断食断水处理。第43天，PBS组灌胃PBS缓冲液200μL，其余各组灌胃200μL TM。激发2h后，测定过敏症状评分、体重，并眼球取血后处死，测定各组大鼠血清中IgE、IgG水平。
其中，在第0、7、14、21天对小鼠进行敏化时，每只小鼠腹腔注射0.2ml含0.15mg原肌球蛋白的氢氧化铝佐剂；在第28、36天对小鼠进行激发时，每只小鼠经口灌胃2mg原肌球蛋白。
小鼠血清中TM特异性IgE和IgG水平的检测
通过ELISA测定小鼠血清中TM特异性免疫球蛋白的水平。具体为：以100μL/孔将100μg/ml的TM包被入酶标板中，于4℃静置16h；用磷酸盐吐温缓冲液缓冲液(PBST)洗板五次，以300μL/孔加入封闭液，于37℃封闭2h；同时，将小鼠血清样品与PBST按1:5(V/V)混合进行稀释，待封闭完成后用PBST洗板三次，以100μL/孔加入稀释好的血清样品，4℃放置16h。将IgE与PBST以1:1000的比例稀释，将IgG与PBST以1:5000的比例稀释，用PBST洗板五次后加入100μL稀释好的二抗，37℃烘箱放置2h；二抗孵育结束后用PBST洗板五次，再加入100μLTMB显色，置于37℃烘箱内，显色20min；以50μL/孔加入终止液(2mol/L H2SO4)，终止显色反应，测定450nm波长处的吸光值。
测定结果如图10和图11所示。
由图10可知，空白组小鼠均未出现任何过敏反应症状。致敏组与治疗组小鼠均出现明显的过敏反应症状。其中，原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)过敏原致敏组小鼠激发后表现出最强的过敏症状，且一只小鼠死亡；灌胃海藻多酚治疗组的小鼠虽出现过敏症状但症状有所减轻，高剂量多酚治疗组过敏反应症状明显减轻，且体重变化趋势与过敏反应症状评分基本吻合。
小鼠血清中的IgE抗体和IgG抗体是评价过敏原致敏性的重要指标。由图11可知，注射TM的小鼠血清IgE抗体水平明显增加。与TM致敏组小鼠血清IgE抗体水平相比，灌胃海藻多酚组小鼠的血清IgE抗体水平均有不同程度的下降。与空白对照组小鼠相比，TM致敏组小鼠和灌胃海藻多酚组小鼠血清中的IgG抗体水平都明显增加；但相较于阳性组，灌胃海藻多酚组小鼠的血清IgG抗体水平均有不同程度的下降，表明本发明提取纯化所得的海藻多酚具有显著的抗过敏活性。
试验例6海藻多酚对RAW267.4炎症细胞的影响
采用CCK-8试剂盒(购自MedChemExpress有限责任公司)测定从马尾藻中提取的海藻多酚对RAW267.4细胞活力的影响，利用酶标仪读取450nm处细胞孔板的吸光度值。由图12可知，当多酚浓度≤50μg/ml时，RAW264.7炎症细胞模型的细胞活力均在90％以上，基本未受影响。当多酚含量大于等于50μg/ml时，细胞活力受到严重抑制，故选择≤50μg/ml的多酚含量进行后续测定。
使用Griess法测定RAW267.4炎症细胞中NO释放量，具体为：分别向贴壁的RAW264.7细胞中加入100μL使用DMEM培养基稀释的不同浓度梯度(1、5、10、50、100、200、300μg/ml)的海藻多酚样品溶液，以未添加海藻多酚的DMEM生长培养基为对照组，于37℃、5.0％CO2的条件下培养24h后，每孔取出50μL培养上清液置于新的96孔细胞培养板，然后向上清液中加入100μL的Griess试剂，室温遮光孵育20min后，于540nm下测定吸光值。同时，利用不同浓度(0、6.25、12.5、25、50μmol/ml)的NaNO2溶液绘制标准曲线，计算培养上清液中NO2-的含量，即为RAW264.7细胞释放NO的量。测定结果如图13所示。
为了评价从马尾藻中提取的海藻多酚的细胞毒性，采用CCK-8法测定其毒性。具体为：将RAW.264.7细胞置于96孔板中，在37℃，5％CO2孵育24h。加入脂多糖(LPS)刺激培养24h后，用台式缓冲液冲洗板，加入100μL不同浓度(1、5、10、25、50μg/ml)的海藻多酚孵育2h，检测NO的释放；并利用TNF-α检测试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)测定细胞培养上清液中TNF-α的含量。
测定结果如图13所示。
由图13可知，与LPS组相比，细胞上清液中TNF-α和NO释放量均有所降低且存在明显的剂量依赖性，存在显著性差异。
将RAW.264.7细胞置于96孔板中，在37℃，5％CO2孵育24h。加入脂多糖(LPS)刺激培养24h后，用台式缓冲液冲洗板，每孔分别加入100μL的以下抑制剂：PDTC(NF-κB活化抑制剂，100mmol/L)、SP600125(JNK1/2MAPK抑制剂，100mmol/L)、U0126(Erk1/2MAPK抑制剂，10mmol/L)和SB203580(p38 MAPK抑制剂，10mmol/L)，于37℃细胞培养箱中孵育12h，随后加入100μL 10μg/ml从马尾藻中提取的海藻多酚孵育2h，取细胞培养上清液，采用Griess法检测NO的释放，利用TNF-α检测试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)测定细胞培养上清液中TNF-α的含量。结果如图14所示。
由图14可知，三种抑制剂：PDTC(NF-κB活化抑制剂)、SP600125(JNK1/2MAPK抑制剂)和U0126(Erk1/2MAPK抑制剂)能够显著抑制海藻多酚诱导RAW264.7细胞释放NO。PDTC、U0126、SP600125和SB203580(p38 MAPK抑制剂)对海藻多酚诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α显示出显著的抑制作用，从而抑制了炎症反应的产生。
综上可知，本发明从马尾藻中提取纯化所得的海藻多酚具有显著的抗炎症活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种海藻多酚的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将马尾藻与乙醇混合浸提，过滤，收集滤液获得海藻多酚粗提液；
(2)将所述海藻多酚粗提液过大孔树脂纯化，获得提纯液；
(3)将所述提纯液进行色谱分离，获得纯化的海藻多酚。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述马尾藻与乙醇的料液比为1g:12～17ml，所述乙醇的体积分数为70～80％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述浸提时伴随搅拌，所述搅拌的温度为30～50℃，所述搅拌的转速为500～1500r/min，所述搅拌的时间为7～10h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述浸提后进行离心，所述离心的转速为8000～10000r/min，所述离心的时间为5～15min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述纯化的方式为动态洗脱，当洗脱体积为0～90ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；洗脱体积为90～250ml时，每3～5ml收集一管洗脱液；洗脱体积为250～350ml时，每8～10ml收集一管洗脱液；所述洗脱的流速为3～9BV/h。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱体积为200～270ml时，对洗脱液进行旋转蒸发浓缩处理。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述色谱分离的方法为高效液相色谱法，所述高效液相色谱法包括：以乙腈+0.01％甲酸为A相，以超纯水+0.01％甲酸为B相；在0～30min，以5:95～25:75(A:B，V/V)；在30min～60min，以25:75～45:55(A:B，V/V)的方式进行梯度洗脱。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法制得的海藻多酚。
9.如权利要求8所述的海藻多酚在制备抗过敏和/或抗炎药物中的应用。
10.如权利要求8所述的海藻多酚在制备抗过敏和/或抗炎保健品中的应用。
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