CN108498590B

CN108498590B - 一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂

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Publication number: CN108498590B
Application number: CN201810676675.6A
Authority: CN
Inventors: 袁珂; 李静婉; 罗阳; 方继莉
Original assignee: Jiyang College of Zhejiang A&F University
Current assignee: Zhuji Xiangde Textile Co ltd
Priority date: 2018-06-27
Filing date: 2018-06-27
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2038-06-27
Also published as: CN108498590A

Abstract

一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，属于降糖剂技术领域。由小檗碱富马酸盐、小檗碱柠檬酸盐、大黄总蒽醌苷、黄芩总黄酮、火麻仁脂肪油按照重量比30‑50:30‑50:3‑5:6‑15:1‑3的比例进行混合制成。上述一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，避免了使用盐酸小檗碱作为降糖剂引起的高氯血症，通过肠道菌群的调节和分子通路的协调作用起到改善代谢作用，大大提高了口服生物利用度及降糖效果；原料属纯天然来源，降糖效果显著，稳定持久、绿色安全，无毒副作用；临床应用后，慢性糖尿病患者停用西药降糖药，坚持服用该产品1年以上，血糖等各项指标正常、稳定。

Description

一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂

技术领域

本发明属于降糖剂技术领域，具体为一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂。

背景技术

随着人口老龄化的加速和人们生活方式的改变，糖尿病患者日趋增多。据初步统计，在世界范围内成人糖尿病患者人数，预计到2025 年可占世界人口的5.4%，届时，我国糖尿病人口数量可达到3800万之多，其中Ⅱ型糖尿病患者占到 90%左右，糖尿病以及相关并发症，对健康造成危害，严重影响患者的生活质量。因此，在天然药物中寻找安全、有效的降血糖及防治糖尿病并发症的药物具有重要意义。

小檗碱又称为黄连素，主要存在于毛茛科植物黄连、黄柏、三棵针中，是一种常见的异喹啉类生物碱。小檗碱的盐酸盐（俗称盐酸黄连素）广泛用于临床治疗胃肠炎、细菌性痢疾等，成为治疗肠道感染的植物抗菌素。大量研究已经证明，盐酸小檗碱除了具有抗菌作用外，还具有降血糖、治疗心血管疾病、抗肿瘤、抗氧化、抗高血脂、抗高血压等作用，特别是它在治疗糖尿病、心血管疾病等方面显示出了良好的应用前景。小檗碱用途非常广泛，且药源广泛易得，价格低廉，使用方便、安全。目前研究多以小檗碱的盐酸盐为主，且市场上均以盐酸小檗碱成药，但仍然存在如药物生物利用度低、在肠道内几乎不被吸收，长期使用可引发高氯血症及其它慢性疾病等不足。

代谢性酸中毒是临床上一种常见的并发症，并有很多的副作用，主要包括对心肌功能的影响、抑制免疫功能、恶化心血管功能、诱发心律不齐、激发炎症反应等，严重时可引发患者的突然死亡。高氯性酸中毒是代谢性酸中毒的一种，临床上多因为短期内大量输注生理盐水引起体内离子紊乱，导致高氯性酸中毒。在重症监护病房中，高氯性酸中毒的发病率达到 45%，致死率则高达 29%。糖尿病本身就会引起各种代谢紊乱，氯离子的长期大量服用，很有可能会造成人体氯离子浓度升高、电解质紊乱，从而引发高氯性代谢紊乱，恶化糖尿病病情。目前对于小檗碱的研究大部分基于对其盐酸盐的研究，市场上也多以盐酸小檗碱成药，但其中9.23%的氯，无疑是一种潜在的危害。另外，绝大多数人平日的食盐摄入量已超过标准。因此，对于自身代谢已处于紊乱状态的Ⅱ型糖尿病患者来说，在控制血糖这个漫长甚至一生的过程中，持续、大量的摄入盐酸盐，很有可能会引起电解质代谢紊乱，引发高氯血症，从而不利于糖尿病患者病情的控制。

已知肠道菌群在Ⅱ型糖尿病的发病、治疗、恢复等过程中发挥了重要作用，它已经成为糖尿病、肥胖等代谢类疾病治疗的作用新靶点。肠道内菌群结构的紊乱可引发机体免疫力下降、引发慢性炎症反应、能导致能量失衡等一系列问题，进而引发胰岛素抵抗、肥胖等代谢的失调，最终促使Ⅱ型糖尿病的发生或恶化。越来越多的研究表明，肠道内的微生物能够通过影响宿主的信号通路，可能会引发代谢综合征、癌症、甲状腺病变等多种的疾病。因此，治疗，调节肠道菌群可能有益于改善宿主的糖代谢和胰岛素抵抗。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂的技术方案，其避免了使用盐酸小檗碱作为降糖剂引起的高氯血症，通过肠道菌群的调节和分子通路的协调作用起到改善代谢作用，大大提高了口服生物利用度及降糖效果；原料属纯天然来源，降糖效果显著，稳定持久、绿色安全，无毒副作用；克服了西药降糖药长期使用对肝脏、肾脏、甚至心脏等脏器造成的损害；临床应用后，慢性糖尿病患者停用西药降糖药，坚持服用该产品1年以上，血糖等各项指标正常、稳定。

所述的一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，其特征在于由小檗碱富马酸盐、小檗碱柠檬酸盐、大黄总蒽醌苷、黄芩总黄酮、火麻仁脂肪油按照重量比30-50:30-50:3-5:6-15:1-3的比例进行混合制成。

所述的一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，其特征在于所述的小檗碱富马酸盐采用以下方法制备：

1）盐酸小檗碱的提取和纯化：将干燥的黄柏粉碎成粗粉，每次用4-6倍量60%-80%的乙醇回流提取2-3次，每次1-3 h；抽滤，合并滤液，45-55℃下真空薄膜浓缩至无醇味，加入38%的浓盐酸调节pH值3-5，至盐酸黄连素沉淀析出，采用80%-90%的乙醇对盐酸黄连素进行重结晶，得到黄色针晶，即为盐酸小檗碱；

2）取盐酸小檗碱和富马酸按质量比1:1.5-2.5，分别溶于蒸馏水，盐酸小檗碱与水的比例为1:40-60，富马酸与水的比例为1:5-6，70-90℃水浴加热溶解，将富马酸水溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中，搅拌加热反应3-5h，室温冷却后于0-5℃放置过夜，析出晶体，抽滤，用蒸馏水洗涤，于55-65℃干燥即得富马酸小檗碱，采用80%-90%的乙醇重结晶后得到小檗碱富马酸盐。

所述的一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，其特征在于所述的小檗碱柠檬酸盐采用以下方法制备：

2）取盐酸小檗碱和柠檬酸按质量比1:1.5-2.5，分别溶于蒸馏水，盐酸小檗碱与水的比例为1:40-50，柠檬酸与水的比例为1:5-6，在70-90℃水浴加热溶解，将柠檬酸水溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中，搅拌加热反应3-5h，室温冷却后于0-5℃ 放置过夜，析出晶体，抽滤，用蒸馏水洗涤，于55-65℃干燥即得柠檬酸小檗碱，采用80%-90%的乙醇重结晶后得到小檗碱柠檬酸盐。

所述的一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，其特征在于所述的大黄总蒽醌苷采用以下方法制备：取通过20目的大黄粗粉，每次用5-8倍量的60%-80%乙醇在50-80℃条件下超声提取3次，每次1-2h，合并滤液，闪蒸浓缩至原体积的1/6-1/8，浓缩液无醇味，浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取液真空薄膜浓缩至浸膏，然后超声分散到适量水中，直至呈浓溶液，将样品通过Diaion HP-20 大孔吸附树脂柱色谱，分别用去离子水、10%MeOH、20%MeOH、40%MeOH、60%MeOH、70% Me₂CO依次洗脱，洗脱溶剂用量为柱体积的3-4倍量，分别收集洗脱液，将40%MeOH和60%MeOH洗脱液合并，真空薄膜浓缩并抽干，获得大黄总蒽醌苷干粉。

所述的一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，其特征在于所述的黄芩总黄酮采用以下方法制备：取干燥粉碎成粗粉的黄芩，每次用50-80%的乙醇做溶剂在60-80℃水浴中超声提取2-3次，每次1-3h，抽滤，合并滤液，采用真空薄膜浓缩装置进行减压浓缩至原体积的1/6-1/8，浓缩液无醇味，浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取液真空薄膜浓缩至浸膏，改用旋转蒸发仪真空浓缩成干粉，得到黄芩总黄酮干粉。

所述的一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，其特征在于所述的火麻仁脂肪油采用以下方法制备：取干燥的火麻仁，采用压榨法得到火麻仁脂肪油。

所述的一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，其特征在于小檗碱富马酸盐、小檗碱柠檬酸盐、大黄总蒽醌苷、黄芩总黄酮、火麻仁脂肪油的重量比35-45:35-45:3.5-4.5:7-13:1.5-2.5，优选40-42:40-42:4-4.3:10-12:2-2.3。

上述一种能提高生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，具有以下优点：

1.本产品避免了使用盐酸小檗碱作为降糖剂引起的高氯血症，长期大量使用不会引起人体的pH值下降和氯离子浓度的升高。

2.比起盐酸小檗碱，小檗碱有机酸盐和大黄蒽醌苷、黄芩总黄酮和火麻仁脂肪油的合理复配，通过肠道菌群的调节和分子通路的协调作用起到改善代谢作用，大大提高了口服生物利用度及降糖效果。

3.本产品中加入大黄总蒽醌苷，除了对小檗碱有机酸盐的降糖作用起到增效作用外，其本身的泻下作用及黄芩总黄酮及火麻仁脂肪油的加入起到了调节胃肠道不适、润肠通便的作用，长期使用不会引起像单独使用小檗碱那样的胃肠不适和大便不畅。

4.该产品属纯天然来源，降糖效果显著，稳定持久、绿色安全，无毒副作用，克服了西药降糖药长期使用对肝脏、肾脏、甚至心脏等脏器造成的损害。

5.临床应用后，慢性糖尿病患者停用西药降糖药，坚持服用该产品1年以上，血糖等各项指标正常、稳定。

附图说明

图1为盐酸小檗碱的核磁共振碳谱图；

图2为富马酸小檗碱的核磁共振碳谱图；

图3为柠檬酸小檗碱的核磁共振碳谱图；

图4为RT-PCR和western blot检测结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

1、黄柏中盐酸小檗碱的提取和纯化：将干燥的黄柏粉碎成粗粉，每次用4倍量70%的乙醇回流提取2次，每次2h。抽滤，合并滤液，50℃下真空薄膜浓缩至无醇味。加入38%的浓盐酸调节pH值4，至盐酸黄连素沉淀析出。采用80%的乙醇对盐酸黄连素进行重结晶，得到黄色针晶，即为盐酸小檗碱。

2、小檗碱有机酸盐（富马酸盐和柠檬酸盐）的制备与纯化：取盐酸小檗碱和柠檬酸按质量比1:2，分别溶于蒸馏水，盐酸小檗碱与水的比例为1:45，柠檬酸与水的比例为1:5，在80℃水浴加热溶解。将柠檬酸水溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中，搅拌加热反应4h，室温冷却后于0℃ 放置过夜，析出晶体。抽滤，用蒸馏水洗涤，于60℃干燥即得柠檬酸小檗碱，采用90%的乙醇重结晶后得到柠檬酸小檗碱结晶。取盐酸小檗碱和富马酸按质量比1:2.5，分别溶于蒸馏水，盐酸小檗碱与水的比例为1:50，富马酸与水的比例为1: 6，70℃水浴加热溶解。将富马酸水溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中，搅拌加热反应5h，室温冷却后于0℃放置过夜，析出晶体。抽滤，用蒸馏水洗涤，于60℃干燥即得富马酸小檗碱，采用85%的乙醇重结晶后得到富马酸小檗碱结晶。经HPLC峰面积归一化法标定纯度，其纯化后的小檗碱富马酸盐的含量达98.12%，小檗碱柠檬酸盐的含量达98.35%。

3、大黄总蒽醌苷的提取和纯化：取通过20目的大黄粗粉，每次用6倍量的80%乙醇在60℃条件下超声提取2次，每次1.5h，合并滤液，闪蒸浓缩至原体积的1/7（浓缩液无醇味）。浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。正丁醇萃取液真空薄膜浓缩至浸膏，然后超声分散到适量水中，直至呈浓的溶液。将样品通过Diaion HP-20 大孔吸附树脂柱色谱，分别用去离子水、10%MeOH、20%MeOH、40%MeOH、60%MeOH、70% Me₂CO依次洗脱，洗脱溶剂用量为柱体积的4倍量。分别收集洗脱液，将40%MeOH和60%MeOH洗脱液合并，真空薄膜浓缩并抽干，获得大黄总蒽醌苷干粉。采用紫外法测定大黄总蒽醌苷干粉中总蒽醌苷的含量达到85.12%。

4、黄芩中总黄酮有效部位的提取纯化：取干燥粉碎成粗粉的黄芩，每次用70%的乙醇做溶剂在60℃水浴中超声提取3次，每次2h，抽滤，合并滤液，采用真空薄膜浓缩装置进行减压浓缩至原体积的1/8（浓缩液无醇味）。浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。正丁醇萃取液真空薄膜浓缩至浸膏，改用旋转蒸发仪真空浓缩成干粉，得到黄芩总黄酮苷提取纯化物。采用紫外法测定，黄芩黄酮苷提取纯化物中总黄酮苷的含量达到77.84%。

5、火麻仁中脂肪油的压榨提取：取干燥的火麻仁，采用压榨法得到火麻仁脂肪油。火麻仁的出油率达到8.6%。对火麻仁压榨后获得的脂肪油测定，其脂肪油的含量达到91.56%。

6、将小檗碱富马酸盐、小檗碱柠檬酸盐、大黄总蒽醌苷、黄芩总黄酮、火麻仁脂肪油按照重量比30:50:5:12:3的比例进行混合，装入硬胶囊，获得该产品。

实施例2：

1、黄柏中盐酸小檗碱的提取和纯化：将干燥的黄柏粉碎成粗粉，每次用6倍量60%的乙醇回流提取3次，每次1.5 h。抽滤，合并滤液，50℃下真空薄膜浓缩至无醇味。加入38%的浓盐酸调节pH值3，至盐酸黄连素沉淀析出。采用80%的乙醇对盐酸黄连素进行重结晶，得到黄色针晶，即为盐酸小檗碱。

2、小檗碱有机酸盐（富马酸盐和柠檬酸盐）的制备与纯化：取盐酸小檗碱和柠檬酸按质量比1:2，分别溶于蒸馏水，盐酸小檗碱与水的比例为1:50，柠檬酸与水的比例为1:6，在80℃水浴加热溶解。将柠檬酸水溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中，搅拌加热反应4h，室温冷却后于2℃ 放置过夜，析出晶体。抽滤，用蒸馏水洗涤，于60℃干燥即得柠檬酸小檗碱，采用80%的乙醇重结晶后得到柠檬酸小檗碱结晶。取盐酸小檗碱和富马酸按质量比1: 2.5，分别溶于蒸馏水，盐酸小檗碱与水的比例为1:55，富马酸与水的比例为1:5，70℃水浴加热溶解。将富马酸水溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中，搅拌加热反应3h，室温冷却后于0℃放置过夜，析出晶体。抽滤，用蒸馏水洗涤，于60℃干燥即得富马酸小檗碱，采用85%的乙醇重结晶后得到富马酸小檗碱结晶。经HPLC峰面积归一化法标定纯度，其纯化后的小檗碱富马酸盐的含量达98.89%，小檗碱柠檬酸盐的含量达98.65%。

3、大黄总蒽醌苷的提取和纯化：取通过20目的大黄粗粉，每次用7倍量的75%乙醇在65℃条件下超声提取2次，每次1.5h，合并滤液，闪蒸浓缩至原体积的1/8（浓缩液无醇味）。浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。正丁醇萃取液真空薄膜浓缩至浸膏，然后超声分散到适量水中，直至呈浓的溶液状。将样品通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱，分别用去离子水、10%MeOH、20%MeOH、40%MeOH、60%MeOH、70% Me₂CO依次洗脱，洗脱溶剂用量为柱体积的4倍量。分别收集洗脱液，将40%MeOH和60%MeOH洗脱液合并，真空薄膜浓缩并抽干，获得大黄总蒽醌苷干粉。采用紫外法测定大大黄总蒽醌苷干粉中总蒽醌苷的含量达到85.04%。

4、黄芩总黄酮的提取纯化：取干燥粉碎成粗粉的黄芩，每次用75%的乙醇做溶剂在65℃水浴中超声提取3次，每次2h，抽滤，合并滤液，采用真空薄膜浓缩装置进行减压浓缩至原体积的1/6（浓缩液无醇味）。浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。正丁醇萃取液真空薄膜浓缩至浸膏，改用旋转蒸发仪真空浓缩成干粉，得到黄芩总黄酮干粉。采用紫外法测定，黄芩总黄酮干粉中总黄酮苷的含量达到75.98%。

5、火麻仁中脂肪油的压榨提取：取干燥的火麻仁，采用压榨法得到火麻仁脂肪油。火麻仁的出油率达到9.4%。对火麻仁压榨后获得的脂肪油测定，其脂肪油的含量达到90.84%。

6、将小檗碱富马酸盐、小檗碱柠檬酸盐、大黄总蒽醌苷、黄芩总黄酮、火麻仁脂肪油按照重量比40:42:4:10:2的比例进行混合，装入硬胶囊，获得该产品。

实施例3：

1、黄柏中盐酸小檗碱的提取和纯化：将干燥的黄柏粉碎成粗粉，每次用5倍量80%的乙醇回流提取3次，每次1.5h。抽滤，合并滤液，50℃下真空薄膜浓缩至无醇味。加入38%的浓盐酸调节pH值4，至盐酸黄连素沉淀析出。采用85%的乙醇对盐酸黄连素进行重结晶，得到黄色针晶，即为盐酸小檗碱。

2、小檗碱有机酸盐（富马酸盐和柠檬酸盐）的制备与纯化：取盐酸小檗碱和柠檬酸按质量比1: 2.5，分别溶于蒸馏水，盐酸小檗碱与水的比例为1:50，柠檬酸与水的比例为1:6，在75℃水浴加热溶解。将柠檬酸水溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中，搅拌加热反应4h，室温冷却后于0℃ 放置过夜，析出晶体。抽滤，用蒸馏水洗涤，于60℃干燥即得柠檬酸小檗碱，采用90%的乙醇重结晶后得到柠檬酸小檗碱结晶。取盐酸小檗碱和富马酸按质量比1:2，分别溶于蒸馏水，盐酸小檗碱与水的比例为1:55，富马酸与水的比例为1:5，75℃水浴加热溶解。将富马酸水溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中，搅拌加热反应5h，室温冷却后于0℃放置过夜，析出晶体。抽滤，用蒸馏水洗涤，于60℃干燥即得富马酸小檗碱，采用85%的乙醇重结晶后得到富马酸小檗碱结晶。经HPLC峰面积归一化法标定纯度，其纯化后的小檗碱富马酸盐的含量达99.14%，小檗碱柠檬酸盐的含量达98.37%。

3、大黄总蒽醌苷的提取和纯化：取通过20目的大黄粗粉，每次用6倍量的65%乙醇在75℃条件下超声提取2次，每次2h，合并滤液，闪蒸浓缩至原体积的1/7（浓缩液无醇味）。浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。正丁醇萃取液真空薄膜浓缩至浸膏，然后超声分散到适量水中,直至呈浓的溶液。将样品通过Diaion HP-20 大孔吸附树脂柱色谱，分别用去离子水、10%MeOH、20%MeOH、40%MeOH、60%MeOH、70% Me₂CO依次洗脱，洗脱溶剂用量为柱体积的3倍量。分别收集洗脱液，将40%MeOH和60%MeOH洗脱液合并，真空薄膜浓缩并抽干，获得黄芩总黄酮干粉。采用紫外法测定，黄芩总黄酮干粉中总黄酮苷的含量达到83.95%。

4、黄芩总黄酮的提取纯化：取干燥粉碎成粗粉的黄芩，每次用75%的乙醇做溶剂在80℃水浴中超声提取3次，每次2h，抽滤，合并滤液，采用真空薄膜浓缩装置进行减压浓缩至原体积的1/8（浓缩液无醇味）。浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。正丁醇萃取液真空薄膜浓缩至浸膏，改用旋转蒸发仪真空浓缩成干粉，得到黄芩总黄酮干粉。采用紫外法测定，黄芩总黄酮干粉中总黄酮苷的含量达到79.18%。

5、火麻仁中脂肪油的压榨提取：取干燥的火麻仁，采用压榨法得到火麻仁脂肪油。火麻仁的出油率达到10.4%。对火麻仁压榨后获得的脂肪油测定，其脂肪油的含量达到94.06%。

6、将小檗碱富马酸盐、小檗碱柠檬酸盐、大黄总蒽醌苷、黄芩总黄酮、火麻仁脂肪油按照重量比42:45:4:8:1的比例进行混合，装入硬胶囊，获得该产品。

以下通过具体的试验数据进一步证明本发明的有益效果。

1、小檗碱富马酸盐和柠檬酸盐有效防止T2D大鼠高氯血症的研究

小檗碱属于强碱，其游离态不稳定，常将其制成盐酸盐的形式保存，然而，小檗碱盐酸盐中氯的含量约为9.23%，这对于糖尿病患者是一个潜在的危害。糖尿病本身就会引起各种代谢紊乱，长期大量服用盐酸盐，很有可能会造成人体氯离子浓度升高、电解质紊乱，从而引发高氯性代谢紊乱，即高氯血症。高氯血症是一种常见的电解质紊乱症，是代谢性酸中毒的一种。临床上多因为大量输注生理盐水引起的离子紊乱，导致高氯性酸中毒。

1.1 实验试剂与设备

无水乙醇为国产分析纯试剂；链脲佐菌素（STZ），纯度大于98%（分析纯）；大鼠葡萄糖（Rat Glucose）ELISA试剂盒；总胆固醇（TC）ELISA试剂盒；甘油三酯（TG）ELISA试剂盒；胰岛素（Insulin）ELISA试剂盒；ABL 800血气分析仪；101-3电热鼓风恒温干燥箱；BPG-9040A精密鼓风干燥箱；R201B旋转蒸发仪；SHBⅢ循环水式多用真空泵；PL2002型梅特勒电子分析天平；KQ-250B型超声波清洗器；Millipore Simplicity型超纯水器；WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计；Multiskan FC型酶标仪；移液枪；LG10-2.4A高速离心机；JJ-12J 脱水机；AP280-2包埋机；HM335E半自动石蜡切片机；JB-L5冻台；KD-P组织摊片机；DGX-9003B烤箱；10212432C载玻片及盖玻片；ST5010莱卡染色机；NIKON ECLIPSE TI-SR导致荧光显微镜；96孔酶标板。

1.2 动物实验

实验动物：清洁级SD（Sprague-Dawley）大鼠，3-4周龄，体重180-200g。饲养环境保持温度20±2℃，湿度60±5%，每日光照/黑暗各12小时循环。高脂高糖饲料中含脂肪20%、蔗糖20%、胆固醇2.5%。大鼠和饲料均购自浙江省实验动物中心（SCXK 2014-0001）。所有的动物实验的程序都符合中国动物护理的指导方针，符合国际上对实验动物的使用规则。

Ⅱ型糖尿病模型的建立：SD大鼠适应性喂养一周后，随机选取6只作为正常对照组（normal control，NC），剩余大鼠给予高脂高糖饲料，喂养8周后，禁食12h，给予腹腔注射30mg/kg STZ。4周后，测大鼠空腹血糖（FBG），FBG＞7.8mmol•L^-1则模型建立成功。

动物实验设计：将建模成功的Ⅱ型糖尿病大鼠，随机分为5组，每组6只：糖尿病对照组T2D）、NH4Cl对照组（AC）、盐酸小檗碱组（BH）、柠檬酸小檗碱组（BC）、富马酸小檗碱组（BF）。各组大鼠均自由饮食、饮水，其中NC组和T2D组给予蒸馏水，AC组给予7.5mg/kg•dNH₄Cl水溶液，其余分别给予500mg/kg•d小檗碱盐酸盐和有机酸盐混悬液，灌胃给药6周，正常（NC）组大鼠给予等量的蒸馏水。给药期间各组大鼠自由饮水用食。实验过程中，观察大鼠的饮食、排泄及表观状态变化，记录每周各组大鼠的体重变化。进行空腹血糖、空腹胰岛素、甘油三酯、胆固醇和胰岛素抵抗指数的检测。经过6周给药处理，经12-18小时的过夜空腹后，从大鼠眼角静脉丛取血，并于6000rmp离心10分钟。取上清液，用试剂盒检测空腹血糖、空腹胰岛素、甘油三酯、胆固醇的水平，计算胰岛素抵抗指数：HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰岛素÷22.5。

1.3 血气分析

在大鼠给药处理6周的时候，从各组大鼠眼角静脉丛取血，置于肝素化管中，2个小时内进行血气分析。检测指标如下：pH值，二氧化碳分压（PCO₂），碳酸氢根离子（HCO₃ ^-）、钾离子（K⁺）、钠离子（Na⁺）、钙离子（Ca²⁺）和氯离子（Cl^-）的浓度，碱剩余（BE）值。

统计学分析：所有的数据均用平均值±方差表示，用SPSS软件进行分析。用单因素方差分析（ANOVA）和Duncan检测进行组间比较。P值小于0.05被认为具有统计学意义

1.4 结果与讨论

各组大鼠的表观与体重变化：与NC组大鼠相比，链脲佐菌素诱导的T2D大鼠，出现多饮、多食、多尿、消瘦、乏力等特点。这些现象在经过盐酸小檗碱和有机酸小檗碱的给药处理后均有缓解，但与有机酸小檗碱组的大鼠相比，BH组的大鼠有活动少、食物摄入量减少、精神状态差的特点。然而，随着病情的发展，给予蒸馏水处理的T2D组和给予氯化铵水溶液处理的AC组大鼠，均表现出逐渐恶化的症状，出现毛发稀疏、肮脏、暗淡无光泽、行为迟缓等不良现象，特别是AC组的大鼠，情况最为严重。在给药过程中，T2D组和AC组大鼠体重表现出持续下降的趋势，尤其是AC组的变化，AC组大鼠体重呈快速降低趋势，比T2D组大鼠体重降低的程度大，这表明了高氯血症能够恶化Ⅱ型糖尿病大鼠的病情。相反，给药组的大鼠体重变化呈上升趋势，逐渐趋近于正常值，表明小檗碱对Ⅱ型糖尿病大鼠体重的控制，整体效果好。

盐酸小檗碱和有机酸小檗碱对血浆TG、TC、FBG、FINS和HOMA-IR水平影响：给药6周处理后，与NC组相比，T2D大鼠血浆中TG、TC、FBG和HOMA-IR的水平显著升高，而盐酸小檗碱和有机酸小檗碱组的大鼠血浆中的这些指标显著降低；T2D大鼠血浆中FINS水平显著降低，盐酸小檗碱组和有机酸小檗碱组的大鼠血浆中的FINS水平显著升高。说明经过6周的给药处理，盐酸小檗碱和有机酸小檗碱（富马酸小檗碱和柠檬酸小檗碱）均能良好地控制Ⅱ型糖尿病大鼠的病情。见表1。

盐酸小檗碱和有机酸小檗碱对血浆中各离子浓度的影响：当胰岛素分泌不足引起胰岛素抵抗时，会引发糖尿病，其特征在于通过一系列的脂质、蛋白质、能量和碳水化合物等代谢紊乱，影响机体正常的氧供应和酸碱平衡。盐酸小檗碱在临床医学中应用广泛，但氯离子的存在对需要长期或大量服用的糖尿病患者来说无疑是一种潜在的危险。氯化铵（AC）常被用来诱导动物的代谢性酸中毒。实验中AC组作为高氯性代谢性酸中毒的阳性对照组，给予7.5mg/kg的AC溶液。AC溶液中的氯离子浓度等同于500mg/kg的BH中氯离子的浓度。给予AC溶液处理4周后，AC组大鼠血浆中Na+，K+和Cl-的浓度均明显高于NC组；此外，血浆的pH值和HCO3-浓度较正常对照组大鼠显著降低，这与高氯代谢性酸中毒的特点相一致。口服氯化铵2周后，Ⅱ型糖尿病大鼠血浆中游离的钙离子浓度明显高于正常大鼠，甚至超出了正常范围。相反，T2D组的大鼠血浆中游离的钙离子浓度明显低于正常大鼠。Ⅱ型糖尿病大鼠在经过盐酸小檗碱或有机酸小檗碱治疗后，血浆中钙离子浓度明显高于给予蒸馏水处理的Ⅱ型糖尿病大鼠，并且，盐酸小檗碱或有机酸小檗碱可以将Ⅱ型糖尿病大鼠血浆中的钙离子浓度控制在正常范围内。这表明，它们能有效防止Ⅱ型糖尿病大鼠钙的流失。见表2。

高氯血症是一种常见的电解质代谢紊乱，主要是由摄入过量的酸性氯化物导致，常伴有高氯性酸中毒。当人体处在一个高浓度的氯离子的环境中时，也可能引起高氯血症，比如，摄入盐水或溺于盐水。盐酸（HCl）很少被直接用作酸化剂，但却可以通过含酸性药物的代谢产生氯化铵等。其产物HCl导致HCO₃ ^- 中H⁺的消耗，这个反应导致CO₂的产生和氯离子浓度的升高。代谢性酸中毒的特点是血浆中HCO₃ ^-和PCO₂水平的降低。实验结果证实，Ⅱ型糖尿病大鼠经过盐酸小檗碱治疗后，血浆的pH值下降，Cl^-浓度增加。同时，血浆HCO₃ ^-浓度降低。这些结果与代谢性酸中毒的特点一致。因此，Ⅱ型糖尿病大鼠口服盐酸小檗碱6周后，出现明显的高氯性代谢性酸中毒的迹象。而用有机酸小檗碱（富马酸小檗碱或柠檬酸小檗碱）治疗的Ⅱ型糖尿病大鼠没有出现高氯性代谢性酸中毒的迹象。见表2。

高血压和高氯血症的主要诱导剂就是氯离子。世界卫生组织规定的盐摄入量的目标是每人每天大约5克。与NC组和T2D组相比，AC组在给予氯化铵溶液6周后，大鼠血浆中Cl^-浓度明显增加。此外，与NC组相比和T2D组相比，在给予盐酸小檗碱6周处理后，大鼠血浆中Cl^-浓度显著升高。用富马酸小檗碱或柠檬酸小檗碱组治疗6周后，大鼠血浆中的氯离子浓度大大低于AC组。见表2。

维持酸碱稳定状态是所有生命活动正常进行的基本前提，因此，pH的调节作用是机体的一项重要功能。此外，体内酸碱的失衡会引发一系列的疾病。代谢性酸中毒会产生许多的副作用，包括对心肌和心血管功能的影响，如诱发性心律失常、刺激炎症反应、抑制免疫功能，甚至导致病人猝死等。当碳酸氢盐的流失，或非挥发性酸的积累超过机体的缓冲能力时，引发代谢性酸中毒，主要表现为体液pH值的下降。评估代谢性酸中毒的严重程度，根据动脉血气将pH值分为三级：轻度（pH值7.30 - 7.36），中度（pH值7.20 - 7.29），或重度（pH＜7.20）。本研究表明，与NC组和T2D组相比，给予4周或6周氯化铵水溶液处理后，Ⅱ型糖尿病大鼠血浆的pH值明显下降。此外，与NC组和T2D组相比，给予盐酸小檗碱治疗4周或6周后，Ⅱ型糖尿病大鼠血浆的pH值显著下降。治疗6周后，BH组大鼠血浆的pH值降至7.28±0.03，提示轻度或中度酸中毒。然而，富马酸小檗碱或柠檬酸小檗碱组大鼠血浆的pH值无下降。见图2。T2D组大鼠血浆中HCO₃ ^-浓度升高，而PCO₂水平显著下降，这表明伴随有潜在的呼吸性碱中毒。T2D组Ⅱ型糖尿病大鼠血浆的pH值均在正常范围内。

在日常生活中，人们往往忽视了血液中高量的氯对人体的微妙影响，它多数是由高盐饮食引起的。长期或大量氯离子的摄入会恶化Ⅱ型糖尿病大鼠的病情，引发高氯血症。有机酸小檗碱对Ⅱ型糖尿病大鼠糖代谢的治疗效果显著，但有机酸小檗碱避免了盐酸小檗碱中氯离子带来的高氯性酸中毒的危害。

2、小檗碱有机酸盐作为降糖剂的大鼠体内药代动力学及生物利用度评价

2.1 实验试剂与设备

盐酸小檗碱、柠檬酸、富马酸、链脲佐菌素，十二烷基硫酸钠、磷酸二氢钾均为分析纯，乙腈为色谱纯；大鼠葡萄糖（Rat Glucose）ELISA试剂盒；LC-20AT高效液相色谱仪；BPG-9040A精密鼓风干燥箱；R201B旋转蒸发仪；SHBⅢ循环水式多用真空泵；PL2002型电子分析天平；KQ-250B型超声波清洗器；Millipore Simplicity型超纯水器；移液枪；LG10-2.4A高速离心机。

2.2 动物实验

实验动物：4周龄的裸鼠（体重约15g），饲养于温度为20±2℃、湿度为60±5％的无菌环境中，保持12小时明暗循环的实验条件，并允许裸鼠自由饮食和饮水。裸鼠及饲料购自浙江省实验动物中心（证书编号：SCXK 2014-0001）。动物实验的所有程序符合中国动物护理指南，符合国际上对实验动物使用的认可。

Ⅱ型糖尿病模型的建立：

Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立：SD大鼠适应性喂养一周后，随机选取6只作为正常对照组（normal control，NC），剩余大鼠给予高脂高糖饲料，喂养8周后，禁食12h，给予腹腔注射30mg/kg STZ。4周后，测大鼠空腹血糖（FBG），FBG＞7.8mmol•L^-1则模型建立成功。

动物实验设计：所有SD大鼠被随机分为5组：正常对照组（NC，非糖尿病大鼠,给予生理盐水），Ⅱ型糖尿病大鼠分为：模型对照组（T2D，给予生理盐水）、盐酸小檗碱组（BH）、柠檬酸小檗碱组（BC）、富马酸小檗碱组（BF），分别灌胃给予500mg•kg^-1，盐酸小檗碱静脉注射组（iv，给予注射6mg/kg盐酸小檗碱溶液）。于给药后 0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24h，从各组大鼠眼角静脉丛取血约0.5ml，置于肝素化的EP管中，5 000 r•min⁻¹ 离心10分钟，分离血浆，于−20℃保存，待测。

高效液相色谱检测：取血浆上清液，用氮气吹干，用300 L流动相过滤0.45μm微孔滤膜，用于高效液相色谱法分析。高效液相色谱仪进行分析的条件：色谱柱为Venusil C18，流动相为乙睛：0.1M磷酸二氢钾溶液；十二烷基硫酸钠（50:50:0.06），流速为1.0mL/min，检测波长为345nm，柱温为35℃，进样量为20μL。盐酸小檗碱标准液浓度为232.971μg/mL，以标准品的进样体积（0，5，10，15，20，25μL）和峰面积作标准曲线，得到回归方程：Y=10081X+1130.1，R²=0.9997。

统计与分析：药代动力学参数（The pharmacokinetic parameters）用PKSolver2.0，采用非房室模型进行分析。相对生物利用度（Fr）的计算如下：Fr =AUC_{0-∞（OBAs）}/AUC_{0-∞（BH）}×100%。绝对生物利用度（Fa）的计算如下：Fa =AUC_0-∞(ig) × D_iv /AUC_0-∞(iv) × D_ig × 100%。所有数据应用统计分析软件进行分析，应用双侧检验和单因素方差分析的方法进行统计学处理，得出统计学结论。数据采用平均值±标准差表示，当 P＜0.05 时，认为具有统计学差异。

盐酸小檗碱和有机酸小檗碱药代动力学及生物利用度：研究证明，小檗碱的肠道吸收效率极低,绝对生物利用度低至 0.68%，经口服后几乎停留在胃肠道，不易透过胃肠道进入血液，这是因为小檗碱是季铵碱，结构中含有季铵基团，亲水性强，穿透细胞膜的能力低，限制了药物的跨膜转运和肠道吸收，导致其生物利用度较低。以盐酸小檗碱、富马酸小檗碱和柠檬酸小檗碱为对照品，高效液相色谱法检测结果显示，小檗碱的盐酸盐和有机酸盐均不受血浆中内源性物质的干扰，峰型和分离度良好。由表3可以看出，在大鼠口服盐酸小檗碱、富马酸小檗碱和柠檬酸小檗碱后，药物很快被吸收入体内，于1h左右血药浓度达到最大值。在6 h左右血药浓度-出现第二个小峰，这可能是由于小檗碱在大鼠体内存在重吸收及肠肝循环导致的。表明盐酸小檗碱、富马酸小檗碱和柠檬酸小檗碱在Ⅱ型糖尿病大鼠体内的代谢和吸收过程相似。

表3显示，与盐酸小檗碱组相比，T2D大鼠服用富马酸小檗碱和柠檬酸小檗碱的最大血药浓度C_max，分别提高了29.6%（BF）和1.90%（BC）；曲线下面积AUC_0-∞高出27.86%（BF）,19.30% （BC）；与盐酸小檗碱相比，有机酸小檗碱的相对生物利用度分别高出了27.86%（BF），19.30%（BC）；相对生物利用度（Fr）分别较盐酸小檗碱提高了1.278倍、1.1931倍。同时，计算出了小檗碱盐酸盐和有机酸盐的绝对生物利用度（Fa），分别为：0.708%，0.970%，0.841%（表3）。说明小檗碱的有机酸大大提高了盐酸小檗碱的口服生物利用度。同时，与盐酸小檗碱相比、富马酸小檗碱和柠檬酸小檗碱在Ⅱ型糖尿病大鼠体内的总清除率（CL/F）明显下降，这表明小檗碱的体内清除速度大大减慢。表明富马酸小檗碱和柠檬酸小檗碱作为一种安全的降糖药，不仅具有很强的降血糖作用，而且大大提高了它的口服生物利用度。

2.3 制备及纯化后的的小檗碱盐酸盐、小檗碱富马酸盐、小檗碱柠檬酸盐的核磁共振碳谱，见图1-3。

3、小檗碱有机酸盐对T2D大鼠降糖机制

Ⅱ型糖尿病不仅与胰岛素抵抗相关，研究还证实与肠道菌群和全身慢炎症反应密切相关。胰岛素抵抗也被证明是一种低级的炎症反应。定植于人体肠道内的微生物菌群与人体自身的能量代谢等密切相关，甚至直接参与消化吸收过程，其种类与数量的微妙变化可能导致各种慢性代谢性疾病的发生发展，因此肠道菌群在糖尿病的发病中起着重要的作用。微生物靶点可能具有降低胰岛素抵抗和降低常见代谢和心血管疾病发生率的潜力。肠道菌群紊乱导致炎症、影响宿主的体重、胰岛素抵抗、胃肠激素调制等，从而恶化糖尿病。因此，调节肠道菌群有益于改善宿主的糖代谢和胰岛素抵抗。富马酸盐常用于治疗慢性炎症性皮肤病、自身免疫性疾病。研究发现富马酸盐在清除炎症过程中释放自由基，从而保护神经和胶质细胞，因此富马酸小檗碱可能对Ⅱ型糖尿病大鼠的肠道及肠道内菌群的结构产生好的调节作用。

3.1 实验试剂与材料

Trizol试剂；RIPA Lysis缓冲液；RT-PCR引物；BCA蛋白浓度测定试剂盒；抗体（一抗和二抗）；无水乙醇为国产分析纯试剂；链脲佐菌素（STZ），纯度大于98%（分析纯）；大鼠葡萄糖（Rat Glucose）ELISA试剂盒； BPG-9040A精密鼓风干燥箱；R201B旋转蒸发仪；SHBⅢ循环水式多用真空泵；PL2002型电子分析天平；KQ-250B型超声波清洗器；MilliporeSimplicity型超纯水器；WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计；Multiskan FC型酶标仪；移液枪；LG10-2.4A高速离心机；JJ-12J 脱水机；AP280-2包埋机； JB-L5冻台；KD-P组织摊片机；DGX-9003B烤箱；96孔酶标板；普通PCR仪；微量核酸蛋白浓度测定仪。

3.2 动物实验及Ⅱ型糖尿病模型的建立

实验动物：清洁级SD大鼠，3-4周龄，体重180-200g。饲养环境保持温度20±2℃，湿度60±5%，每日光照/黑暗各12小时循环。高脂高糖饲料中含脂肪20%、蔗糖20%、胆固醇2.5%。SD大鼠适应性喂养一周后，随机选取6只作为正常对照组（normal control，NC），剩余大鼠给予高脂高糖饲料，喂养8周后，禁食12h，给予腹腔注射30mg/kg STZ。4周后，测大鼠空腹血糖（FBG），FBG＞7.8mmol•L^-1则模型建立成功。

3.3 动物实验设计

所有大鼠随机分为4组，每组8只：正常对照（NC）组，Ⅱ型糖尿病模型（T2D）组，二甲双胍阳性对照（Me）组，500mg/kg富马酸小檗碱（BF）给药组。给药处理4周后，对空腹了12-18小时的大鼠进行眼角静脉取血，于肝素化的管中，5000转离心10分钟。实验后用4%水合氯醛麻醉各组大鼠，并快速摘取回肠组织。组织用生理盐水清洗，在一个无菌的环境中，取大鼠回肠处的新鲜粪便，收集并存储在−80°C冰箱备用。

3.4 半定量RT-PCR分析

大鼠回肠组织样品的总RNA用Trizol抽提。用半定量逆转录PCR法检测mRNA，并用β-actin 蛋白进行归一化。用Oligo dT和逆转录酶对1ug的总RNA进行转录。然后，使用一步法RT-PCR试剂盒和寡核苷酸引物，扩增cDNA。RT-PCR条件为：95°C预变性1min后进入33个循环（JNK和PI3K：95°C 30s，56°C 1min，72°C 1min）或40个循环（β肌动蛋白，TLR4和GLUT2：95°C 30s，60°C 30s），最后72°C延伸5min。RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶上电泳，在Bio-Radchemidoc成像系统上捕获电泳条带。

3.5 Western Blot分析

回肠组织在RIPA Lysis缓冲液中均浆，并于4℃下，14000rmp离心30分钟，获得总蛋白。然后，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒，测定提取物中上清液中的蛋白质浓度。在12%聚丙烯酰胺凝胶上跑电泳，每组上等量的蛋白质（每通道50μg）。电泳后将蛋白质转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在缓冲液（1×TBS、0.1%吐温20，和4%的脱脂牛奶）中，室温下封闭孵育3h，然后在缓冲液中按比例加入相应的抗体：TLR4 （1: 1000）， p-JNK（1: 1000），GLUT2（1:1000），PI3K（1:500），β-actin（1: 1500）。磷酸化的蛋白，孵育时用牛血浆白蛋白代替脱脂牛奶。洗膜3次，每次5分钟，然后，在4℃下孵二抗2个小时。用增强化学发光检测系统检测蛋白质条带。

诸多研究显示，肠道菌群可把不溶性的营养物质如蛋白质、糖类等转化成可溶性物质以方便人体吸收，同时可把难吸收的多糖转变为单糖，分解葡萄糖形成乳酸，参与胆固醇的代谢等，对营养物质在肠道内的代谢具有重要的干预作用。微生态学研究表明：糖尿病患者肠道内菌群种类与数量与正常人存在显著差异。研究发现高脂饮食的小鼠肠道GLP-1等激素的分泌减少，而给予益生菌后能够显著改善GLP-1等激素的分泌，表明胃肠道激素分泌与肠道菌群的改变相关。

3.6 富马酸小檗碱对TLR4/JNK/PI3K信号通路的影响

BF对T2D大鼠胰岛素抵抗的改善功能至少部分是肠道菌群介导的，改变的肠道菌群能减少血浆脂多糖结合蛋白（LBP）水平，从而有助于减轻系统性炎症。当受到高脂饮食的驱动时，JNK基因可诱发导致糖尿病的炎症。JNK通路的激活参与了Ⅱ型糖尿病的发病机制。在糖尿病条件下，c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路在多种组织中被激活，参与胰岛素抵抗和β细胞功能障碍。JNK通路的激活干扰胰岛素的作用，降低胰岛素的生物合成，抑制糖尿病大鼠的JNK通路，提高胰岛素抵抗和β细胞功能，从而改善葡萄糖耐量，可能成为糖尿病的潜在治疗靶点。PI3K信号是胰岛素在肝脏发挥生理效应的主要信号传导通路，PI3K信号系统损害将导致Ⅱ型糖尿病胰岛素抵抗,进而导致肥胖、脂肪肝、代谢综合征的发病。IRS-2的下调可影响其下游 PI3K 信号的有效传递而导致胰岛素抵抗。GLUT2能介导肝葡萄糖的双向转运，其表达发生异常必将导致糖代谢的紊乱，而且在啮齿类动物和人的肝细胞GLUT2都是主要的葡萄糖转运蛋白。

如图4所示，T2D大鼠血浆中LBP的表达明显高于正常组，与NC组相比，T2D组的蛋白TLR4和JNK明显高表达（P＜0.05），蛋白GLUT2和PI3K明显低表达（P＜0.05），而经Me和BF治疗后蛋白表达明显变化（P＜0.05）趋近于NC组。结果表明，BF可能通过JNK/PI3K信号通路减轻体内炎症反应，改善胰岛素抵抗，从而实现改善糖代谢紊乱。

4、安全性评价试验

采用盐酸小檗碱和实施例1-3的胶囊分别进行大鼠长期毒性的安全性试验，以评价实施例1-3的安全性。试验动物采用SD大鼠，共60只大鼠，雌雄大鼠各30只，分别随机分成3组，每组20只。动物隔夜禁食后，对盐酸小檗碱，按照大鼠体重的高、中、低（0.25、0.5、1.0g/kg）剂量组配制药液进行灌胃，对于实施例1-3，按照大鼠每kg体重折合使用富马酸小檗碱和柠檬酸小檗碱质量总和为0.5、1.0、1.5g的剂量来配制药液灌胃。测定血浆中血糖指标、氯离子浓度和pH值。观察并记录大鼠体貌特征及血浆指标，观察中毒症状和死亡情况，结果见表4和表5。

药物剂量为每kg大鼠使用折合富马酸小檗碱和柠檬酸小檗碱质量总和为0.5、1.0、1.5g的实施例1-3的胶囊。

表4的试验结果表明，大鼠长期使用盐酸小檗碱，血浆中氯离子浓度过高，pH值小于7.0，导致高氯酸中毒，中毒率较高。且随着用药时间的延长，大鼠逐渐开始出现中毒症状，如萎靡不振，食欲下降，体重减轻。

表5试验结果表明，大鼠长期使用实施例1-3的降糖剂降糖效果持久稳定，且没有高氯血症及胃肠不适的毒副作用。血浆中氯离子浓度和pH值均在正常值范围内。表明实施例1-3使用安全无毒。

5、糖尿病患者的降糖试验观察

针对年龄组在50-70岁，患病时间在3年以上，西药降糖药用药时间在3年以上的糖尿病患者，完全替换掉西药降糖药，服用实施例1-3的胶囊进行长期跟踪，服用时间为12个月，观察其降糖效果。结果见表6。

表6试验结果表明，患病3年以上的糖尿病患者，在已经服用了西药降糖药3年，血糖稳定在正常水平的情况下，改用纯天然无毒副作用的实施例1-3的胶囊12个月，病人血糖值稳定，每天排便次数正常，精神状态良好。降糖有效率达到100%。

Claims

1.一种能提高小檗碱生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，其特征在于由小檗碱富马酸盐、小檗碱柠檬酸盐、大黄总蒽醌苷、黄芩总黄酮、火麻仁脂肪油按照重量比30-50:30-50:3-5:6-15:1-3的比例进行混合制成；

所述的小檗碱富马酸盐采用以下方法制备：1）盐酸小檗碱的提取和纯化：将干燥的黄柏粉碎成粗粉，每次用4-6倍量60%-80%的乙醇回流提取2-3次，每次1-3 h；抽滤，合并滤液，45-55℃下真空薄膜浓缩至无醇味，加入38%的浓盐酸调节pH值3-5，至盐酸黄连素沉淀析出，采用80%-90%的乙醇对盐酸黄连素进行重结晶，得到黄色针晶，即为盐酸小檗碱；2）取盐酸小檗碱和富马酸按质量比1:1.5-2.5，分别溶于蒸馏水，盐酸小檗碱与水的比例为1:40-60，富马酸与水的比例为1:5-6，70-90℃水浴加热溶解，将富马酸水溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中，搅拌加热反应3-5h，室温冷却后于0-5℃放置过夜，析出晶体，抽滤，用蒸馏水洗涤，于55-65℃干燥即得富马酸小檗碱，采用80%-90%的乙醇重结晶后得到小檗碱富马酸盐；

所述的小檗碱柠檬酸盐采用以下方法制备：1）盐酸小檗碱的提取和纯化：将干燥的黄柏粉碎成粗粉，每次用4-6倍量60%-80%的乙醇回流提取2-3次，每次1-3 h；抽滤，合并滤液，45-55℃下真空薄膜浓缩至无醇味，加入38%的浓盐酸调节pH值3-5，至盐酸黄连素沉淀析出，采用80%-90%的乙醇对盐酸黄连素进行重结晶，得到黄色针晶，即为盐酸小檗碱；2）取盐酸小檗碱和柠檬酸按质量比1:1.5-2.5，分别溶于蒸馏水，盐酸小檗碱与水的比例为1:40-50，柠檬酸与水的比例为1:5-6，在70-90℃水浴加热溶解，将柠檬酸水溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中，搅拌加热反应3-5h，室温冷却后于0-5℃ 放置过夜，析出晶体，抽滤，用蒸馏水洗涤，于55-65℃干燥即得柠檬酸小檗碱，采用80%-90%的乙醇重结晶后得到小檗碱柠檬酸盐；

所述的大黄总蒽醌苷采用以下方法制备：取通过20目的大黄粗粉，每次用5-8倍量的60%-80%乙醇在50-80℃条件下超声提取3次，每次1-2h，合并滤液，闪蒸浓缩至原体积的1/6-1/8，浓缩液无醇味，浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取液真空薄膜浓缩至浸膏，然后超声分散到适量水中，直至呈浓溶液，将样品通过Diaion HP-20 大孔吸附树脂柱色谱，分别用去离子水、10%MeOH、20%MeOH、40%MeOH、60%MeOH、70% Me₂CO依次洗脱，洗脱溶剂用量为柱体积的3-4倍量，分别收集洗脱液，将40%MeOH和60%MeOH洗脱液合并，真空薄膜浓缩并抽干，获得大黄总蒽醌苷干粉；

所述的黄芩总黄酮采用以下方法制备：取干燥粉碎成粗粉的黄芩，每次用50-80%的乙醇做溶剂在60-80℃水浴中超声提取2-3次，每次1-3h，抽滤，合并滤液，采用真空薄膜浓缩装置进行减压浓缩至原体积的1/6-1/8，浓缩液无醇味，浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取液真空薄膜浓缩至浸膏，改用旋转蒸发仪真空浓缩成干粉，得到黄芩总黄酮干粉。

2.如权利要求1所述的一种能提高小檗碱生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，其特征在于所述的火麻仁脂肪油采用以下方法制备：取干燥的火麻仁，采用压榨法得到火麻仁脂肪油。

3.如权利要求1所述的一种能提高小檗碱生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，其特征在于小檗碱富马酸盐、小檗碱柠檬酸盐、大黄总蒽醌苷、黄芩总黄酮、火麻仁脂肪油的重量比35-45:35-45:3.5-4.5:7-13:1.5-2.5。

4.如权利要求3所述的一种能提高小檗碱生物利用度及避免高氯血症的天然降糖剂，其特征在于小檗碱富马酸盐、小檗碱柠檬酸盐、大黄总蒽醌苷、黄芩总黄酮、火麻仁脂肪油的重量比40-42:40-42:4-4.3:10-12:2-2.3。