CN115025112B - 白芷多糖在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了白芷多糖在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的用途。本发明实验结果表明,白芷多糖能增加结肠炎小鼠的体重,降低结肠炎小鼠死亡率,改善结肠炎小鼠结肠腹泻、便血等疾病症状,维持小鼠结肠长度,改善结肠炎小鼠的结肠病理结构,缓解肠道炎症反应,可作为防治溃疡性结肠炎的潜在药物,为临床提供一种新的用药选择。
Description
技术领域
本发明属于制药领域,涉及白芷多糖在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的用途。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种以腹泻、黏液脓血便、腹痛等为主要临床症状的慢性非特异性肠道炎症性疾病。病变主要位于结肠的黏膜层和黏膜下层,病变呈连续性、弥漫性炎症改变。目前该病病因及发病机制尚不明确,涉及遗传、环境、免疫、肠道微生态失调等。溃疡性结肠炎的发病率逐年上升,已成为一种全球性疾病,其中,在北美、大洋洲和欧洲许多国家,炎症性肠病的患病率超过0.3%。自1990年以来,非洲、亚洲和南美洲的新兴工业化国家的发病率一直在上升,带来了巨大的疾病负担。
尽管目前用于治疗UC的药物种类繁多,包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂等,但常规治疗有其局限性和副作用,因此迫切需要一种安全有效的治疗UC的新药。
多糖(Polysaccharide)是由10个以上单糖通过糖苷键相互连接形成的一种大分子物质。研究表明,多糖在治疗糖尿病、肿瘤等疾病方面发挥重要作用。灵芝多糖可以抑制乳腺癌细胞的生长;黄芪多糖可以降低血糖水平,改善糖尿病控制;马齿苋多糖可通过激活巨噬细胞促进IL-10的分泌,并通过诱导型一氧化氮合酶刺激NO的产生;发菜多糖被报道具有恢复肠道菌群结构和抑制结肠癌的能力。近年来,多糖对UC的治疗作用成为研究的热点,包括果胶、鼠李糖半乳糖醛酸、壳聚糖、果聚糖、糖胺聚糖、藻类多糖、真菌和中药多糖等。多糖治疗UC的作用与调节炎性细胞因子、肠道菌群、免疫系统和保护肠粘膜有关。
白芷(Angelica dahurica)是伞形科植物杭白芷的根,具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓等功效,主要用于疮疡肿痛各类病症的治疗,也常被应用于UC的中医治疗。现代药理学研究表明,白芷具有解热、镇痛抗炎、抗肿瘤、抑制病原微生物、美白和抗皮肤氧化、调节中枢神经、改善血液流变、降血糖等多种作用。白芷中的主要药效成分为挥发油和香豆素类、生物碱类、多糖类、黄酮类等,目前针对白芷化学成分的研究多集中在挥发油类和香豆素类。白芷多糖也是白芷的有效成分之一,研究表明白芷多糖具有调节免疫等作用。目前白芷多糖在UC治疗中的作用及其机制尚不清楚,且其防治溃疡性结肠炎的应用尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供白芷多糖在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的用途。
为了解决上述技术问题,本发明公开了白芷多糖在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的用途。
其中,所述的白芷多糖是通过以下方法制得:
(1)取白芷,打粉,过筛,得到白芷粉末;
(2)将步骤(1)得到的白芷粉末依次用石油醚、乙醇进行脱脂,得到脱脂后白芷粉末;
(3)将步骤(2)得到的脱脂后白芷粉末用纯水提取,得到含粗白芷多糖的液体;
(4)将步骤(3)得到的含粗白芷多糖的液体进行浓缩,加入乙醇,沉淀,静置,固液分离,得到粗白芷多糖沉淀物;
(5)将步骤(4)得到的粗白芷多糖沉淀物用乙醇洗涤,干燥,即得。
具体地,步骤(1)中,所述的过筛,筛子为5号筛。
具体地,步骤(2)中,所述的石油醚脱脂,重复操作次数为2~3次,优选为2次,每次脱脂加入的石油醚与白芷的体积质量比为1.5~3:1mL/g,优选为2:1mL/g,每次加入石油醚后静置时间为12~30h,优选为24h;所述的乙醇脱脂,乙醇的浓度为95~100wt%,重复操作次数为2~3次,优选为2次,每次脱脂加入的乙醇与白芷的体积质量比为1.5~3:1mL/g,优选为2:1mL/g,每次加入乙醇后静置时间为12~30h,优选为24h。
具体地,步骤(3)中,所述的纯水提取,重复操作次数为2~3次,优选为3次,每次加入的纯水与白芷的体积质量比为3~8:1mL/g,优选为6:1mL/g,每次加入纯水后浸泡5~10h,优选为8h,再加热回流1~4h,优选为2h。
具体地,步骤(4)中,所述的乙醇,浓度为90~100wt%,优选为90wt%,用量为使体系中乙醇含量为75~90wt%,优选为80wt%;所述的静置,静置温度为4℃,静置时间为12h。
具体地,步骤(5)中,所述的乙醇,浓度为90~100wt%,优选为90wt%。
具体地,按照上述的白芷多糖制备工艺,1000g白芷可以制备得到350~450g白术多糖。
具体地,所述的白芷多糖与一种或多种药学上可接受的辅料组合制备成制剂。
进一步地,所述的辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋性剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂或增效剂。
进一步地,所述的制剂为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
其中,所述的药学上可接受的辅料,具有一定生理活性,但该成分的加入不会改变本发明药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位,而仅仅发挥辅助功效,这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用,是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用,仍然属于本发明保护的范围。
有益效果:
(1)本发明为临床治疗溃疡性结肠炎这一难治性疾病提供有效的治疗药物,且经济实用,临床应用前景广阔;其制备方法简单快速、高效,易于操作,提取的白芷多糖便于携带,方便服用。
(2)研究方法先进:本发明实验记录了小鼠体重变化、死亡率、结肠长度、血便情况及粪便性状变化,同时采用RT-QPCR、H&E染色等方法从多方面证实了肠道炎症及肠道病理结构用药物治疗后的改善程度。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明,本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为各组小鼠体重变化,其中Ctrl:空白组,DSS:模型组,DSS+RP-L:白芷多糖低剂量组,DSS+RP-H:白芷多糖高剂量组,*P<0.05;**P<0.01;
图2为各组小鼠存活率;
图3为各组小鼠结肠长度,其中Ctrl:空白组,DSS:模型组,DSS+RP-L:白芷多糖低剂量组,DSS+RP-H:白芷多糖高剂量组,**P<0.01;
图4为各组小鼠血便评分,其中Ctrl:空白组,DSS:模型组,DSS+RP-L:白芷多糖低剂量组,DSS+RP-H:白芷多糖高剂量组,##与Ctrl组比较P<0.01,*与DSS组比较P<0.05;
图5为各组小鼠粪便性状评分,其中Ctrl:空白组,DSS:模型组,DSS+RP-L:白芷多糖低剂量组,DSS+RP-H:白芷多糖高剂量组,##与Ctrl比较P<0.01,*与DSS组比较P<0.05;
图6为各组小鼠结肠组织H&E染色;
图7为各组小鼠结肠组织病理学评分,其中Ctrl:空白组,DSS:模型组,DSS+RP-L:白芷多糖低剂量组,DSS+RP-H:白芷多糖高剂量组,*P<0.05,**P<0.01;
图8为各组小鼠结肠组织炎症因子mRNA表达水平,其中Ctrl:空白组,DSS:模型组,DSS+RP-L:白芷多糖低剂量组,DSS+RP-H:白芷多糖高剂量组,*P<0.05,**P<0.01。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品,通过购买市售产品获得。
本发明具体实施方式中使用的实验动物为SPF级雄性C57BL/6J小鼠(20±2g)38只,购自浙江维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(浙)-2021-0006],饲养条件为温度20~26℃,相对湿度40%~60%,室内通风良好,每日光照10~12h,实验开始前将小鼠适应性饲养1周。
本发明具体实施方式中使用的造模药物为葡聚糖硫酸钠(DSS),购自MP公司,其分子量为36,000~50,000。
实施例1
白芷多糖的制备:取白芷1000g,打粉,过5号筛,得到白芷粉末;然后将白芷粉末用石油醚脱脂2次,每次加入石油醚2L后常温静置24h,倾去上清液,残留物置于托盘上,常温挥发干石油醚;复以乙醇(99.7wt%)继续脱脂2次,每次加入乙醇2L后常温静置12h,倾去上清液,残留物置于托盘上,常温挥发干乙醇。脱脂后的白芷样品中加入纯水(纯水与白芷的体积质量比为6:1mL/g),预先浸泡8h后,再加热回流2h,过滤,重复提取3次,合并提取液并离心去沉淀,上清液真空减压浓缩,得到含粗白芷多糖浓缩液。在含粗白芷多糖浓缩液中加入95wt%乙醇,使体系中乙醇含量为80wt%,搅拌沉淀,体系在4℃环境下静置12h后离心,得到粗白芷多糖沉淀物;最后,用90wt%乙醇洗涤粗白芷多糖沉淀物,干燥,得到364g白芷多糖。
实施例2
试验实施例1制备的白芷多糖对结肠炎的改善作用
(1)实验流程
将38只SPF级雄性C57BL/6J小鼠按体重随机分成4组:空白组(Ctrl,n=8)、模型组(DSS,n=10)、白芷多糖低剂量组(DSS+RP-L,n=10)、白芷多糖高剂量组(DSS+RP-H,n=10)。小鼠环境适应一周后,将实施例1制备的白芷多糖溶解于蒸馏水中。空白组正常饮水,其余组以自由饮用2.0wt%葡聚糖硫酸钠(DSS)7d后自由饮水14天为一个周期,重复3次,建立慢性结肠炎小鼠模型,每隔1天更换一次新鲜的DSS溶液。其中,白芷多糖低剂量组与高剂量组自造模后第一天起每日一次灌胃给予0.2mL不同浓度的白芷多糖溶液(DSS+RP-L给药浓度为50μg/mL,DSS+RP-H给药浓度为100μg/mL);模型组每日一次灌胃,给予0.2mL蒸馏水,连续63天。
从给药第一天开始,定点定时记录小鼠体重、粪便形态、粪便带血情况,并按参考文献标准(N.Tatiya-aphiradee,W.Chatuphonprasert,K.Jarukamjorn,EthanolicGarcinia mangostana extract and α-mangostin improve dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis via the suppression of inflammatory and oxidativeresponses in ICR mice[J].Journal of Ethnopharmacology,2021,265:113384.)对小鼠粪便性状、便血情况进行评分(粪便性状:正常,0分;松散2分,稀便4分;便血情况:正常,0分;隐血,2分;鲜血,4分)。给药63天后,将小鼠脱颈处死,取出结肠,以直尺量取结肠长度,磷酸缓冲盐溶液(KH2PO4 1440mg/L,NaCl 90000mg/L,Na2HPO4 7950mg/L,PH=7.4)去除结肠中粪便,4wt%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切成4μm切片,H&E染色,在光学显微镜观察结肠组织的病理变化。
病理学评分依据如下:
组织损伤评分:0,表皮细胞正常;1,杯状细胞部分丢失(小于或等于25%);2,杯状细胞大面积丢失(大于25%);3,隐窝丢失(小于或等于25%);4,隐窝大面积丢失(大于25%)。
炎症评分:由黏膜层,黏膜下层,黏膜肌层评分相加(0~6)。黏膜层:0,无炎症浸润;1,轻度炎症浸润;2,中度炎症;3,高度炎症。黏膜下层:0,无炎症浸润;1,轻至中度炎症浸润;2,高度炎症。两个因素之和(0~10)表示结肠组织的病理学评分。
所有数据均由GraphPad Prism 8.01进行统计。若数据符合正态分布,采用单因素方差(ANOVA)分析或t检验分析各组间的统计学差异。Kruskal Wallis检验用于分析不符合ANOVA假设的数据,结果以表示,P<0.05表示具有统计学意义。
(2)实验结果
(ⅰ)体重变化
如图1所示,Ctrl组小鼠体重平稳增长。DSS组:第一个循环:day 1~21小鼠体重有所增长,但增长幅度较DSS+RP-L和DSS+RP-H组小;第二个循环:day 22~28小鼠体重出现下降,day 29~42小鼠体重逐渐上升;第三个循环:day 43~49小鼠体重出现下降,day 50~63小鼠体重逐渐上升。DSS+RP-L和DSS+RP-H组:第一个循环:day 1~21两组小鼠体重均有所增长;第二个循环:day 22~28两组小鼠体重均出现下降,day 29~42两组小鼠体重逐渐上升;第三个循环:day 43~49两组小鼠体重出现下降,day 50~63两组小鼠体重逐渐上升。
第63天时,与Ctrl组相比,DSS组体重显著下降(P<0.01),DSS+RP-L和DSS+RP-H组体重无显著下降。与DSS组相比,DSS+RP-L组和DSS+RP-H组体重显著上升(P<0.05),差异有统计学意义。由此可见,白芷多糖对结肠炎模型小鼠的体重具有改善作用。
(ⅱ)死亡率
如图2所示,在小鼠死亡率方面,第一循环各组小鼠均未出现死亡,第二循环DSS组出现2只小鼠死亡,DSS+RP-L组出现1只小鼠死亡,DSS+RP-H组出现3只小鼠死亡。第三循环DSS组出现1只小鼠死亡,DSS+RP-L组未出现小鼠死亡,DSS+RP-H组小鼠未出现死亡。由此可见,白芷多糖可以降低结肠炎模型小鼠的死亡率。
(ⅲ)结肠长度
如图3所示,与Ctrl组相比,DSS组小鼠结肠长度显著下降(P<0.01),DSS+RP-L与DSS+RP-H组小鼠结肠长度无显著下降。与DSS组相比,DSS+RP-L组小鼠结肠长度较长(P<0.01),DSS+RP-H组小鼠结肠长度也较长(P<0.01),差异有统计学意义。由此可见,白芷多糖对结肠炎模型小鼠的结肠长度具有改善作用。
(ⅳ)血便评分
如图4所示,与Ctrl组相比,DSS组小鼠的血便评分显著升高(P<0.01);与DSS组相比,DSS+RP-L组小鼠的血便评分显著降低(P<0.05),DSS+RP-H组小鼠的血便评分显著降低(P<0.05),差异有统计学意义。由此可见,白芷多糖对结肠炎模型小鼠的血便情况具有改善作用。
(ⅴ)粪便性状评分
如图5所示,与Ctrl组相比,DSS组小鼠的粪便性状显著变软,粪便性状评分显著升高(P<0.01);与DSS组相比,DSS+RP-L组小鼠的粪便性状评分显著降低(P<0.05),DSS+RP-H组小鼠的粪便性状评分显著降低(P<0.05),差异有统计学意义。由此可见,白芷多糖对结肠炎模型小鼠的腹泻情况具有改善作用。
(ⅵ)结肠组织病理学观察
如图6所示,Ctrl组小鼠结肠上皮结构完整,隐窝形态正常,结肠细胞无坏死,无充血水肿;DSS组小鼠结肠上皮结构被破坏,隐窝形态不完整,部分肠段出现上皮细胞变性,坏死,炎性细胞浸润较重,结肠充血水肿;DSS+RP-L组小鼠结肠上皮结构部分破坏,隐窝形态较完整,粘膜层和粘膜下层炎性浸润较DSS组有所减轻;DSS+RP-H组小鼠结肠上皮结构部分破坏,隐窝形态较完整,粘膜层和粘膜下层炎性浸润较DSS组有所减轻,但较DSS+RP-L组严重。
如图7所示,DSS组病理评分明显高于正常组,DSS+RP-L和DSS+RP-H组相对DSS组病理评分减少(P<0.05),差异具有统计学意义。由此可见,白芷多糖对结肠炎模型小鼠的结肠病理情况具有改善作用。
(ⅶ)结肠组织炎症因子mRNA表达水平
如图8所示,与Ctrl组相比,模型组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平显著升高(P<0.01);与DSS组相比,DSS+RP-L组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平显著下降(P<0.01),DSS+RP-H组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平显著下降(P<0.05或P<0.01),差异有统计学意义。表明白芷多糖干预后小鼠炎症活动减轻,由此可见,白芷多糖具有缓解结肠炎模型小鼠炎症反应的作用。
综上所述,本发明提供了白芷多糖在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的用途,白芷多糖能增加结肠炎小鼠的体重,降低结肠炎小鼠死亡率,维持结肠炎小鼠结肠长度,改善结肠炎小鼠的便血情况、粪便形态,改善肠炎小鼠的结肠病理结构,缓解炎症反应,可作为防治溃疡性结肠炎的潜在药物,为临床提供一种新的用药选择。
本发明提供了白芷多糖在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的用途的思路及方法,具体实现该技术方案的方法和途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.白芷多糖作为活性物质在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的白芷多糖是通过以下方法制得:
(1)取白芷,打粉,过筛,得到白芷粉末;
(2)将步骤(1)得到的白芷粉末依次用石油醚、乙醇进行脱脂,得到脱脂后白芷粉末;
(3)将步骤(2)得到的脱脂后白芷粉末用纯水提取,得到含粗白芷多糖的液体;
(4)将步骤(3)得到的含粗白芷多糖的液体进行浓缩,加入乙醇,沉淀,静置,固液分离,得到粗白芷多糖沉淀物;
(5)将步骤(4)得到的粗白芷多糖沉淀物用乙醇洗涤,干燥,即得。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,步骤(1)中,所述的过筛,筛子为5号筛。
4.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,步骤(2)中,所述的石油醚脱脂,重复操作次数为2~3次,每次脱脂加入的石油醚与白芷的体积质量比为1.5~3:1 mL/g,每次加入石油醚后静置时间为12~30 h;所述的乙醇脱脂,乙醇的浓度为95~100 wt%,重复操作次数为2~3次,每次脱脂加入的乙醇与白芷的体积质量比为1.5~3:1 mL/g,每次加入乙醇后静置时间为12~30 h。
5.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,步骤(3)中,所述的纯水提取,重复操作次数为2~3次,每次加入的纯水与白芷的体积质量比为3~8:1 mL/g,每次加入纯水后浸泡5~10h,再加热回流1~4 h。
6.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,步骤(4)中,所述的乙醇,浓度为90~100wt%,用量为使体系中乙醇含量为75~90 wt%;所述的静置,静置温度为4℃,静置时间为12h。
7.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,步骤(5)中,所述的乙醇,浓度为90~100wt%。
8.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述的白芷多糖与一种或多种药学上可接受的辅料组合制备成制剂。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述的辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋性剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
10.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述的制剂为片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
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GR01 | Patent grant | ||
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