CN107021995B - 一种枸杞糖肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枸杞糖肽及其制备方法和应用。所述枸杞糖肽的分子量分布为1000‑10000Da部分占50‑85％，蛋白质含量为20‑35％，中性多糖含量为20‑35％，糖醛酸含量为5‑20％。本发明的制备方法以升温絮凝的方法去除部分不溶杂质，代替了传统提取方法中大量使用乙醇沉淀的步骤，提高了生产安全性，避免了回收乙醇的生产步骤，降低了生产成本，并且所得枸杞糖肽活性未发生改变，具有较好的生产推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药科技领域，具体地，涉及一种枸杞糖肽及其制备方法和在制备免疫增强药物或保健品中的应用。
背景技术
枸杞是茄科枸杞属植物枸杞的成熟果实，具有多种保健功效，是卫生部批准的药食两用食物。
枸杞的主要活性成分是枸杞糖肽。它是一种水溶性糖蛋白，现在已有很多研究表明枸杞糖肽具有促进免疫、抗衰老、抗肿瘤、清除自由基、抗疲劳、抗辐射、保肝、生殖功能保护和改善等作用。传统的枸杞糖肽的提取方法多采用高温煮提，而且文献多以sevage法脱蛋白，所以枸杞中存在的糖肽类成分被破坏，因此较少见诸报道。
在ZL 98111644.2中，袁晓振等报道了“枸杞糖肽及其生产工艺”,生产工艺包括浸泡提取、醇沉收集沉淀等步骤。醇沉提取多糖是一个较为常用的方法，但是乙醇在生产中存在防爆和溶剂回收的问题，因此如果能有新的简便环保的提取生产方法来取代醇沉操作具有很大应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的简便环保的枸杞糖肽提取生产方法来取代醇沉操作。
本发明的另一个目的是提供一种具有优异的药理活性的枸杞糖肽产品。
本发明的第一方面，提供了一种枸杞糖肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a).枸杞果实加水浸泡，离心去除沉淀，得到第一提取液；
(b).将第一提取液升温，提取液中不溶物团聚成沉淀，离心去除絮状沉淀，得到第二提取液；
(c).将第二提取液通过超滤膜分离，取截留溶液，并浓缩干燥，从而得到枸杞糖肽。
在另一优选例中，所述枸杞果实包括枸杞干果和枸杞鲜果。
在另一优选例中，枸杞果实浸泡前进行粉碎。
在另一优选例中，在步骤(a)中，使用去离子水浸泡。
在另一优选例中，所述第一提取液为浑浊的水提液。
在另一优选例中，所述第二提取液为澄清溶液。
在另一优选例中，所述第二提取液透光率大于60％。
在另一优选例中，在步骤(c)中，干燥方法包括冷冻干燥和喷雾干燥。
在另一优选例中，在步骤(c)中，用超滤膜分离时，不断向截留溶液中补入去离子水，当截留溶液的电导率降至1000us/cm以下，糖度降至1.2以下，收集截留溶液并浓缩干燥。
在另一优选例中，在步骤(a)中，枸杞果实与加水量的质量比为1：1-15，浸泡温度为10-35℃，浸泡时间为2-10小时。
在另一优选例中，枸杞干果与加水量的质量比为1：5～15。
在另一优选例中，枸杞鲜果与加水量的质量比为1：1～3。
在另一优选例中，在步骤(a)中，离心速度为1000-4000rpm，离心时间为10秒至1分钟。
在另一优选例中，在步骤(b)中，将第一提取液升温至45-70℃，保持时间为0.5-5小时。
在另一优选例中，在步骤(b)中，离心速度为6000-16000rpm，离心时间为5秒至5分钟。
在另一优选例中，在步骤(c)中，超滤膜的截留分子量范围为1000-2000Da。
本发明的第二方面，提供了一种枸杞糖肽，所述枸杞糖肽的分子量分布为1000-10000Da部分占50-85％；且所述枸杞糖肽中，蛋白质含量为20-35％，中性多糖含量为20-35％，糖醛酸含量为5-20％。
在另一优选例中，所述枸杞糖肽是由权利要求1-6任一项所述的方法制备。
本发明的第三方面，提供了一种如本发明第二方面所述的枸杞糖肽的用途，其特征在于，用于制备免疫增强药物或保健品。
本发明的第四方面，提供了一种枸杞糖肽制品，所述枸杞糖肽制品含有如本发明第二方面所述的枸杞糖肽。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
附图1为实施例1制备的枸杞糖肽HPLC紫外图谱。
附图2为实施例1制备的枸杞糖肽HPLC示差折光图谱。
附图3为实施例2制备的枸杞糖肽HPLC紫外图谱。
附图4为实施例2制备的枸杞糖肽HPLC示差折光图谱。
附图5为实施例3制备的枸杞糖肽HPLC紫外图谱。
附图6为实施例3制备的枸杞糖肽HPLC示差折光图谱。
附图7为实施例4制备的枸杞糖肽HPLC紫外图谱。
附图8为实施例4制备的枸杞糖肽HPLC示差折光图谱。
附图9为实施例5制备的枸杞糖肽HPLC紫外图谱。
附图10为实施例5制备的枸杞糖肽HPLC示差折光图谱。
附图11为实施例6制备的枸杞糖肽HPLC紫外图谱。
附图12为实施例6制备的枸杞糖肽HPLC示差折光图谱。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过长期广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，首次发现了一种提取分离枸杞糖肽的方法，该法在传统水提取方法的基础上，以升温法促成不溶物自身絮凝从而离心去除部分杂质，这样避免了大量使用乙醇带来的安全隐患和巨大的溶剂回收、环境污染等问题，大幅降低了生产成本，极大提高了生产安全性，提高了分子量1000-10000Da这部分的糖肽组分的占比，可提高最终糖肽产品的收率，而且获得的枸杞糖肽产品活性未发生改变。在此基础上完成了本发明。
本发明的主要优点包括：
1.本发明的生产方法以升温法促成不溶物自身絮凝从而离心去除部分杂质，这样避免了大量使用乙醇或其他有机溶剂带来的安全隐患和巨大的溶剂回收、环境污染等问题，大幅降低了生产成本，极大提高了生产安全性；
2.本发明的生产方法提高了分子量1000-10000Da这部分的糖肽组分的占比，可提高最终糖肽产品的收率，而且获得的枸杞糖肽产品活性未发生改变，因此具有较好的市场推广和应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
100g枸杞干果粉碎后加入15倍质量比的去离子水浸泡，浸泡温度10℃，浸泡时间10小时。浸泡液置于CR22G离心机中以1000rpm转速度离心1分钟，离心获得的上清液仍浑浊。将上清液置于水浴中升温至40℃并保持5小时，在上清液中残存的果肉果胶聚合成絮状沉淀，将此料液再置于CR22G离心机中以16000rpm转速度离心5秒钟，得到澄清溶液，透光率为83％。将所得澄清溶液置于超滤装置中超滤，超滤膜截留分子量1000Da，工作压力5公斤，不断向截留溶液中补入去离子水，当截留溶液的电导率降至500us/cm,糖度降至0.7，收集超滤膜截留的大分子部分的溶液，浓缩，冷冻干燥，获得枸杞糖肽0.85g。获得的枸杞糖肽经HPLC测定其中分子量1000-10000Da的部分占80％，凯氏定氮法测得蛋白含量35％，蒽酮硫酸法测得中性多糖含量20％，咔唑法测得糖醛酸含量20％，其HPLC图谱如附图1、2所示。
实施例2
100g枸杞干果粉碎加入10倍质量比的去离子水浸泡，浸泡温度20℃，浸泡时间5小时。浸泡液置于CR22G离心机中以4000rpm转速度离心10秒钟，离心获得的上清液仍浑浊。将上清液置于水浴中升温至60℃并保持2小时，上清液中残存的果肉果胶聚合成絮状沉淀，将此料液再置于CR22G离心机中以13000rpm速度离心5分钟，得到澄清溶液，透光率为78％。将所得澄清溶液置于超滤装置中超滤，超滤膜截留分子量1000Da，工作压力5公斤，不断向截留溶液中补入去离子水，当截留溶液的电导率降至900us/cm，糖度降至1.0，收集超滤膜截留的大分子部分的溶液，浓缩，冷冻干燥，获得枸杞糖肽1.1g。获得的枸杞糖肽经HPLC测定分子量1000-10000Da的部分占60％，凯氏定氮法测得蛋白含量30％，蒽酮硫酸法中性多糖含量25％，咔唑法测得糖醛酸含量10％，其HPLC图谱如附图3、4所示。
实施例3
100g枸杞干果粉碎加入5倍质量比的去离子水浸泡，浸泡温度30℃，浸泡时间2小时。浸泡液置于CR22G离心机中以3000rpm转速度离心1分钟，离心获得的上清液仍浑浊。将此上清液置于水浴中升温至70℃保持并0.5小时，上清液中残存的果肉果胶聚合成絮状沉淀，将此料液再置于CR22G离心机中以6000rpm转速分离5分钟，得到澄清溶液，透光率为60％。将所得澄清溶液置于超滤装置中超滤，超滤膜截留分子量2000Da，工作压力5公斤，不断向截留溶液中补入去离子水，当截留溶液的电导率降至300us/cm，糖度降至0.6，收集超滤膜截留的大分子部分的溶液，浓缩，冷冻干燥，得到枸杞糖肽0.8g。所获得的枸杞糖肽经HPLC测定分子量1000-10000Da的部分占85％，凯氏定氮法测得蛋白含量20％，蒽酮硫酸法中性多糖含量35％，咔唑法测得糖醛酸含量5％，其HPLC图谱如附图5、6所示。
实施例4
400g枸杞鲜果粉碎加入1倍质量比的去离子水浸泡，浸泡温度10℃，浸泡时间10小时。浸泡液置于CR22G离心机中4000rpm转离心1分钟，离心获得的上清液仍浑浊。置于水浴中升温至40℃并保持3小时，上清液中残存的果肉果胶聚合成絮状沉淀，将此料液再置于CR22G离心机中10000rpm转速分离0.5分钟，得到澄清溶液，透光率为67％。将所得澄清溶液置于超滤装置中超滤，超滤膜截留分子量1000Da，工作压力5公斤，不断向截留溶液中补入去离子水，当截留溶液的电导率降至1000us/cm，糖度降至1.2，收集超滤膜截留的大分子部分的溶液，浓缩，冷冻干燥，获得枸杞糖肽1.1g。所获得的枸杞糖肽经HPLC测定分子量1000-10000Da的部分占50％，凯氏定氮法测得蛋白含量20％，蒽酮硫酸法中性多糖含量35％，咔唑法测得糖醛酸含量10％，其HPLC图谱如附图7、8所示。
实施例5
400g枸杞鲜果粉碎加入2倍质量比的去离子水浸泡，浸泡温度20℃，浸泡时间5小时。浸泡液置于CR22G离心机中以1000rpm转速度离心1分钟，离心获得的上清液仍浑浊。将此上清液置于水浴中升温至50℃并保持1.5小时，上清液中残存的果肉果胶聚合成絮状沉淀，将此料液再置于CR22G离心机中以11000rpm转速度离心20秒钟，得到澄清溶液，透光率为73％。将所得澄清溶液置于超滤装置中超滤，超滤膜截留分子量2000Da，工作压力5公斤，不断向截留溶液中补入去离子水，当截留溶液的电导率降至900us/cm，糖度降至0.9，收集超滤膜截留的大分子部分的溶液，浓缩，冷冻干燥，获得枸杞糖肽1.0g。获得的枸杞糖肽经HPLC测定分子量1000-10000Da的部分占65％，凯氏定氮法测得蛋白含量30％，蒽酮硫酸法中性多糖含量25％，咔唑法测得糖醛酸含量15％，其HPLC图谱如附图9、10所示。
实施例6
400g枸杞鲜果粉碎加入5倍质量比的去离子水浸泡，浸泡温度35℃，浸泡时间2小时。浸泡液置于CR22G离心机中以3000rpm转速度离心1分钟，离心获得的上清液仍浑浊。将此上清液置于水浴中升温至70℃并保持0.5小时，上清液中残存的果肉果胶聚合成絮状沉淀，将此料液再置于CR22G离心机中以13000rpm转速度离心10秒钟，得到澄清溶液，透光率为90％。将所得澄清溶液置于超滤装置中超滤，超滤膜截留分子量1000Da，工作压力5公斤，不断向截留溶液中补入去离子水，当截留溶液的电导率降至900us/cm，糖度降至1.2，收集超滤膜截留的大分子部分的溶液，浓缩，冷冻干燥，获得枸杞糖肽1.05g。获得的枸杞糖肽经HPLC测定分子量1000-10000Da的部分占55％，凯氏定氮法测得蛋白含量25％，蒽酮硫酸法中性多糖含量30％，咔唑法测得糖醛酸含量15％，其HPLC图谱如附图11、12所示。
实施例7枸杞糖肽对T、B淋巴细胞增殖能力检测
正常Balb/c小鼠，随机分为正常对照组与样品干预组，每组10只。用纯水溶解待测样品，配制成所需干预浓度(2mg/kg)。样品干预组每天每只给予0.2ml待测样品灌胃，正常对照给予相同方式的等体积溶剂，连续干预9天。于样品干预终点，脱脊椎处死实验动物，取每只实验动物胸腺与脾脏。用纯水加干枸杞研碎，配置成所需浓度200mg/kg，生药对照组每天每只给予0.2ml待测样品灌胃。
水提醇沉枸杞糖肽参照黄琳娟等“枸杞子中免疫活性成份的分离纯化、及物理化学性质的研究”一文中方法制备，本方法枸杞糖肽收率0.8％，中性糖含量35％，糖醛酸含量5％，蛋白含量35％。
T、B淋巴细胞增殖能力检测：将每份细胞样品的细胞浓度调至4×106/ml。于96孔板中每孔加入100μl的细胞悬液，100μl的有丝分裂原(ConA或LPS)，总体积200μl。另设不加有丝分裂原对照细胞样本作为细胞增殖的本底对照。细胞于含5％CO2的37℃培养箱中培养48h，培养结束前12小时每孔加入20μl 3H-胸腺嘧啶核苷酸。测定时将标记的细胞样品用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta计数仪上读取掺入细胞DNA的3H-胸腺嘧啶核苷酸量，以cpm值代表细胞增殖的情况。
检测结果：
Mean±se，*p<0.05，***p<0.001
Mean±se，*p<0.05，***p<0.001
本发明所获得的枸杞糖肽与水提醇沉获得的枸杞糖肽相比较，中性糖的含量略低，但是糖醛酸的含量显著提高。
通过药理实验结果可知，在施用本发明的枸杞糖肽后，T细胞与B细胞的增值水平改变与对照组相比，差异具有显著性，提示本发明的枸杞糖肽与水提醇沉枸杞糖肽一样具有显著的免疫活性。
此外，本发明工艺减少了醇沉工艺，在工业化生产上更具操作性，防爆要求降低，工业三废减少，因而具有良好的产业化前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (16)
1.一种枸杞糖肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（a）枸杞果实加水浸泡，离心去除沉淀，得到第一提取液，其中，枸杞果实与加水量的质量比为1：1-15，浸泡温度为10-35℃，浸泡时间为2-10小时；（b）将第一提取液升温，提取液中不溶物团聚成沉淀，离心去除絮状沉淀，得到第二提取液，其中，将第一提取液升温至45-70℃，保持时间为0.5-5小时；（c）将第二提取液通过超滤膜分离，取截留溶液，并浓缩干燥，从而得到枸杞糖肽，其中，在步骤（c）中，超滤膜的截留分子量范围为1000-2000Da。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述枸杞果实包括枸杞干果和枸杞鲜果。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，枸杞果实浸泡前进行粉碎。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a）中，使用去离子水浸泡。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一提取液为浑浊的水提液。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二提取液为澄清溶液。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二提取液透光率大于60%。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（c）中，干燥方法包括冷冻干燥和喷雾干燥。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（c）中，用超滤膜分离时，不断向截留溶液中补入去离子水，当截留溶液的电导率降至1000us/cm以下，糖度降至1.2以下，收集截留溶液并浓缩干燥。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，枸杞干果与加水量的质量比为1：5～15。
11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，枸杞鲜果与加水量的质量比为1：1～3。
12.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a）中，离心速度为1000-4000rpm，离心时间为10秒至1分钟。
13.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b）中，离心速度为6000-16000rpm，离心时间为5秒至5分钟。
14.一种枸杞糖肽，其特征在于，所述枸杞糖肽的分子量分布为1000-10000Da部分占50-85%；且所述枸杞糖肽中，蛋白质含量为20-35%，中性多糖含量为20-35%，糖醛酸含量为5-20%,并且所述枸杞糖肽是由权利要求1-13任一项所述的方法制备。
15.如权利要求14所述的枸杞糖肽在制备免疫增强药物或保健品中的应用。
16.一种枸杞糖肽制品，其特征在于，所述枸杞糖肽制品含有如权利要求14所述的枸杞糖肽。
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