CN105232573A - 柴胡多糖在制备防治甲型流感与病毒肺炎的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属中药领域，具体涉及柴胡多糖在制备防治流感及病毒诱导急性肺损伤药物中的用途。本发明从中药柴胡中分离提取得到总多糖提取物，平均产物收率为3％，多糖含量超过65％。所述柴胡总多糖提取物经整体实验证实，对甲型流感病毒H3N2诱导的小鼠急性肺损伤有显著的治疗作用。柴胡多糖可能通过其抗炎机制，抑制致炎因子及趋化因子的释放及活化，促进抑炎因子的释放，抑制病毒的复制，减轻肺出血及肺水肿、从而减少急性肺损伤。可用于制备防治甲型流感与病毒性肺炎的药物。

Description

柴胡多糖在制备防治甲型流感与病毒肺炎的药物中的用途

技术领域

本发明属中药领域，涉及中药柴胡总多糖新的药用用途。具体涉及柴胡多糖在制备防治甲型流感与病毒肺炎的药物中的用途。

背景技术

病毒性肺炎(viralpneumonia)是由多种病毒感染而引起的肺部炎症，通常是由上呼吸道病毒感染向下蔓延所致。引起肺炎的病毒以流行性感冒病毒为常见，还包括副流感病毒，巨细胞病毒，腺病毒，鼻病毒，冠状病毒和某些肠道病毒等，也可导致病毒性肺炎。A型流感病毒是引起人和禽类呼吸道疾病的重要病原体。流感病毒侵入细支气管上皮引起细支气管炎，感染波及肺间质与肺泡而致肺炎。流感病毒一方面在呼吸道上皮细胞和血管内皮细胞内复制，损伤肺组织，破坏气体交换屏障；另一方面，通过巨噬细胞、分叶核中性粒细胞、淋巴细胞以及内皮细胞等释放大细胞因子，宿主免疫机制被过度激活并失控，导致急性肺损伤(孙婉容，吴琦，邵世峰.国际呼吸杂志，2011，14:1094-1096.)。在机体抗病毒感染免疫的过程中，早期起作用的是以巨噬细胞、干扰素和NK细胞为主的非特异性免疫，后期则是特异性的细胞免疫和体液免疫起作用。在流感病毒感染的过程中，单核/巨噬细胞活化产生多种细胞因子，他们以网络的形式在调节机体的免疫应答和炎症反应中起着重要作用(侯佩莉，张茂林，李影，关振宏.动物医学进展，2010,10：108-112.)。

病毒性肺炎主要病理改变是肺泡水平的气体交换障碍，病毒感染后所致的急性肺损伤(acutelunginjury,ALI)可引发患者出现呼吸窘迫和严重的低氧血症。研究表明单核细胞浸润、肺泡水肿是形成肺毛细血管通透性增高及肺水肿的病理基础，病毒感染诱发的肺损伤，临床表现为呼吸困难，严重的可以导致急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡。本发明观察柴胡多糖对病毒诱导的急性肺损伤小鼠的治疗作用。

柴胡为伞形科柴胡属(Bupleurum)植物。是我国的传统中药和常用中药，临床应用十分广泛。其性味苦凉，有疏散退热、疏肝解郁、升阳举气之功效(中华人民共和国卫生部药典委员会。中国药典。一部。北京：中国医药科技出版社,2010:263)，用于治疗寒热往来，胸满胁痛，口苦耳聋，头痛目眩等。早期的研究认为，柴胡的主要有效成分为柴胡皂苷和挥发油。药理学研究证明，柴胡具有解热、抗炎、镇痛、免疫增强、保肝利胆、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等作用(赵玉珍，陶上乘，王英华等.中药材，1998,21(6)：307-309)。在抗呼吸道病毒研究中，已发现柴胡提取物有抗柯萨奇病毒、冠状病毒的作用(ChengPW,ChiangLC,YenMH,LinCC.FoodChemToxicol.2007，45(1):24-31；ChengPW,NgLT,ChiangLC,LinCC.ClinExpPharmacolPhysiol.2006，33(7):612-616)；含柴胡的多味药水提物复方已证明具有显著的治疗流感病毒感染鼠的药效，降低死亡率。(赵萍。实用医技杂志，2007，14(16)：2155-2156)。柴胡单味药的提取物对流感病毒感染的宿主细胞能显著抑制的趋化因子的分泌，从而减轻对细胞的损伤。(WenS,HuifuX,HaoH.ImmunopharmacolImmunotoxicol.2011,33(3):433-437.)

近年来发现柴胡多糖在肺损伤、关节炎等炎性及自身免疫类疾病中发挥着很好的疗效，已证实柴胡总多糖对体液免疫应答和细胞免疫应答有调节作用，其作用特点与机体免疫功能状态及给药剂量有关。(王铮，程小芹等。中国临床药学杂志，2009，18(4)：200-204)。对LPS诱导的大鼠急性肺损伤有好的抗氧化作用。(林波，章蕴毅，徐晗，陈道峰。中国临床药学杂志。2010，1：6-11)能提高LPS诱导的肺损伤大鼠巨噬细胞活性，抑制炎症细胞因子的释放。(XiaoQinCheng,HongLi,XiLingYue.JournalofEthnopharmacology.2010.130:363–368)。以上研究均未涉及柴胡多糖对流感病毒、相关呼吸道病毒、及病毒诱导急性肺损伤的作用。

综观国内外的研究，均未柴胡多糖治疗流感及病毒诱导急性肺损伤的药效及其药物研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供柴胡总多糖在防治甲型流感与病毒性肺炎中新的药物用途。

本发明从中药柴胡中分离提取得到总多糖提取物，经整体动物模型试验证实其具有较强的治疗流感病毒诱导的急性肺损伤的作用。

本发明的柴胡总多糖通过下述方法制备：

取柴胡药材以95％乙醇冷浸提取，药渣于室温下置通风处晾干，用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以S三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80％，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖，产物收率达3％以上，多糖含量超过65％。

本发明中，所述的柴胡药材选自柴胡(BupleurumchinenseDC)，狭叶柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld)或小叶黑柴胡(Bupleurumsmithiivar.parvifoliumWolff)。

本发明的目的通过下述方法实现：

1.柴胡多糖用于治疗病毒诱导肺损伤试验：

1)肺指数

病毒感染第四天，动物称重，充分取血，解剖完整取下肺脏，将整个肺页置于滤纸，待滤纸吸干表面水分后称重，以此为肺湿重；计算肺指数，肺指数＝肺湿重(mg)/体重(g)。实验结果显示，与模型组相比，柴胡多糖40mg/kg可显著抑制小鼠肺指数的增高(P<0.01)。

2)肺总蛋白测定

整个全肺留取用于病理切片的肺叶后，其余部分的肺叶盐水漂洗，用适量冰浴的PBS匀浆，肺匀浆液分装，100ul肺匀浆液使用RIPA裂解法提取肺总蛋白，裂解液低温高速离心，收获上清分装，应用BCA法检测蛋白含量。牛血清白蛋白作为标准蛋白溶液，制作标准曲线。BCA工作液加入待测样品后，于自动酶标仪(Epoch,Bio-Tek)A562nm处读取吸收度(A)值。结果显示，与模型组相比，柴胡多糖可显著抑制小鼠肺总蛋白水平的升高(P<0.01),抑制病毒诱导后肺部对炎性蛋白的募集。

3)肺匀浆血凝效价测定

根据流感病毒上的血凝素HA能与鸡红细胞发生凝集反应的原理，来评价病毒的毒力强弱。取肺匀浆液，高速离心获得上清液，将等倍系列稀释的匀浆液与U型96孔板内1％鸡红血球混合，静置观察，记录发生鸡红细胞发生凝集的稀释度即血凝效价。实验结果显示，与模型组相比，20mg/kg和40mg/kg柴胡总多糖可显著抑制病毒感染鼠肺中血凝素的效价升高(P<0.05，P<0.01)。

4)小鼠血清TNF-α、RANTETS测定

小鼠全血离心获得血清，分装，冻存。应用ELISA法，将上清按TNF-α、RANTETS试剂盒说明书测定。结果显示，与模型组相比，20mg/kg和40mg/kg柴胡总多糖可显著降低小鼠血清中TNF-α、RANTETS炎性细胞因子的分泌增高(P<0.05)。

5)肺匀浆IL-6，IL-10测定

小鼠肺匀浆液，高速离心收获上清，分装，冻存。应用ELISA法，将匀浆上清按IL-6，IL-10试剂盒说明书测定。结果显示，与模型组相比，20mg/kg和40mg/kg柴胡总多糖可显著降低小鼠肺中促炎因子IL-6水平的升高(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，40mg/kg柴胡总多糖可显著增高小鼠肺中抑炎因子IL-10水平的升高(P<0.05)。

本发明实验结果揭示，柴胡总多糖对流感病毒诱导的急性肺损伤有显著治疗作用。柴胡多糖可显著降低肺指数(肺组织湿重/体重比值)、减少肺内总蛋白含量、抑制血清及肺内TNF-α、RANTETS、IL-6的释放、促进IL-10的分泌、显著抑制流感病毒在肺内的复制，从而减轻病毒感染造成的炎性损伤。研究结果表明，所述的柴胡多糖通过增强早期的固有免疫防御能力，通过抗炎机制，降低肺毛细血管通透性、减少淋巴细胞浸润及炎性蛋白的招募、抑制全身和肺部局部炎症反应，减少病毒感染诱发的急性肺损伤，可进一步制备防治甲型流感与病毒性肺炎的有效药物。

附图说明

图1柴胡多糖对H3N2病毒感染鼠肺病变的影响。

图2柴胡多糖对H3N2病毒感染鼠肺指数的影响。

图3柴胡多糖对H3N2病毒感染鼠肺总蛋白的影响。

图4柴胡多糖对H3N2病毒感染鼠肺血凝滴度的影响。

图5柴胡多糖对H3N2病毒感染鼠血清TNF-α的作用。

图6柴胡多糖对H3N2病毒感染鼠血清RANTETS的作用。

图7柴胡多糖对H3N2病毒感染鼠肺匀浆IL-6的作用。

图8柴胡多糖对H3N2病毒感染鼠肺匀浆IL-10的作用。

图9H3N2病毒感染鼠肺切片HE染色(×200)。

图10H3N2病毒感染鼠肺切片HE染色(×400)。

图11正常对照组小鼠肺切片HE染色(×400)。

图1240mg/kg柴胡多糖给药组小鼠肺切片HE染色(×400)。

图1320mg/kg柴胡多糖给药组小鼠肺切片HE染色(×200)。

具体实施方式

实施例1

取柴胡药材100g，以95％乙醇冷浸提取，药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以S三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80％，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖，产物收率达3％以上，多糖含量超过65％。

表1是柴胡总多糖收率及含量。

所述的柴胡药材选自柴胡(BupleurumchinenseDC)，狭叶柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld)或小叶黑柴胡(Bupleurumsmithiivar.parvifoliumWolff)。

表1

实施例2

KM小鼠24只(16-18g),按体重随机分为4组(A、B、C、D)：A组为正常对照组，B组为H3N2病毒模型组，C组为柴胡多糖组(40mg/kg)，D组为柴胡多糖20mg/kg，每组6只。除A组外的所有组动物经乙醚麻醉，滴鼻感染5LD₅₀H3N2病毒液30μL，A组滴鼻感染1640培养液30μL作为对照；C、D组感染H3N2后2小时灌胃给药，剂量分别为40mg/kg和20mg/kg；同时A组与B组给予0.5％CMC灌胃给药，作为正常和病毒对照。一天给药一次，连续给药四天。H3N2病毒攻击96h后，称量体重，摘眼球取血。小心剪下全肺，滤纸沾干血迹，称重记录；小心剪下右肺上叶置于10％福尔马林中；右肺中叶、下叶及左肺右肺下叶，用生理盐水漂洗干净，置于-80℃保存。冻存的肺组织之后使用预冷的PBS，用匀浆器在冰浴中匀浆，收获匀浆液，离心，收集上清，分装，-80℃保存。用于检测肺指数，肺总蛋白，血凝素(HA)滴度，肺炎性因子及趋化因子等指标。

Claims (2)

1.柴胡多糖在制备防治甲型流感药物中的用途；

所述的柴胡总多糖通过下述方法制备：

取柴胡药材以95％乙醇冷浸提取，药渣于室温下置通风处晾干，用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以S三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80％，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖，产物收率达3％以上，多糖含量超过65％；

所述的柴胡药材选自柴胡(BupleurumchinenseDC)，狭叶柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld)或小叶黑柴胡(Bupleurumsmithiivar.parvifoliumWolff)。

2.柴胡多糖在制备防治病毒性肺炎药物中的用途。