CN105311048B - 鱼腥草多糖在制备防治甲型流感与病毒性肺炎的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属中药领域，具体涉及鱼腥草多糖在制备防治流感及病毒性肺炎药物中的用途。本发明从中药鱼腥草中分离提取得到总多糖提取物，平均产物收率为3.65％，多糖含量超过70％。所述鱼腥草总多糖提取物经整体实验证实，对甲型流感病毒H3N2/H1N1两种病毒诱导的小鼠急性肺损伤有显著的治疗作用，其通过其抗炎机制，降低肺的毛细血管通透性、减轻肺水肿、抑制全身和肺部局部炎症反应，抑制炎症转录因子NFκB的表达，从而减少急性肺损伤。鱼腥草多糖可进一步用于制备防治流感及病毒性肺炎的药物。

Description

鱼腥草多糖在制备防治甲型流感与病毒性肺炎的药物中的 用途

技术领域

本发明属中药领域，涉及中药鱼腥草多糖新的药物用途。具体涉及鱼腥草多糖在制备防治甲型流感与病毒性肺炎的药物中的用途。

背景技术

研究报道，病毒性肺炎(viral pneumonia)是由多种病毒感染而引起的肺部炎症，通常是由上呼吸道病毒感染向下蔓延所致。引起肺炎的病毒以流感病毒为常见，还包括副流感病毒，巨细胞病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒和某些肠道病毒等也可导致病毒性肺炎。甲型流感病毒是引起人和禽类呼吸道疾病的重要病原体。流感病毒侵入细支气管上皮引起细支气管炎，感染波及肺间质与肺泡而致肺炎。流感病毒一方面在呼吸道上皮细胞和血管内皮细胞内复制，损伤肺组织，破坏气体交换屏障；另一方面，通过巨噬细胞、分叶核中性粒细胞、淋巴细胞以及内皮细胞等释放大量细胞因子，宿主免疫机制被过度激活并失控，导致急性肺损伤(孙婉容，吴琦，邵世峰.国际呼吸杂志，2011，14:1094-1096)。在机体抗病毒感染免疫的过程中，早期起作用的是以巨噬细胞、干扰素和NK细胞为主的非特异性免疫，后期则是特异性的细胞免疫和体液免疫起作用。在流感病毒感染的过程中，单核/巨噬细胞活化产生多种细胞因子，以网络的形式在调节机体的免疫应答和炎症反应中起着重要作用(侯佩莉，张茂林，李影，关振宏.动物医学进展，2010,10：108-112)。

病毒性肺炎主要病理改变是肺泡水平的气体交换障碍，病毒感染后所致的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)可引发患者出现呼吸窘迫和严重的低氧血症。研究表明单核细胞浸润、肺泡水肿是形成肺毛细血管通透性增高及肺水肿的病理基础，病毒感染诱发的肺损伤，临床表现为呼吸困难，严重的可以导致急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡。本发明证实了鱼腥草多糖对甲型流感病毒诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用。

鱼腥草是我国的常用中药，临床应用十分广泛。鱼腥草(Herba Houttuyniae)为三白科植物蕺茶属蕺菜(Houttuynia cordata)的全草。性味辛、寒，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋之功效，主要应用于肿痈化脓、痰热喘咳、热痢热淋、痈肿疮毒等(中国药典一部。北京：中国医药科技出版社,2010)。文献报道，鱼腥草全株均有一定的抑菌作用，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌(王健，史玉，张永泽等.河北工程大学学报(自然科学版)，2010，2：104-106)；鱼腥草挥发油对流感病毒有抑制作用(杨慧，李剑琦，杨斌等.江西医药，2006，12：960-961)；鱼腥草注射液(全草水提物)肌注能明显降低甲型流感病毒H1N1感染小鼠死亡率，降低肺指数和抑制肺内增殖作用(刘方舟，时瀚，时宇静等.药学学报，2010,3：399-402)；鱼腥草全草也可以抗单纯疱疹病毒(HSV)、SARS病毒(ChenX,WangZ,YangZetal.AntiviralRes.2011,2:341-345；LauKM,Lee KM,Koon CMetal.JEthnopharmacol.2008，118(1):79-85.)。以上研究均未涉及鱼腥草多糖对病毒诱导急性肺损伤的防治作用。

综观国内外的研究，均未见报道鱼腥草多糖治疗病毒诱导急性肺损伤的药效及其药物研究。

本申请的发明人拟提供中药鱼腥草多糖新的药物用途，尤其是鱼腥草多糖在制备防治甲型流感与病毒性肺炎的药物中的用途。

发明内容

本发明的目的是提供鱼腥草总多糖在制备抗流感和病毒性肺炎药物中新的药物用途。

本发明从中药鱼腥草中分离提取得到总多糖提取物。所述总多糖提取物经整体动物模型试验证实，其针对H1N1、H3N2两种甲型流感病毒毒株，具有显著治疗流感病毒诱导的急性肺损伤作用。

本发明的鱼腥草总多糖通过下述方法制备：

取鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)药材，粉碎，以95％乙醇冷浸提取3次，药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水提取3次，过滤，合并提取液，浓缩，离心，上清液以三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80％，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖，产物收率达3％以上；采用硫酸-苯酚法测得鱼腥草总多糖的糖含量超过70％；采用间羟联苯法测得鱼腥草总多糖的糖醛酸含量超过25％；采用考马斯亮蓝法测得鱼腥草总多糖的蛋白质含量不超过10％；

本发明的鱼腥草总多糖进行了如下整体动物模型试验，尤其是针对H1N1、H3N2两种甲型流感病毒毒株的试验：

1、鱼腥草多糖用于治疗H3N2甲型流感病毒诱导急性肺损伤试验：

选用KM小鼠，以H3N2甲型流感病毒滴鼻感染，建立流感病毒诱导的急性肺损伤模型。鱼腥草多糖灌胃给药，96h后观察动物肺炎性病变程度及炎性细胞因子指标。结果证实口服鱼腥草总多糖后，对H3N2流感病毒诱导急性小鼠肺损伤有显著的保护作用。

2、鱼腥草多糖对重症H1N1甲型流感病毒感染鼠的生存保护试验：

选用BALB/C小鼠，以H1N1甲型流感病毒滴鼻感染，建立流感病毒诱导重症肺损伤模型，给药7天，停药观察7天，观察本发明药物对重症流感感染鼠的14天观察期的生命保护作用。结果证实口服鱼腥草总多糖后，能提高重症流感病毒感染鼠的生命率，具有生命保护作用。

3、鱼腥草多糖用于治疗H1N1甲型流感病毒诱导急性肺损伤试验：

选用BALB/C小鼠，以H1N1甲型流感病毒滴鼻感染，建立流感病毒诱导的急性肺损伤模型。鱼腥草多糖灌胃给药，96h后观察动物肺炎性损伤程度及干扰素、炎性细胞因子、趋化因子，NFκB蛋白表达等指标。结果证实口服鱼腥草总多糖后，对H1N1流感病毒诱导急性小鼠肺损伤有显著的保护作用。

4、鱼腥草多糖对病毒诱导鼠肺急性损伤的抗炎相关研究指标检测方法

1)肺指数

病毒感染第四天，动物称重，充分取血，解剖完整取下肺脏，将整个肺页置于滤纸，待滤纸吸干表面水分后称重，以此为肺湿重；计算肺指数，肺指数＝肺湿重(mg)/体重(g)。实验结果显示，与模型组相比，鱼腥草多糖40mg/kg可显著抑制小鼠肺指数的增高(P<0.01)。

2)肺总蛋白测定

整个全肺留取用于病理切片的肺叶后，其余部分的肺叶盐水漂洗，用适量冰浴的PBS匀浆，肺匀浆液分装，100ul肺匀浆液使用RIPA裂解法提取肺总蛋白，裂解液低温高速离心，收获上清分装，应用BCA法检测蛋白含量。牛血清白蛋白作为标准蛋白溶液，制作标准曲线。BCA工作液加入待测样品后，于自动酶标仪(Epoch,Bio-Tek)A562nm处读取吸收度(A)值。结果显示，与模型组相比，鱼腥草多糖可显著抑制小鼠肺总蛋白水平的升高(P<0.01),抑制病毒诱导后肺部对炎性蛋白的募集。

3)肺匀浆血凝效价测定

根据流感病毒上的血凝素HA能与鸡红细胞发生凝集反应的原理，来评价病毒毒力的强弱。取肺匀浆液，高速离心获得上清液，将等倍系列稀释的匀浆液与U型96孔板内1％鸡红血球混合，静置观察，记录发生鸡红细胞发生凝集的稀释度即该肺组织匀浆的血凝效价。实验结果显示，与模型组相比，20mg/kg和40mg/kg鱼腥草总多糖可显著抑制病毒感染鼠肺中血凝素的效价升高(P<0.05，P<0.01)，即能有效抑制病毒在鼠肺中的复制。

4)小鼠血清TNF-α、RANTETS测定

小鼠全血离心获得血清，分装，冻存。应用ELISA法，将上清按TNF-α、RANTETS试剂盒说明书测定。结果显示，与模型组相比，20mg/kg和40mg/kg鱼腥草总多糖可显著抑制小鼠血清中TNF-α、RANTETS炎性细胞因子的分泌(P<0.05)。

5)肺匀浆IFN-α、IL-1、TNF-α、RANTETS、MCP-1、MIP-1α、IL-6、IL-10测定

小鼠肺匀浆液，高速离心收获上清，分装，冻存。应用ELISA法，将匀浆上清按IFN-α、IL-1、TNF-α、RANTETS、MCP-1、MIP-1α、IL-6、IL-10试剂盒说明书测定。结果显示，与模型组相比，20mg/kg和40mg/kg柴胡总多糖可显著降低小鼠肺中干扰素/促炎因子/趋化因子IFN-α、IL-1、TNF-α、RANTETS、MCP-1、MIP-1α、IL-6、IL-10水平的升高(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，40mg/kg鱼腥草总多糖可显著增高小鼠肺中抑炎因子IL-10水平的升高(P<0.05)。

6)肺组织NFkB蛋白表达的检测

将切好的4um厚的肺组织白片放在玻片架上置于烘箱烘烤30分钟，脱蜡入水，将玻片架用0.01M的PBS浸泡5分钟，然后放在97℃水浴加热的EDTA抗原修复液PH8.0里进行抗原修复12分钟，将放置室温的玻片用PBS浸泡5分钟，然后放入PBS浸泡5分钟，之后3％H₂O₂的甲醇溶液中10分钟。将玻片架放置在PBS浸泡5分钟，反复3次，然后将玻片上过多的水分用吸水纸擦去，加100ul的血清37℃孵育30分钟。擦去过多的血清，加入磷酸化NFkB一抗4℃孵育过夜。室温复温45分钟，然后用PBS浸泡5分钟，反复3次，再滴加HRP标记的二抗，37℃孵育30分钟。用PBS清洗5分钟，反复3次，滴加DAB显色，再用苏木素复染30-45秒。自来水冲洗后，然后用0.5％-1％的盐酸酒精分化1-2秒，迅速放置流水里冲洗。将玻片架分别放在70％酒精，80％酒精，90％酒精，100％酒精；二甲苯，二甲苯，二甲苯；用中性树胶封片。镜下观察结果，甲型流感病毒感染可以导致p-NFkB大量的表达，口服鱼腥草多糖能显著抑制炎性转录因子的表达。

本发明实验结果显示，所述的鱼腥草总多糖对流感病毒H1N1和H3N2两种病毒株诱导的急性肺损伤均有显著治疗作用；鱼腥草多糖可显著提高重症流感病毒感染小鼠的生存率，降低肺指数(肺组织湿重/体重比值)和血凝素效价、减少肺内总蛋白含量、抑制血清及肺内干扰素、细胞因子、趋化因子(包括IFN-α、IL-1、TNF-α、RANTETS、MCP-1、MIP-1α、IL-6)的释放、促进IL-10的分泌，并且抑制炎症核转录因子NFκB的表达。

本发明所述的鱼腥草多糖能抑制流感病毒在鼠肺内的复制，从而减轻病毒感染造成的炎性免疫损伤；其保护病毒诱导肺损伤的作用是通过其抗炎机制，来降低肺毛细血管通透性、减少淋巴细胞浸润及炎性蛋白的招募、抑制全身和肺部局部炎症反应。

本发明所述的鱼腥草多糖可进一步制备防治流感和病毒性肺炎的药物。

附图说明

图1鱼腥草多糖对H3N2病毒感染鼠肺病变的影响。

图2鱼腥草多糖对H3N2病毒感染鼠肺指数的影响。

图3鱼腥草多糖对H3N2病毒感染鼠肺总蛋白的影响。

图4鱼腥草多糖对H3N2病毒感染鼠肺血凝滴度的影响。

图5鱼腥草多糖对H3N2病毒感染鼠血清TNF-α的作用。

图6鱼腥草多糖对H3N2病毒感染鼠血清RANTETS的作用。

图7鱼腥草多糖对H3N2病毒感染鼠肺匀浆IL-6的作用。

图8鱼腥草多糖对H3N2病毒感染鼠肺匀浆IL-10的作用。

图9 H3N2病毒感染鼠肺切片HE染色(×200)。

图10 H3N2病毒感染鼠肺切片HE染色(×400)。

图11正常对照组小鼠肺切片HE染色(×400)。

图12 40mg/kg鱼腥草多糖给药组小鼠肺切片HE染色(×400)。

图13 20mg/kg鱼腥草多糖给药组小鼠肺切片HE染色(×200)。

图14鱼腥草多糖对H1N1病毒感染鼠的生存保护作用。

图15鱼腥草多糖对H1N1病毒感染鼠肺匀浆细胞因子的抑制作用。

图16鱼腥草多糖对H1N1病毒感染鼠肺匀浆趋化因子的抑制作用。

图17鱼腥草多糖对H1N1病毒感染鼠肺NFκB表达的抑制作用。

具体实施方式

实施例1

取鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)药材100g，粉碎，以95％乙醇冷浸提取3次，药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水提取3次，过滤，合并提取液，浓缩，离心，上清液以三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80％，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖，产物收率达3％以上。采用硫酸-苯酚法测得鱼腥草总多糖的糖含量超过70％；采用间羟联苯法测得鱼腥草总多糖的糖醛酸含量超过25％；采用考马斯亮蓝法测得鱼腥草总多糖的蛋白质含量不超过10％，结果如表1所示。

表1 三批鱼腥草多糖的收率及含量

实施例2

KM小鼠24只(16-18g),按体重随机分为4组(A、B、C、D)：A组为正常对照组，B组为H3N2病毒模型组，C组为鱼腥草多糖组(40mg/kg)，D组为鱼腥草多糖20mg/kg，每组6只。除A组外的所有组动物经乙醚麻醉，滴鼻感染5LD₅₀H3N2病毒液30μL，A组滴鼻感染1640培养液30μL作为对照；C、D组感染H3N2后2小时灌胃给药，剂量分别为40mg/kg和20mg/kg；同时A组与B组给予0.5％CMC灌胃给药，作为正常和病毒对照。一天给药一次，连续给药四天。H3N2病毒攻击96h后，称量体重，摘眼球取血。小心剪下全肺，滤纸沾干血迹，称重记录；小心剪下右肺上叶置于10％福尔马林中；右肺中叶、下叶及左肺右肺下叶，用生理盐水漂洗干净，置于-80℃保存，冻存的肺组织之后使用预冷的PBS，用匀浆器在冰浴中匀浆，收获匀浆液，离心，收集上清，分装，-80℃保存，用于检测肺指数，肺总蛋白，血凝素(HA)滴度，肺炎性因子及趋化因子等指标。

实施例3

BALB/C小鼠75只(16-18g),按体重随机分为5组(A、B、C、D，E)：A组为正常对照组，B组为H1N1病毒模型组，C组为鱼腥草多糖组(40mg/kg)，D组为鱼腥草多糖20mg/kg，E组为利巴韦林100mg/kg，每组15只。除A组外的所有组动物经乙醚麻醉，滴鼻感染10LD₅₀H1N1病毒液30μL，A组滴鼻感染1640培养液30μL作为对照；C、D、E组感染H1N1后2小时灌胃给药，剂量分别为鱼腥草多糖40mg/kg、20mg/kg和利巴韦林100mg/kg；同时A组与B组给予0.5％CMC灌胃给药，作为正常和病毒对照。一天给药一次，连续给药七天，停药观察到14天，每天记录动物的存活数量及死亡数，计算药物对重症流感感染鼠的生命保护率。

实施例4

BALB/C小鼠40只(16-18g)，实验分组、感染剂量及给药方案同实施例3。除A组外的所有组动物经乙醚麻醉，滴鼻感染10LD₅₀H1N1病毒液30μL，C、D、E组感染H1N1后2小时灌胃给药，剂量分别为鱼腥草多糖40mg/kg、20mg/kg和利巴韦林100mg/kg；同时A组与B组给予0.5％CMC灌胃给药。一天给药一次，连续给药四天。H1N1病毒攻击96h后，称量体重，摘眼球取血。小心剪下全肺，滤纸沾干血迹，称重记录；小心剪下右肺上叶置于10％福尔马林中；右肺中叶、下叶及左肺右肺下叶，用生理盐水漂洗干净，置于-80℃保存。冻存的肺组织之后使用预冷的PBS，用匀浆器在冰浴中匀浆，收获匀浆液，离心，收集上清，分装，-80℃保存，用于检测干扰素、炎性细胞因子及趋化因子等指标。

Claims (1)

1.鱼腥草多糖作为唯一活性成分在制备治疗流感病毒H3N2病毒株诱导的急性肺损伤药物中的用途，所述的鱼腥草多糖中的糖含量超过70%；糖醛酸含量超过25%；蛋白质含量不超过10%。