CN101669980B

CN101669980B - 从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷及总黄酮的方法

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Publication number: CN101669980B
Application number: CN2008101968902A
Authority: CN
Inventors: 杨跃军; 赵国锋; 刘源才; 陈凯
Original assignee: Jing Brand Co Ltd
Current assignee: Jingpai Zhengtang Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2008-09-09
Filing date: 2008-09-09
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2028-09-09
Also published as: CN101669980A

Abstract

一种从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷及总黄酮的方法，包括以下步骤：先以20-40％乙醇作为溶剂逆流提取，提取液离心分离，分离液分别以微滤膜除沉过滤和超滤膜分离，再以纳滤膜处理，得截留液；将此截留液干燥，干燥温度60℃以下，干燥物水份≤5.0％，干燥物即为淫羊藿有效成分富集物，其中淫羊藿苷含量达到60％以上，淫羊藿总黄酮含量达到80％以上，膜分离各单元淫羊藿苷、淫羊藿黄酮转移率≥98％；本发明①采用多罐逆流提取代替传统的浸渍和热回流，有效地缩短了提取时间，减少了溶剂用量，提高了提取效率，②采用膜技术对淫羊藿提取物进行分离纯化，提高了目标成分淫羊藿苷、总黄酮的含量及转移率；③采用纳滤膜浓缩，减少了浓缩时间和有效成分损失，降低了能耗。

Description

从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷及总黄酮的方法

(一)技术领域本发明涉及一种中药活性成分的提取分离方法，尤其是一种从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷及总黄酮的方法。

(二)现有技术淫羊藿(Herba Ep imdii)为小檗科植物，又名三枝九叶草等，在《神农本草经》中列为中品。淫羊藿是拥有悠久历史的传统中药，临床上具有多种药理作用。淫羊藿总黄酮(TFE)对肾上腺素受体有阻断作用，TFE可选择性地阻断离体及整体动物心肌β1受体，在离体心肌上呈竞争性的拮抗作用；而对气管β2受体和心肌平滑肌α受体没有阻断作用。说明TFE是一种选择性肾上腺素β1受体阻断剂。淫羊藿苷具有良好的心脑血管活性，可以直接扩张脑血管，增加脑血流量，降低脑血管阻力，其机制是抑制血管平滑肌的二价钙离子内流。淫羊藿苷(ICA)可以显著降低卒中易感型自发性高血压大鼠的死亡率，并能抑制其血压升高。因此淫羊藿苷与总黄酮在今后治疗与预防心脑血管疾病方面有着巨大的市场潜力。

当前，国内外淫羊藿苷和总黄酮的提取分离工艺主要有①水提醇沉，树脂分离纯化；②有机溶媒萃取，大孔树脂分离纯化。但前者存在活性成分转移率低，能耗高，生产周期长等问题；后者有机溶媒使用量大对环境污染严重。

(三)发明内容本发明的目的就是提供一种从淫羊藿中分离纯化淫羊藿苷及及总黄酮的方法。该方法富集的产物中淫羊藿苷含量达到60％以上，淫羊藿总黄酮含量达到80％以上，收率高，生产周期短，能耗低，环境污染小。

本发明包括如下步骤：

1、先将淫羊藿药材加至逆流提取罐内，再将20-40％乙醇缓慢倒入提取罐中，乙醇用量为淫羊藿重量的10-30倍，提取2-3次，每次1-1.5小时；每次按5L/kg药材量添加新的溶剂；

2、合并上述数次提取液，以离心机分离；收集上清液；

3、以孔径为0.02-0.1μm的微滤膜过滤，跨膜压力为0.1-0.3Mpa，料液温度为30-60度，得透过液；

4、将所得透过液通过截留分子量为1000-50000的超滤膜过滤，跨膜压力0.5-1Mpa，料液温度30--50℃，得超滤液；

5、将所得超滤液以截留分子量为200-500的纳滤膜处理，跨膜压力为1—2Mpa，料液温度30--50℃，得截留液；

6、将截留液干燥，干燥温度60℃以下，干燥物水份≤5.0％，干燥物即为淫羊藿有效成分富集物。

所述离心机为碟式离心机，转速6000-20000转/分；

所述微滤膜为氧化铝陶瓷膜；

所述超滤膜为聚醚砜超滤膜；

所述纳滤膜为聚砜类有机复合膜；

所述干燥方法为喷雾干燥、冷冻干燥、微波真空低温干燥或带式真空减压干燥中的一种。

本发明中所用的淫羊藿，包括朝鲜淫羊藿EpimediumkoreanumNakai.、巫山淫羊藿E.wushanenseT.S.Ying、小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.、箭叶淫羊藿E.sagittatmn(Sieb.etZucc.)Maxim、柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim.的干燥地上部分。

所得产物指标

产品含量：淫羊藿苷达到60％以上，淫羊藿总黄酮达到80％以上。

产品色泽：黄褐色，无杂质色泽。

产品香气：具有本品特有的气味，无明显的异味。

产品形状：疏松粉末状

产品水分：≤5.0％按照GB/T14769执行。

产品灰分：≤5.0％按照GB/T14770执行。

粗细度(80目通过率)：≥95％

检测方法来源于中国药典2005版1部

淫羊藿总黄酮的含量测定方法

1、供试品溶液的制备

准确称取80℃烘至恒重的淫羊藿苷适量，加甲醇溶解，定量转移到10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2、对照品溶液的制备

精密称取105℃干燥至恒重的淫羊藿苷标准品5mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容到刻度，摇匀，精密吸取5mL至100mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，摇匀后得对照品溶液(淫羊藿苷25ug/mL)。

3、标准曲线的制备：

精密吸取对照品溶液0、2、4、6、8、10mL，分别置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，在270nm波长处测定吸光度。以浓度(C)和吸光度(A)进行直线回归：

C＝0.36164+26.2092A

R²＝0.99902

浓度(C)与吸光度(A)在0～25ug/mL范围内呈线性关系。

4、含量测定

精密吸取样品溶液1mL于蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，滤入25mL容量瓶中，用甲醇多次洗涤滤纸，滤入容量瓶，用甲醇定容摇匀，在270nm波长处测定吸光度，按回归方程计算总黄酮含量。

淫羊藿苷HPLC含量测定方法

操作步骤

1、供试品溶液的制备

准确称取80℃烘至恒重的淫羊藿提取物适量，用50％甲醇超声溶解，定容至10mL，静置，0.45um微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2、对照品溶液的制备

精密称取淫羊藿苷对照品2.0mg，用50％甲醇超声溶解定容至10mL，精密吸取50uL，用50％甲醇稀释定容至2mL，作为对照品溶液。

3、色谱条件

varian prostar-230型HPLC仪；Kromasil C18柱(ID4.6×150mm，5um)；柱温：30℃；流动相：甲醇/水＝57/43；流速：0.8mL/min；prostar-330DAD，检测波长：270nm

4、含量测定

对照品溶液进样20uL，记录结果。供试品溶液进样20uL，记录结果，根据对照品结果计算含量。

应用本发明方法提取富集淫羊藿有效成分主要具有以下优越性：

1、本发明采用多罐逆流提取代替传统的浸渍和热回流，有效地缩短了提取时间，减少了溶剂用量，提高了提取效率。

2、本发明采用膜技术对淫羊藿提取物进行分离纯化，提高了目标成分淫羊藿苷、总黄酮的含量及转移率；有效成分淫羊藿苷、总黄酮得到保留，去除了大部分无效成分，产品的活性成分得到了有效富集；

3、本发明的微滤膜分离系统代替了传统的醇沉工艺，提高有效成分的收率，可节约大量的乙醇，降低了使用乙醇导致的安全风险和生产成本的增高，同时还能减少乙醇回收所需的能耗，进而缩短生产周期；

4、本发明的纳滤膜分离系统在截留目标物质的同时，也是一个低温无相变的浓缩过程，减少了有效成分损失及浓缩时间，降低了能耗；

5、本发明对分离目标成分具有较高的选择性，可根据市场对产品的要求，改变微滤膜和超滤、纳滤膜的规格和操作条件，从而很方便地控制所得产品的目标物质组成。

6、本发明采用微波真空干燥，微波能与真空技术相结合，使物料干燥速度快、受热均匀。水份很快排出。干燥温度低，速度快，质量高，有效成分能更多的保留下来。

综上所述，用本发明的方法从淫羊藿中分离纯化淫羊藿苷，有效成分损失少，产品转移率高。产物中淫羊藿苷含量达到60％以上，淫羊藿总黄酮含量达到80％以上。活性成分得到有效富集。在不改变有效成分结构的前提下，大大缩短了生产周期，降低了能耗和生产陈本，产品质量得到大幅度提高。

为进一步说明本发明的效果，特将有关提取方法、纯化方法、浓缩方法等方面所作的实验情况对比如下：

一、逆流提取与热回流提取比较

1、20kg淫羊藿药材经前处理加工后为提取原料；

2、取其中的10kg淫羊藿作为热回流提取原料，用20倍量30％酒精进行热回流提取，每次2小时共提取三次。

3、另10kg淫羊藿作为三罐逆流提取原料，用35倍量的30％酒精逆流提取，每次1.5小时，共提取三次。

4、不同提取方法比较

热回流提取与三罐逆流提取数据如下表：

可见逆流提取具有提取温度低，提取时间短，溶剂用量少的优点，并且有效成分提取转移率高。

二、大孔树脂与膜纯化有效成分比较

1、大孔树脂纯化淫羊藿提取物

1.1、取10kg淫羊藿药材进行逆流提取。

1.2、对提取液进行双效蒸发浓缩，浓缩倍数10-20倍。

1.3、将浓缩后的提取液进行离心，转速控制在7302r/min，离心45min，收集上清液。

1.4、离心液上AB-8型大孔树脂。上柱速度1-2BV/h。待处理液液面与树脂面接近时停止，预吸附2小时。

1.5、水洗：缓缓加入去离子水，以2BV/h的流速洗脱杂质，用水量为15倍柱体积。

1.6、解吸附：用5BV的70％的乙醇，以2.5BV/h的流速洗脱，收集洗脱液。

1.7、洗脱液用球形浓缩成干燥物，测定含量。

2、膜分离纯化淫羊藿提取物

2.1、取10kg淫羊藿药材进行逆流提取。

2.2、提取液用蝶式离心机进行离心，转速控制在7302r/min，离心40min。

2.3、离心液用0.05um陶瓷膜机组进行过滤，陶瓷膜管组采用四根管并联为一组，两组串在一起，每管装17根0.05um的膜芯，共计136根。

2.4、陶瓷膜过滤液用1000分子量有机膜进行分离，去除1000分子量以上的杂质。

2.5、透过液用200分子量纳滤膜进行浓缩。浓缩截留液干燥成粉末，测定有效成分含量。

大孔树脂与膜分离纯化数据如下：

可见膜分离比大孔树脂节约大量时间，减少溶剂用量，分离效果也较好。

三、纳滤浓缩与真空浓缩比较

1、两种不同浓缩方式能耗成本的比较

表1三批纳滤膜浓缩的能耗

表2三批真空减压浓缩的能耗

从表1和表2可以看出，由于纳滤浓缩只需要电和水，而真空减压浓缩需要蒸汽加热，真空泵以及冷却水系统，浓缩15倍的乙醇，纳滤浓缩的三批能耗成本约为39.9元，而真空减压浓缩三批成本为332.7元，因此纳滤浓缩在浓缩成本比真空减压浓缩更具优势。

2、三批同体积物料两种不同浓缩方式浓缩温度的比较

表3

从表3可以看出，纳滤浓缩温度在25℃～45℃，基本在常温下进行，浓缩过程无相变，浓缩过程中物料损失率一般在0.1％～3％损耗主要是由膜管残留而损失；而传统真空减压浓缩的温度在70℃～80℃，而且必须在真空条件下进行浓缩，浓缩过程中，必须长时间受热；真空减压浓缩物料损失率一般在15％～30％，淫羊藿苷热稳定性很差，特别是在高温的情况下浓缩，会使有效成分分解及受热损失。

3、三批同体积物料两种不同浓缩方式浓缩时间的比较

表4

从表4可以看出，相同设计浓缩处理量的浓缩设备，双效循环蒸发器在浓缩过程中，随着浓缩液浓度的增大，浓缩速度也变慢，每批物料浓缩时间约为14h，平均速度为11.4kg/h；而卷式多功能浓缩设备的浓缩时间在相同物料的条件下约为7.5h，平均速度约为21kg/h。

4、三批同体积物料两种不同浓缩方式损失率的比较

表5

从表5可以看出，纳滤浓缩有效成分平均损失率为0.35％，而真空减压浓缩有效成分损失率为30.2％，远远高于纳滤浓缩，综上所述，将纳滤浓缩与真空减压浓缩从能耗成本、浓缩温度、浓缩时间、损失率来比较，纳滤浓缩更具优势。

(四)具体实施方式

实施例1

1、选取干净的淫羊藿药材加至逆流提取罐内，再将20％乙醇缓慢倒入提取罐中，乙醇用量为淫羊藿重量的10倍，提取2次，每次1.5小时；每次按5L/kg药材量添加新的溶剂；

2、合并2次提取液，以碟片式离心机进行高速离心分离；收集上清液，离心后的溶液要求澄清透明，离心后的沉淀直接排掉，离心机转速为6000-20000转/min；

3、以孔径为0.02μm的微滤膜除沉过滤，跨膜压力为0.1Mpa，料液温度为40-50度，得透过液；

4、将所得透过液通过截留分子量为1000的超滤膜过滤，跨膜压力0.5Mpa，料液温度30-50℃，得超滤液；

5、将所得超滤液以截留分子量为200的聚砜类有机纳滤膜处理，跨膜压力为1Mpa，料液温度30-50℃，得截留液；

6、将截留液微波真空低温干燥，干燥温度50℃以下，干燥物水份≤5.0％，干燥物即为淫羊藿有效成分富集物，其中淫羊藿苷含量63％，淫羊藿总黄酮含量85％。膜分离各单元指标成分转移率≥98％。

实施例2

1、选取干净的淫羊藿药材加至逆流提取罐内，再将30％乙醇缓慢倒入提取罐中，乙醇用量为淫羊藿重量的20倍，提取3次，每次1小时；每次按5L/kg药材量添加新的溶剂；

2、合并3次提取液，以碟式离心机离心分离；收集上清液，离心机转速为6000-10000转/min；

3、以孔径为0.1μm的氧化铝陶瓷膜微滤，跨膜压力为0.2Mpa，料液温度为40-60度，得透过液；

4、将所得透过液通过截留分子量为10000的聚醚砜超滤膜超滤，跨膜压力1.0Mpa，料液温度40-50℃，得超滤液；

5、将所得超滤液以截留分子量为500的纳滤膜处理，跨膜压力为2Mpa，料液温度40-50℃，得截留液；

6、将截留液冷冻干燥，干燥温度-10-50℃，干燥物水份≤5.0％，干燥物即为淫羊藿有效成分富集物，其中淫羊藿苷含量68％，淫羊藿总黄酮含量82％。

实施例3

1、选取干净的淫羊藿药材加至逆流提取罐内，再将40％乙醇缓慢倒入提取罐中，乙醇用量为淫羊藿重量的30倍，提取4次，每次1小时；每次按5L/kg药材量添加新的溶剂；

2、合并4次提取液，以碟式离心机离心分离；收集上清液，离心机转速为7000转/min，；

3、以孔径为0.05μm的氧化铝陶瓷膜微滤，跨膜压力为0.2Mpa，料液温度为45-55度，得透过液；

4、将所得透过液通过截留分子量为5000的聚醚砜超滤膜超滤，跨膜压力0.8Mpa，料液温度35-50℃，得超滤液；

5、将所得超滤液以截留分子量为300的纳滤膜处理，操作压力为2Mpa，料液温度35-50℃，得截留液；

6、将截留液喷雾干燥，干燥温度40℃以下，干燥物水份≤5.0％，干燥物即为淫羊藿有效成分富集物，其中淫羊藿苷含量60％，淫羊藿总黄酮含量88％。

实施例4

1、选取干净的淫羊藿药材加至逆流提取罐内，再将40％乙醇缓慢倒入提取罐中，乙醇用量为淫羊藿重量的25倍，提取3次，每次2小时；每次按5L/kg药材量添加新的溶剂；

2、合并3次提取液，以碟式离心机离心分离；收集上清液，离心机转速为5000-10000转/min，

3、以孔径为0.08μm的氧化铝陶瓷膜微滤，跨膜压力为0.15Mpa，料液温度为50-60度，得透过液；

4、将所得透过液通过截留分子量为3000的聚醚砜超滤膜超滤，跨膜压力1.0Mpa，料溶液温度35-45℃，得超滤液；

5、将所得超滤液以截留分子量为400的纳滤膜处理，跨膜压力为2Mpa，料液温度35-45℃，得截留液；

6、将截留液抽真空减压干燥，干燥温度40℃以下，干燥物水份≤5.0％，干燥物即为淫羊藿有效成分富集物，其中淫羊藿苷66％，淫羊藿总黄酮84％。

Claims

1.从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷及总黄酮的方法，其特征在于包括如下步骤：

a.将淫羊藿药材加至逆流提取罐内，再将20-40％乙醇缓慢倒入提取罐中，乙醇用量为淫羊藿重量的10-30倍，提取2-4次，每次1-1.5小时；每次按5L/kg药材量添加新的溶剂；

b.合并上述数次提取液，以碟式离心机分离；转速为6000-20000转/分，收集上清液；

c.以孔径为0.02-0.1μm的微滤膜除沉过滤，跨膜压力为0.1-0.3Mpa，料液温度为30-60度，得透过液；

d.将所得透过液通过截留分子量为1000-50000的超滤膜分离，跨膜压力0.5-1Mpa，料液温度30-50℃，得超滤液；

e.将所得超滤液以截留分子量为200-500的纳滤膜处理，跨膜压力为1-2Mpa，料液温度30--50℃，得截留液；

f.将截留液干燥，干燥温度60℃以下，干燥物水份≤5.0％，干燥物即为淫羊藿有效成分富集物。

2.根据权利要求1所述的从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷及总黄酮的方法，其特征在于所述微滤膜为氧化铝陶瓷膜。

3.根据权利要求1所述的从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷及总黄酮的方法，其特征在于所述超滤膜为聚醚砜超滤膜。

4.根据权利要求1所述的从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷及总黄酮的方法，其特征在于所述纳滤膜为聚砜类有机复合膜。

5.根据权利要求1所述的从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷及总黄酮的方法，其特征在于所述干燥方法为喷雾干燥、冷冻干燥、微波真空低温干燥或带式真空减压干燥中的任意一种。