CN1403468A - 具有抗骨质疏松作用的淫羊藿总黄酮的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种具有抗骨质疏松作用的淫羊藿总黄酮的制备方法，其特征在于：用水提取，浓缩水提液至密度为1.05－1.11后，用正丁醇萃取；该方法避免使用大孔树脂，不仅简化了操作步骤，而且简化了步骤中的操作；总黄酮的含量以淫羊藿苷计算在55－65％，总黄酮的转移率达75％－80％；淫羊藿总黄酮抗骨质疏松的作用与总黄酮含量有关，高含量的总黄酮制剂能够达到良好治疗效果。

Description

具有抗骨质疏松作用的淫羊藿总黄酮的制备方法

技术领域

本发明属于中药有效部位的制备方法，具体地说是具有抗骨质疏松作用的淫羊藿总黄酮的制备方法。

背景技术

淫羊藿是我国传统的补肾壮骨中药，《本草纲目》记载有“益精气、坚筋骨、补腰膝、强心力”等作用。现代药理研究证明，淫羊藿能增强下丘脑—垂体—性腺轴及肾上腺皮质轴、胸腺轴等内分泌系统的功能，具有激素样作用，能促进骨髓细胞DNA合成，促进骨组织蛋白质合成及促进成骨细胞的生长，并对破骨细胞有直接抑制作用，因而能对抗去卵巢、去睾丸动物及长期大剂量服用肾上腺皮质激素所引起的骨质疏松。临床使用的许多治疗骨质疏松症的复方制剂中均以淫羊藿为主药，即均是中药复方制剂。

关于淫羊藿总黄酮的制备工艺曾有多次文献报道，但多为用乙醇提取。如：马慧萍等在“淫羊藿总黄酮的提取分离工艺研究”华西药学杂志2002，17(1)：1-3文中，用药材粗粉加10倍量70％乙醇提取3次，每次1.5h；最佳分离工艺为：应用酸碱沉淀法，提取物经甲醇纯化。申庆亮等在“正交设计法研究淫羊藿提取工艺条件”中国实验方剂学杂志，2001，7(5)：5-6文中，用药材粗粉加10倍量70％乙醇，回流提取2次，每次40min。王昌利等在“淫羊藿总黄酮提取分离工艺研究”中成药，1996，18(5)：1文中，报道药材粗粉用20倍量的水，浸泡1.5小时，提取2次，每次1小时。

中国专利申请CN1294132A“淫羊藿总黄酮苷的制备工艺”中公开的方法为：将淫羊藿粗粉用含抗氧化剂的水溶液煮沸提取，提取液通过大孔树脂柱吸附。另一中国专利申请CN1283627A“一种从淫羊藿中提取淫羊藿苷的制备方法”中公开的方法为：将淫羊藿地上部分加水浸泡、煎煮，将水液浓缩后，经大孔树脂吸附，乙醇洗脱，洗脱液再用活性炭加热回流脱色。以上两种专利申请的方法虽是用水提取，但因水提杂质多，所以均采用了大孔树脂柱进行分离。专利申请CN1294132A中用水热提取时加抗氧化剂是因为淫羊藿总黄酮在高温提取时及处理过程中易被氧化，参见该发明专利申请公开说明书第2页。而淫羊藿总黄酮氧化必然地导致色泽变深，杂质增加，收率降低，使得有效部位总黄酮的分离更加困难，最终产物中总黄酮含量低，从而影响到治疗效果，因为淫羊藿总黄酮抗骨质疏松的作用与剂量有关。同时，总黄酮的收率降低也影响到药品的成本与价格，尤其是在患者需要较长时期、较高剂量进行治疗的情况下，这种影响更为明显。

发明内容

针对淫羊藿总黄酮提取分离工艺的不足，本发明要解决下述技术问题：研发淫羊藿总黄酮可工业化制备的方法，既可使用水作为提取溶剂，又不使用大孔树脂，避免因树脂的吸附性和其可能的有害残留物，影响进一步在医药上的推广应用；同时，为了保证治疗效果，产物的总黄酮含量要高，因为淫羊藿总黄酮抗骨质疏松的作用与总黄酮含量有关；另外，总黄酮的转移率要高，以便降低生产成本，生产成本低，药品价格才有可能低，因为抗骨质疏松的药往往需要长期服用，患者的经济承受能力是社会效益综合考虑的一个方面。

为解决上述技术问题，本发明研发了如下技术方案。

一种淫羊藿总黄酮提取分离方法：取淫羊藿药材，用水提取，浓缩水提液至密度为1.05-1.11后，用正丁醇萃取。

淫羊藿药材可事先进行粉碎，过20目筛，先用水浸泡1-3小时，也可浸泡1.5小时。

浸泡用水可以是自来水，也可是去离子水，或者其它适于药材提取的洁净水；用水量可以是药材的15-30倍量(重量/体积比)，也可以是20-25倍量，以23-26倍为好。

淫羊藿药材浸泡后，加热提取，可加热到沸腾，然后保持0.3-2小时，保持0.5-1小时较好。药材可用水反复提取2-4次，提取3次为好。

合并水提取液，在65-55℃进行真空浓缩，以60℃进行真空浓缩为好，在水提液浓缩至密度为1.05-1.11，后，用正丁醇萃取。水提液浓缩的密度对正丁醇萃取的效率影响较大，其密度以1.06-1.10较好，密度1.08-1.09更为理想。

正丁醇萃取时，正丁醇的用量为浓缩液体积的1-4倍(体积/体积)，以2-3倍量为较好，2.5-2.8倍亦好。正丁醇萃取多次提取较完全，一般为3-8次，4-7次也可，5-6次较好。

真空回收正丁醇萃取液，即得淫羊藿总黄酮。该提取物具有明显的抗骨质疏松作用，因而淫羊藿总黄酮可与药学上适用载体混合，制备各种具有抗骨质疏松的制剂。

本发明提供了淫羊藿总黄酮可工业化制备的方法，既使用水作为提取溶剂，又避免了使用大孔树脂，不会因树脂的吸附性和其可能的有害残留物，影响进一步在医药上的推广应用。

本发明提供的制备方法，不仅简化了操作步骤，而且简化了步骤中的操作，不用大孔树脂柱处理，也不用活性碳脱色。

上述本发明制备方法，提高了总黄酮的转移率和产物中总黄酮的含量。按《中华人民共和国药典》(2000年版)法测定总黄酮的含量，以淫羊藿苷计算在55-65％；总黄酮的转移率达75％-80％。

总黄酮的转移率高，便可降低生产成本，生产成本低，药品价格才有可能低，因为抗骨质疏松的药往往需要长期服用，患者的经济承受能力是社会效益综合考虑的一个方面。而产物的总黄酮含量高，就为达到良好治疗效果提供了保证，因为淫羊藿总黄酮抗骨质疏松的作用与总黄酮含量有关。药效学试验表明：用淫羊藿总黄酮的低剂量与中、高剂量的疗效存在显著差异；而且，淫羊藿总黄酮无雌激素样作用。药效学试验证明为达到良好的抗骨质疏松效果，应该采用中、高剂量的淫羊藿总黄酮进行治疗，而本发明公开的淫羊藿总黄酮制备方法为制备较高黄酮含量的淫羊藿总黄酮制剂提供了可工业生产的方法。

1、淫羊藿总黄酮对体外培养成骨细胞的影响

动物：新生1-3天SD大鼠，由本校实验动物中心提供。

药物：按本工艺制备的淫羊藿总黄酮(含量为62.5％，批号：G011003)。用DMEM培养液配成浓度为1mg/ml的溶液，调pH至7.0，然后过滤除菌。

主要试剂：DMEM和II型胶原酶为Gibco产品；胰蛋白酶为Merck产品；新生牛血清为上海扬生生物制品有限公司产品；维生素C、β-甘油磷酸钠为Sigma产品；氟化钠(NaF，分析纯)为上海化学试剂总厂所属上海试剂三厂产品；茜素红(ARS)为临海汇丰化学厂产品。其余试剂均为市售分析纯。

方法：成骨细胞培养取新生1-3d SD大鼠，无菌取颅盖骨，仔细剔除粘附的骨膜、血管和结缔组织，剪碎，经0.25％胰蛋白酶37℃消化15min，每3min振荡一次，弃去消化液，再以0.1％II型胶原酶37℃、磁力搅拌(50转/min)下消化60min，消化液1000转/min离心5min，收集细胞，接种于含10％新生牛血清DMEM培养液的培养瓶中，置37℃、5％CO₂孵育箱中培养，24h换液，以后每3d换液一次，待细胞铺满培养瓶时，用0.25％胰蛋白酶消化，并传代培养，所用实验细胞均为第3代细胞。成骨细胞形态为三角形，多角形，无规则形等，形体较大，细胞核较大，染色较深。

细胞增殖检测细胞按2.5×10⁴个/ml密度接种于96孔板，24h后分别加入浓度为1、10、100μg/ml的淫羊藿总黄酮，并设阳性对照组NaF 1×10^-7、1×10^-5M及空白对照组，每种浓度重复6孔。在加入受试药后68h，每孔加入20μl MTT，继续培养4h后吸弃培养液，再每孔加入150μl DMSO(分析纯)，于酶标仪上490nm波长处测各孔吸光度值，结果用OD₄₉₀表示。

矿化结节形成测定细胞以2.0×10⁴个/cm²密度接种于24孔板，24h后换含10％新生牛血清的DMEM培养液，同时加入浓度为1、10、100μg/ml的淫羊藿总黄酮，并设阳性对照组NaF1×10^-7、1×10^-5M及空白对照组，每种浓度重复3孔。每3d换液一次，于第15d用95％乙醇原位固定，0.1％茜素红染色30min，以橘红色结节、边界清晰、＞200μm为标准，于低倍光镜下作矿化结节计数。

对细胞增殖的影响：淫羊藿总黄酮1-10μg/ml浓度时均显著促进成骨细胞增殖，与对照组比较(P＜0.001，P＜0.001)，参见表1。

对矿化结节的影响：成骨细胞培养15d可见矿化结节形成，茜素红染色后呈现大小、形态不一的橘红色结节。淫羊藿总黄酮10μg/ml组矿化结节数较对照组明显提高，与对照组比较P＜0.05，参见表1。表1.淫羊藿总黄酮对促进成骨细胞增殖和矿化结节的影响( x±SD)Group          浓度        OD490          矿化结节数

                       (n＝6)           (n＝3)对照组        ----       0.203±0.012       85.8±7.9010409      1μg/ml      0.252±0.015***    88.0±18.0

          10         0.260±0.025***    113.0±16.1*

          100        0.212±0.003       77.3±6.7NaF          1×10^-7M   0.227±0.015*      100.3±4.2*

         1×10^-5    0.221±0.008**     114.0±8.2***P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001vs对照组

2、淫羊藿总黄酮对去卵巢大鼠骨质疏松模型的影响

动物：Sprague-Dawley清洁级大鼠，雌性，6月龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物质量合格证号：医动字第02-49-3号(上海医学实验动物管理委员会颁发)。

药品与试剂：按本发明方法制备的淫羊藿总黄酮(含量为62.5％，批号：G011003)；尼尔雌醇(Nylestriol，批号：010801，上海华联制药有限公司)；骨疏康(批号：000402，东港市康辰制药有限公司)；骨钙素放免试剂盒(BGP，批号：2002年3月，中国原子能科学研究院)；血清碱性磷酸酶、血清抗酒石酸酸性磷酸酶、血清钙、磷试剂盒均为南京建成生物技术有限公司产品。

方法：分组及给药大鼠以20％乌拉坦1g/kg腹腔注射麻醉后俯位固定，在背部脊柱两侧切口，于无菌条件下摘除双侧卵巢作为骨质疏松症模型大鼠，假手术组双侧切除一小块脂肪作为对照。5日后取存活健康大鼠56只，随机分为7组，每组8只，分别经口给予以下药物，连续3个月。

假手术组(Sham)0.5％CMC-Na溶液10ml/kg/d

病理模型组(模型组)0.5％CMC-Na溶液10ml/kg/d

阳性对照组  尼尔雌醇：1mg/kg(本文简称E3，每周给药2次)

            骨疏康：4g/kg/d(本文简称GSK)

受试药组  淫羊藿总黄酮低剂量：75mg/kg/d(本文简称L-EPF)

          淫羊藿总黄酮中剂量：150mg/kg/d(本文简称M-EPF)

          淫羊藿总黄酮高剂量：300mg/kg/d(本文简称H-EPF)

骨密度测定  于实验结束前2天在乙醚麻醉条件下，对腰椎和股骨进行双能X线(DEXA)骨密度检测。

血清生化指标测定  实验结束前1天，眼眶静脉丛采血，测量血清骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、钙(Ca)、磷(P)含量。

骨生物力学指标测定  末次给药后次日，脱颈椎处死大鼠，迅速剥离右侧股骨，用游标卡尺测其长度、长径和短径，然后置于2000N弹簧压力试验机上(跨距：20mm)进行三点弯曲实验，然后量取断骨的壁厚。通过微机—传感器系统拾取股骨所承载的力(载荷)及挠度(试样弯曲时，其中线偏离原始位置的最大距离)。采用Grapher软件以挠度为横坐标，载荷为纵坐标进行作图，从图中可以获得最大载荷(股骨所能承受的最大力)、最大挠度(股骨承受最大力时发生的位移)。

骨指标测定  剥离左侧股骨，于110℃烘箱中干燥1小时，测定骨长(L)、骨短径(s-D)、骨长径(l-D)和骨重(W)。将干燥股骨炭化后置于马福炉600℃灰化8小时，取出后将骨灰溶于6N HCl溶液中，测定骨钙、磷含量。

骨形态计量学测定  将断骨头端置于2％戊二醛中固定，用牙科金刚石锯(砂轮)将股骨头矢面锯开，取其中一块，清洗，10％次氯酸钠溶液浸泡6小时，超声清洗15分钟，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，然后在空气中自然干燥，离子溅射镀膜。在扫描电镜下观察，加速电压为20千伏。用SEM拍摄的照片结合北京航空航天大学制作的CMIAS-98A型图像分析仪进行骨小梁表面百分比测量。

统计学处理：组间均值比较采用t检验。

对大鼠体重和子宫系数的影响：大鼠去卵巢后体重明显增加，子宫系数显著下降，表明造模是成功的。服用淫羊藿总黄酮后体重增加有减缓的趋势，但不显著，子宫系数与模型组无差异，说明淫羊藿总黄酮无雌激素样作用，参见表2。表2、淫羊藿总黄酮对去卵巢大鼠体重和子宫系数的影响(n＝8， x±SD)Group             Body Weight(g)           Uterus Index(g/kg)Sham                 296±34**              1.486±0.552***模型组               356±24                0.220±0.067E₃                  281±19***             0.925±0.207***GSK                  329±27                0.271±0.106L-EPF                336±31                0.256±0.073M-EPF                341±34                0.206±0.060H-EPF                345±17                0.223±0.034**P＜0.01，***P＜0.001  vs模型组

对血清学指标的影响：与Sham组比较，模型组的s-BGP、s-ALP、s-TRAP均显著升高，而s-Ca、s-P无明显变化。给药3个月后，与模型组相比，E₃组s-BGP、s-TRAP有明显降低，s-ALP也有降低趋势。而EPF各组s-BGP、s-ALP仍然维持在较高水平，但s-TRAP有降低趋势，其中L-EPF和M-EPF组较明显(P＜0.01，P＜0.05)，参见表3。

表3、淫羊藿总黄酮对去卵巢大鼠血清学指标的影响(n＝8， x±SD)

       s-BGP        s-ALP         s-TRAP         s-Ca        s-PGroup

      (ng/ml)        (u)           (U/L)        (mmol/L)    (mmol/L)Sham   1.71±0.38** 15.00±3.18*** 15.39±5.80*   1.70±0.16   1.91±0.54模型组 3.29±1.23   28.65±8.06    21.54±3.74    1.77±0.26   1.87±0.19E₃    1.37±0.33** 21.27±6.28    13.72±6.56*   1.59±0.18   1.70±0.14GSK    3.29±0.99   27.37±5.23    15.91±7.45    1.37±0.11** 1.75±0.32L-EPF  3.76±0.87   33.09±5.50    16.09±2.55**  1.64±0.09   1.75±0.25M-EPF  3.60±0.86   35.73±10.41   16.24±4.44*   1.85±0.15   2.35±0.32**H-EPF  4.64±1.54   32.94±9.05    18.01±2.65    1.39±0.27*  2.12±0.69*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs模型组

对骨指数和骨矿含量的影响：EPF连续给药3个月，对股骨长度，直径无明显影响；对股骨干重也无影响，但低、中、高剂量组均有增加股骨系数的作用。与Sham比较，模型组W_ash/W_femur明显下降。而与模型组比较，EPF中、高剂量组W_ash/W_femur显著升高(P＜0.01，P＜0.01)，W_ash/L也有增加的趋势。EPF各组均能提高股骨钙含量，显著增加骨磷含量(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)，参见表4。

   表4、淫羊藿总黄酮对去卵巢大鼠对骨指数和骨矿含量的影响(n＝8， x±SD)Group    W_ash(g)       W_ash/W_femur(g/g)  W_ash/L(g/cm)      Ca(g/g)         P(g/g)Sham    0.392±0.019    0.621±0.014***    0.105±0.004    0.222±0.016*   0.150±0.008*模型组  0.394±0.038    0.586±0.009       0.104±0.008    0.199±0.017    0.141±0.007E₃     0.391±0.026    0.625±0.013***    0.107±0.006    0.208±0.013    0.149±0.012GSK     0.401±0.025    0.612±0.071       0.107±0.008    0.216±0.009*   0.156±0.011**L-EPF   0.389±0.026    0.593±0.007       0.103±0.006    0.207±0.012    0.153±0.009**M-EPF   0.403±0.030    0.606±0.014**     0.105±0.007    0.206±0.010    0.157±0.009**H-EPF   0.401±0.027    0.609±0.014**     0.106±0.005    0.206±0.020    0.155±0.012***P＜0.01，***P＜0.001  vs模型组

对骨密度的影响：DEXA测试分析结果表明，模型组大鼠股骨骨密度明显降低，腰椎骨密度也有下降趋势。EPF中、高两个剂量组股骨及腰椎骨密度均有升高。

对股骨骨生物力学的影响：模型组最大载荷、最大弯曲应力均较假手术组降低，表明模型组大鼠股骨的抗弯能力、抗拉能力均较假手术组下降，连续给药三个月后，淫羊藿总黄酮低、中、高剂量组的最大载荷、弯曲弹性模量及抗弯刚度均较模型组有升高趋势，表明淫羊藿总黄酮组大鼠股骨的抗弯能力、抗冲击能力及抗疲劳能力均得到了改善。

对骨形态学的影响：去卵巢模型组大鼠骨小梁空洞多，面积大；拱桥结构明显变细，有残缺甚至断裂；骨表面粗糙不光滑。淫羊藿总黄酮中、高剂量组骨小梁空洞减少，面积也缩小；拱桥结构完整，间隙较粗；骨表面也变得光滑平整。

由表5可见，模型组大鼠骨小梁平均宽度显著减小(P＜0.001)，给予淫羊藿总黄酮后MTT较模型组明显上升，中、高剂量组极显著(P＜0.001，P＜0.001)。骨小梁面积百分比TS％显著下降(P＜0.001)，淫羊藿总黄酮中、高剂量组可明显升高降低的TS％(P＜0.001，P＜0.001)。表5、淫羊藿总黄酮对去卵巢大鼠骨密度、骨形态学的影响(n＝6， x±SD)Group               MTT(μm)                      TS％Sham        105.00±13.78***               86.178±0.029***模型组      35.00±6.78                    63.664±0.032E₃         100.33±5.13***                84.701±0.044***GSK         108.33±8.43***                85.679±0.022***L-EPF       53.67±17.36*                  65.464±0.061M-EPF       96.33±6.25***                 82.264±0.043***H-EPF       104.33±8.98***                83.336±0.056****P＜0.05，***P＜0.001 vs模型组

具体实施方式

药材选用《中华人民共和国药典》(2000年版)收载的下列5种淫羊藿药材中的其中一种，即：淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.，箭叶淫羊藿E.sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.，柔毛淫羊藿E.pubescens Maxim.，巫山淫羊藿E.wushanense T.S.Ying，E.koreanum Nakai，药用部位为干燥的地上部分。药材的性状特征、理化鉴别特征和含量测定符合《中华人民共和国药典》(2000年版一部)“淫羊藿”项下的内容。

实施例1

称取淫羊藿药材20kg，粉碎，过20目筛，加15倍量的离子交换水，浸泡1小时，加热至沸腾，保持0.5小时，关闭热源。提取液趁热过滤。提取3次，合并3次提取液，在65℃，真空浓缩至密度为1.064。按《中华人民共和国药典》(2000年版)法测定总黄酮的含量，转移率大于70％。

用正丁醇萃取6次，正丁醇每次用量为提取浓缩液的2.5倍，合并正丁醇萃取液，减压回收正丁醇，至无正丁醇味，真空干燥得总黄酮提取物1536g。该提取物的总黄酮含量按《中华人民共和国药典》(2000年版)法测定，以淫羊藿苷计算在62.5％。总黄酮的转移率达80％。

实施例2

称取淫羊藿药材50kg，粉碎，过20目筛，加20倍量的离子交换水，浸泡1.5小时，加热至沸腾，保持1小时，关闭热源。提取液趁热过滤。提取2次，合并2次提取液，在60℃，真空浓缩至密度为1.108。

用正丁醇萃取6次，正丁醇每次用量为提取浓缩液的1.5倍，合并正丁醇萃取液，减压回收正丁醇，至无正丁醇味(必要时加95％乙醇驱尽正丁醇)，真空干燥得总黄酮提取物3718g。该提取物的总黄酮含量测定，以淫羊藿苷计算在61.5％。总黄酮的转移率达80％。

实施例3

称取淫羊藿药材50kg，粉碎，过20目筛，加25倍量的离子交换水，浸泡2小时，加热至沸腾，保持1.5小时，关闭热源。提取液趁热过滤。提取3次，合并3次提取液，在55℃，真空浓缩至密度为1.08。测定总黄酮的含量，转移率大于70％。

用正丁醇萃取6次，正丁醇每次用量为提取浓缩液的2倍，合并正丁醇萃取液，减压回收正丁醇，至无正丁醇味(必要时加95％乙醇驱尽正丁醇)，真空干燥得总黄酮提取物3746g。该提取物的总黄酮含量以淫羊藿苷计算在60.4％。总黄酮的转移率达80％。

Claims (7)

1、淫羊藿总黄酮提取分离方法，其特征在于：取淫羊藿药材，用水提取，浓缩水提液至密度为1.05-1.11后，用正丁醇萃取。

2、根据权利要求1所述分离方法，其特征在于：用水加热提取，浓缩水提液至密度为1.06-1.10后，用正丁醇萃取。

3、根据权利要求2所述分离方法，其特征在于：用水加热提取，浓缩水提液至密度为1.08-1.09后，用正丁醇萃取，回收正丁醇，得淫羊藿总黄酮。

4、根据权利要求1、2或3所述分离方法，其特征在于：用水热提取，可加热到沸腾，然后保持0.3-2小时，药材可用水反复提取2-4次，合并水提取液，在65-55℃进行真空浓缩，用体积/体积比为浓缩液体积1-4倍量的正丁醇萃取3-8次。

5、根据权利要求4所述分离方法，其特征在于：用水热提取，可加热到沸腾，然后保持0.5-1小时，药材可用水反复提取3次，合并水提取液，在60℃进行真空浓缩，用体积/体积比为浓缩液体积2-3倍量的正丁醇萃取4-7次。

6、根据权利要求5所述分离方法，其特征在于：用体积/体积比为浓缩液体积2.5-2.8倍量的正丁醇萃取5-6次。

7、根据权利要求1-6之一所述分离方法，其特征在于：淫羊藿总黄酮可与药学上适用载体混合。