CN110742935B - 一种中药组合物在制备治疗慢性酒精性脂肪性肝炎的药物中的应用 - Google Patents

一种中药组合物在制备治疗慢性酒精性脂肪性肝炎的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种中药组合物在制备治疗慢性酒精性脂肪性肝炎的药物中的应用，所述中药组合物由大黄、桃仁和地鳖虫制成，所述大黄、桃仁和地鳖虫的重量份配比为：大黄5‑15份、桃仁5‑15份、地鳖虫3‑9份，所述中药组合物是按照以下方法制备而成的：分别将各原料药粉碎，分别用体积浓度10％‑30％的乙醇提取1‑3次，收集、合并提取液，回收乙醇，即得。本发明将下瘀血汤用于治疗慢性酒精性脂肪性肝炎，取得了良好的疗效，不仅扩大了下瘀血汤的应用范围，也为临床治疗慢性酒精性脂肪性肝炎提供了新的思路与方法。

Description

一种中药组合物在制备治疗慢性酒精性脂肪性肝炎的药物中 的应用
技术领域
本发明涉及中药组合物技术领域，具体地说，涉及一种中药组合物在治疗慢性酒精性脂肪性肝炎的药物中的应用。
背景技术
酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是指因长期过量酒精而引起的肝脏损害，最初表现为显著的肝细胞脂肪变，后可进展为脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化。根据患者肝损伤程度的不同，分为以下几种类型：轻症酒精性肝病：一种或多种肝脏生物化学指标、影像学和组织学检查结果轻微异常；酒精性脂肪肝：影像学检查可见脂肪肝，肝脏生物化学指标可有轻微异常；酒精性肝炎：主要表现为血清转氨酶、谷氨酰转肽酶水平升高，通常伴有血清胆红素增高，可伴有发热、外周血中性粒细胞增多；酒精性肝纤维化：患者的症状、体征以及常规实验室和超声检查等常无特征性的改变，血清肝纤维化指标和肝脏瞬时成像检查弹性值可以增高，进一步须通过肝活检来确诊；酒精性肝硬化：有肝硬化的症状和体征，肝脏瞬时成像检查弹性值显著增高，超声、CT等影像学改变符合肝硬化的表现。酒精性肝病属中医“伤酒”、“酒癖”、“酒鼓”、“酒疸”范畴。病因为酒毒湿热之邪。病位在先肝胆脾胃，后及于肾。病机为湿热酒毒伤人，导致肝郁气滞，水湿不运，痰浊内生，肝脾血瘀，脏腑虚损。
下瘀血汤出自张仲景《金匾要略》妇人篇。原方系大黄三两，桃仁20个，蟅虫20枚，熬去足，上三味，末之，炼蜜和为四丸，以酒一升煎一丸，取八合顿服之。主治产妇瘀阻腹痛等。现代医学将下瘀血汤推广使用，如治疗肝炎有淤血症状及肝硬化、脑震荡后遗症、中风后遗症等。但未见有将下瘀血汤用于治疗慢性酒精性脂肪性肝炎的报道。虽有文献将下瘀血汤中大黄、桃仁和/或地鳖虫用于治疗酒精性肝病的报道，但也仅含其中1-2味且多与其他中药配伍，如贾秀琴(贾秀琴.加味温胆汤治疗酒精性脂肪肝38例[J].中西医结合肝病杂志,1996,6(2):34)以加味温胆汤(积实、清半夏、黄连各20g，云苓等15g，陈皮、竹茹、桃仁、柴胡、赤芍、白芍各12g，丹参、山楂各30g，鳖甲24g)治疗酒精性脂肪肝；周滔等(周滔,刘坚,范江勇,等.解醒冲剂治疗慢性酒精性肝病30例[J].中西医结合肝病杂志,2002,12(3):181-182)用解酲冲剂(由葛花、白术、茯苓、茵陈、陈皮、桃仁、丹参等组成)治疗慢性酒精性肝病。另外，本课题组前期发表的文章(Cheng Liu,Xia Yuan,Le Tao.Xia-yu-xuedecoction(XYXD)reduces carbon tetrachloride(CCl4)-induced liver fibrosisthrough inhibition hepatic stellate cell activation by targeting NF-κB andTGF-β1signaling pathways.BMC Complementary and Alternative Medicine,2015,15:201)公开了下瘀血汤有效治疗CCl4诱导的肝纤维化。本课题组前期发表的文章(吴柳,张洁,马文婷,et al.下瘀血汤对胆碱蛋氨酸缺乏诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎的抑制作用[J].中国肝脏病杂志(电子版),2018,10(03):54-61)报道了下瘀血汤对MCD诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)有显著改善作用。在该文章中，MCD诱导的NASH模型为8周小鼠，此时已伴有肝纤维化，所以难以确定下瘀血汤对小鼠模型的改善作用是否是基于对肝纤维化的治疗作用。再者，慢性酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎的病因和机制有很大的不同，所以难以预期下瘀血汤对慢性酒精性脂肪性肝炎的影响。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种中药组合物在制备治疗慢性酒精性脂肪性肝炎中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种中药组合物在制备治疗慢性酒精性脂肪性肝炎中的应用，所述中药组合物由大黄、桃仁和地鳖虫制成。
作为本发明的一个优选例，所述大黄、桃仁和地鳖虫的重量份配比为：大黄5-15份、桃仁5-15份、地鳖虫3-9份。
更优选地，所述大黄、桃仁和地鳖虫的重量份配比为：大黄10份、桃仁10份、地鳖虫6份。
作为本发明的另一优选例，所述中药组合物是按照以下方法制备而成的：将各原料药粉碎，分别用体积浓度10％-30％的乙醇提取1-3次，收集、合并提取液，回收乙醇，即得。
作为本发明的另一优选例，所述中药组合物的剂型为口服剂型。
更优选地，所述口服剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂或合剂。
作为本发明的另一优选例，所述中药组合物还包含药学上的常规载体。
更优选地，所述药学上的常规载体选自乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂和助溶剂中的一种或几种。
本发明优点在于：
下瘀血汤由“大黄、桃仁、蛰虫(土鳖虫)”组成，有“祛瘀活血，泻下通经”之功效，原方是用于治疗妇人产后瘀阻腹痛及瘀血阻滞之症。方中大黄味苦寒，主下瘀血，破瘕积聚，行推陈致新之功；桃仁味苦平，主治瘀血，血闭，有活血化瘀润燥之效；土鳖虫善破瘀消瘕，攻瘀血，并开血闭，三味相合，共奏活血化瘀、软坚散结之功。本发明将下瘀血汤用于治疗酒精性肝病中的慢性酒精性脂肪性肝炎，取得了良好的疗效，不仅扩大了下瘀血汤的应用范围，也为临床治疗慢性酒精性脂肪性肝炎提供了新的思路与方法。
附图说明
图1：实施例1动物实验的主要技术路线图。
图2：10天慢性酒精性脂肪性肝炎模型小鼠肝体比值、血清ALT、AST和TG柱状图。
图3：4周慢性酒精性脂肪性肝炎模型小鼠肝体比值、血清ALT、AST和TG柱状图。
图4：肝组织病理学变化(HE，×200倍)。
图5：肝组织油红染色(×400)。
图6：小鼠肝组织TNF-α、IL-1βmRNA相对表达量柱状图。
图7：免疫组化检测肝组织中MPO的表达(×400)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1 中药组合物在制备治疗慢性酒精性脂肪性肝炎的动物实验
研究方案如下：
(1)运用国际经典Lieber-Decarli饲料加酒精(10天喂养加1天Binge)制备10天慢性酒精性脂肪性肝炎模型。
(2)运用国际经典Lieber-Decarli饲料加酒精喂养4周制备慢性酒精性脂肪性肝炎模型。
以下瘀血汤(药物：大黄、桃仁、地鳖虫)为研究对象，应用Lieber-Decarli慢性酒精性脂肪性肝炎模型，造模的同时予以下瘀血汤干预，通过检测小鼠肝体比、肝功能、甘油三酯等肝功能指标，检测下瘀血汤对慢性酒精性脂肪性肝炎的治疗作用。
(3)复方下瘀血汤对慢性酒精性脂肪性肝炎机制研究：
在明确下瘀血汤疗效基础上，重点围绕慢性酒精性脂肪性肝炎的关键病理环节，肝组织炎症程度(TNF-α、IL-1β)，脂肪变性及中性粒细胞浸润等方面进行作用机理探索。
主要技术路线参见图1。
1.材料与方法
(1)药物及其制备：所用药物均按《中华人民共和国药典》2010年版中的规定，采用道地药材，生药学专家鉴定，保存样品备查。统一由上海中医药大学中药制剂中心一次制备后冷冻保存。大黄(掌叶大黄，青海)10g(2kg)、桃仁(山西)10g(2kg)、地鳖虫(江苏)6g(1.2kg)。药物购自上海华宇药物有限公司，制成粗粉末后以20％乙醇提取2次，提取液浓缩成浸膏，真空干燥后冷藏保存。具体提取方法如下：大黄2.0kg、桃仁2.0kg、地鳖虫1.2kg，分别制成粗粉末，分别加8倍量20％乙醇，浸泡1小时，回流提取2次，第1次加20％乙醇回流提取30分钟，滤过取汁；药渣再加6倍量20％乙醇回流提取1小时，滤过取汁，合并2次提取液。回收乙醇，流浸膏备用。生药总重量：大黄2kg，煎煮浓缩后为2.13kg，相对密度(65℃)1.21，真空干燥后重量为0.576kg，每克含生药3.472g。。
(2)小鼠10天慢性酒精性脂肪性肝炎的分组与给药：上海中医药大学附属普陀医院动物中心实施，8周的雄性C57BI/6小鼠(18-20g)24只，随机分为4组，对照组、酒精组、对照下瘀血汤组和酒精下瘀血汤组，每组各6只。饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司，Lieber-Decarli对照液体饲料(TP4030C)与Lieber-Decarli酒精液体饲料(TP4030B)按照说明书配制，对各组小鼠进行慢性酒精性脂肪性肝炎造模，对照组造模过程中全程给予液体对照饲料(36％高脂肪饲料)喂养，慢性酒精性脂肪性肝炎模型组采用10天乙醇喂养加急性乙醇灌胃的方法(参见：Bertola,A.；Mathews,S.；Ki,S.H.；Wang,H.；Gao,B.,Mousemodel of chronic and binge ethanol feeding(the NIAAA model).Nature Protocols2013,8(3),627-637.)，过程分为适应喂养期和造模期两个阶段，适应喂养阶段前三天为液体对照饲料适应阶段，后三天为酒精饲料适应阶段，对照饲料与酒精饲料分别按按2:1、1:1、1:2比例混匀喂养，之后进入完全酒精饲料喂养期。下瘀血汤组按75kg成人体质量临床用量10倍量，即0.4678g/kg灌胃，临用前用10mL蒸馏水稀释，以10mL/kg体质量的剂量灌胃，每日1次。对照组给予等量的生理盐水灌胃。造模阶段为10天。酒精组、酒精下瘀血汤组在第17天予以酒精灌胃(将无水酒精浓度稀释至31.5％，按5g/kg小鼠体重灌胃)制备Binge模型，对照组以45％糊精(按9g/kg小鼠体重糊精)灌胃，9小时后处死小鼠。
(3)小鼠4周慢性酒精性脂肪性肝炎的分组与给药：实验在上海中医药大学附属普陀医院动物中心实施，8周的雄性C57BI/6小鼠(18-20g)24只，随机分为4组，对照组、酒精组、对照下瘀血汤组和酒精下瘀血汤组，每组6只。饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司，Lieber-Decarli对照液体饲料(TP4030C)与Lieber-Decarli酒精液体饲料(TP4030B)按照说明书配制，对照组造模过程中全程给予液体对照饲料(36％高脂肪饲料)喂养，慢性酒精性脂肪性肝炎模型组采用4周慢性乙醇喂养加急性乙醇灌胃的方法。先给予模型组小鼠对照液体饲料适应三天，随后予对照饲料与酒精饲料按2:1、1:1、1:2比例混匀喂养3天，之后进入完全酒精饲料喂养期(共4周)。下瘀血汤组按75kg成人体重临床用量的10倍量，即0.4678g/kg灌胃，临用前用10mL蒸馏水稀释，以10mL/kg剂量灌胃，每日1次。其余两组予以等量的生理盐水灌胃。第32日灌胃(酒精组以31.5％乙醇灌胃，剂量为每千克体重5g乙醇；对照组以45％糊精灌胃，剂量为每千克体重9g糊精)，9h后处死小鼠。
(4)标本留取：造模结束，用2％戊巴比妥钠(2mL/kg小鼠体重)腹腔注射麻醉，仰卧固定，打开腹腔，在下腔静脉处进针取血，血液静置1h后，4℃，3000rpm，10min离心，分离血清，-80℃保存，用于检测肝功能、血脂等指标。摘取肝脏，制备冰冻组织和10％的中性福尔马林固定，肝组织用于组织病理学、Real-time PCR及免疫组化等指标检测。
(6)检测指标：动物一般情况：包括体重、肝重及死亡率等；小鼠肝功能(ALT、AST)，血脂(TC、TG)测定，肝功能及血脂检测试剂购置南京建成生物工程研究所。肝组织HE，油红染色，炎症因子Real-time PCR，中性粒细胞浸润标志物(MPO)免疫组化等。
1)HE染色
小鼠肝组织以10％福尔马林固定，经脱水石蜡包埋后切片，置于全自动染色机进行HE染色，荧光显微镜观察肝组织病理形态变化。
2)油红染色
小鼠肝组织冰冻包埋后切片，室温静置15min，油红-O与d-dH2O按3:2配比稀释，60％异丙醇清洗，油红-O染色15min，晾干，d-dH2O清洗，苏木素复染核，甘油明胶封片，镜检。
3)免疫组化
小鼠肝组织以10％福尔马林固定，经脱水石蜡包埋后切片，脱蜡至水，>92℃微波修复，冷却，PBS洗5min×3次，5％BSA室温封闭30min，滴加MPO抗体抗，4℃过夜。PBS洗3min×3次，加二抗室温1h。滴加SABC，37℃，20min。PBS洗5min×3次，DAB显色，蒸馏水清洗，苏木素复染，无水乙醇、二甲苯脱水后封片，镜检。
4)实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测各组小鼠肝脏IL-1β，TNF-αmRNA的表达。称取约50mg小鼠肝组织，采用Trizol法提取总RNA，核酸定量分析仪测定总RNA的浓度和纯度，A260nm/A280nm值在1.8-2.1之间即可。参照逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA。用cDNA为模板对18S，IL-1β，TNF-α基因分别进行PCR扩增，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。反应条件：95℃30sec，95℃5sec 60℃30sec 45个循环，导出数据，进行统计分析。
(7)统计学方法
采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，组间比较用单样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01提示有显著性统计学差异。
2.结果
(1)下瘀血汤对小鼠慢性酒精性脂肪性肝炎有治疗作用
10天慢性酒精性脂肪性肝炎模型中各组小鼠肝体比值结果表明：与酒精组相比，酒精下瘀血汤组肝体比值显著降低(P<0.05)。ALT、AST是反应肝脏肝细胞损伤及炎症的直接指标，检测各组小鼠血清ALT、AST结果表明，酒精组中血清ALT、AST值较对照组显著升高(P<0.01)，而与酒精组相比，酒精下瘀血汤组ALT、AST显著降低(P<0.01)，提示下瘀血汤可显著抑制酒精导致的急性肝损伤炎症。血清甘油三酯检测结果表明：与对照组比较，酒精组TG显著升高(P<0.01)，与酒精组比较，酒精下瘀血汤组TG均显著降低(P<0.01)，提示下瘀血汤可显著降低慢性酒精性脂肪性肝炎中的血清甘油三酯(图2)。
4周慢性酒精性脂肪性肝炎模型(天狼星红染色中未见纤维化形成)中，统计各组小鼠肝体比值结果表明：与酒精组相比，酒精下瘀血汤组肝体比值显著降低(P<0.05)。检测各组小鼠血清ALT、AST结果表明，酒精组中血清ALT、AST值较对照组显著升高(P<0.01)，酒精下瘀血汤组ALT、AST值较酒精组显著降低(P<0.01)，提示下瘀血汤可显著抑制酒精导致的4周肝损伤炎症。血清甘油三酯检测结果表明：与对照组比较，酒精组TG显著升高(P<0.01)，与酒精组比较，酒精下瘀血汤组TG均显著降低(P<0.01)，提示下瘀血汤可显著降低慢性酒精性脂肪性肝炎中的血清甘油三酯(图3)。
(2)下瘀血汤可显著改善慢性酒精性脂肪性肝炎小鼠肝组织病理变化
10天慢性酒精性脂肪性肝炎模型和4周慢性酒精性脂肪性肝炎模型中，对照组、对照下瘀血汤组的肝组织中肝细胞均排列整齐，由中央静脉向四周放射排列，肝小叶结构清晰，汇管区无炎细胞浸润。在酒精组中肝细胞肿胀，排列松散，中央静脉结构变形，肝小叶结构欠清晰，汇管区有炎细胞浸润。而酒精下瘀血汤组肝细胞排列有序，肝小叶结构正常，炎症细胞明显减少或消失。表明下瘀血汤对酒精性肝损伤肝组织学有显著改善作用(图4)。
(3)下瘀血汤显著减轻小鼠肝组织脂肪沉积
在10天慢性酒精性脂肪性肝炎模型中，对照组、对照下瘀血汤组可见少量脂滴，酒精组中脂滴显著增多，大小不一，脂肪沉积增多，而酒精下瘀血汤组的脂滴显著减少。4周慢性酒精性脂肪性肝炎模型中，对照组见少量脂肪沉积，酒精组中的脂肪沉积显著增多，而酒精下瘀血汤组的脂滴显著减少。表明下瘀血汤对慢性酒精性脂肪性肝炎中脂质沉积有显著改善作用(图5)。
(4)下瘀血汤抑制小鼠肝组织中炎症因子TNF-α，IL-1βmRNA的表达
在10天慢性酒精性脂肪性肝炎模型中，检测各组肝组织中TNF-α、IL-1βmRNA的相对表达，结果表明：与对照组比较，酒精组TNF-α、IL-1βmRNA均显著升高(P<0.01)，与酒精组比较，酒精下瘀血汤组TNF-α、IL-1βmRNA均降低(P<0.01)。4周慢性酒精性脂肪性肝炎模型中，与对照组比较，酒精组TNF-α、IL-1βmRNA均显著升高(P<0.01)，与酒精组比较，酒精下瘀血汤组TNF-α、IL-1βmRNA均降低(P<0.01)。表明下瘀血汤可抑制慢性酒精性脂肪性肝炎中炎症因子表达(图6)。
(5)下瘀血汤显著减轻慢性酒精性脂肪性肝炎中性粒细胞浸润
10天慢性酒精性脂肪性肝炎模型和4周慢性酒精性脂肪性肝炎模型中免疫组化检测结果表明：对照组、对照下瘀血汤组中MPO蛋白无表达或表达量极少，酒精组MPO蛋白表达显著升高，与酒精组比较酒精下瘀血汤组中MPO蛋白表达降低。MPO是中性粒细胞浸润的标志物。本研究表明下瘀血汤对慢性酒精性脂肪性肝炎中性粒细胞浸润有显著改善作用，可明显改善慢性酒精性脂肪性肝炎的炎症(图7)。
实施例2 中药组合物的制备(一)
按重量份称取各原料药：大黄5份、桃仁15份、地鳖虫3份，分别制成粗粉末，分别加8倍量15％乙醇，浸泡1小时，回流提取2次，第1次加15％乙醇回流提取30分钟，滤过取汁；药渣再加6倍量15％乙醇回流提取1小时，滤过取汁，合并2次提取液。回收乙醇，流浸膏备用。
实施例3 中药组合物的制备(二)
按重量份称取各原料药：大黄15份、桃仁5份、地鳖虫9份，分别制成粗粉末，分别加7倍量25％乙醇，浸泡2小时，回流提取3次，第1次加25％乙醇回流提取30分钟，滤过取汁；药渣再加8倍量25％乙醇回流提取1小时，滤过取汁，合并2次提取液。回收乙醇，流浸膏备用。
实施例4 中药组合物的制备(三)
按重量份称取各原料药：大黄10份、桃仁15份、地鳖虫6份，分别制成粗粉末，分别加8倍量15％乙醇，浸泡1小时，回流提取2次，第1次加15％乙醇回流提取30分钟，滤过取汁；药渣再加6倍量15％乙醇回流提取1小时，滤过取汁，合并2次提取液。回收乙醇，流浸膏备用。
实施例5 中药组合物的制备(四)
按重量份称取各原料药：大黄15份、桃仁5份、地鳖虫6份，分别制成粗粉末，分别加8倍量25％乙醇，浸泡1小时，回流提取2次，第1次加25％乙醇回流提取30分钟，滤过取汁；药渣再加6倍量25％乙醇回流提取1小时，滤过取汁，合并2次提取液。回收乙醇，流浸膏备用。
实施例6 中药组合物的制备(五)
按重量份称取各原料药：大黄20份、桃仁20份、地鳖虫12份，分别制成粗粉末，分别加8倍量10％乙醇，浸泡1小时，回流提取2次，第1次加10％乙醇回流提取30分钟，滤过取汁；药渣再加6倍量10％乙醇回流提取1小时，滤过取汁，合并2次提取液。回收乙醇，流浸膏备用。
实施例7 中药组合物的制备(六)
按重量份称取各原料药：大黄20份、桃仁20份、地鳖虫12份，分别制成粗粉末，分别加8倍量30％乙醇，浸泡1小时，回流提取2次，第1次加30％乙醇回流提取30分钟，滤过取汁；药渣再加6倍量30％乙醇回流提取1小时，滤过取汁，合并2次提取液。回收乙醇，流浸膏备用。
实施例8 中药组合物片剂/胶囊剂的制备
将实施例2-7任一方法制备的浸膏干燥粉碎制成颗粒，加入制药辅料，压制成片剂或填充装胶囊。
实施例9 中药组合物颗粒剂的制备
将实施例2-7任一方法制备的浸膏干燥粉碎制成颗粒。
实施例10 中药组合物合剂的制备
将实施例2-7任一方法制备的浸膏加适当制药辅料(白糖、蜂蜜、苯甲丙酸或羟苯乙酯等)，制成合剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种中药组合物在制备治疗慢性酒精性脂肪性肝炎药物 中的应用，其特征在于，所述中药组合物由大黄、桃仁和地鳖虫制成，所述大黄、桃仁和地鳖虫的重量份配比为：大黄5-15份、桃仁5-15份、地鳖虫3-9份。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大黄、桃仁和地鳖虫的重量份配比为：大黄10份、桃仁10份、地鳖虫6份。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中药组合物是按照以下方法制备而成的：将各原料药粉碎，分别用体积浓度10%-30%的乙醇提取1-3次，收集、合并提取液，回收乙醇，即得。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的剂型为口服剂型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述口服剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂或合剂。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中药组合物还包含药学上的常规载体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药学上的常规载体选自乳化剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂和助溶剂中的一种或几种。
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