CN101095716B - 杜仲总多糖在制备防治系统性红斑狼疮药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属中药领域，涉及杜仲总多糖在制备防治系统性红斑狼疮药物中的用途。本发明从中药杜仲中分离提取得到总多糖提取物，平均产物收率2.2％，多糖含量＞68％。所述总多糖提取物经体外实验证实有较强抗补体活性，整体动物模型试验显示，对系统性红斑狼疮样综合征小鼠的自身免疫反应亢进和肾损伤有明显的保护作用，证实对系统性红斑狼疮样综合征有防治作用。可制备防治系统性红斑狼疮药物和防治自身免疫性疾病等药物。

Description

杜仲总多糖在制备防治系统性红斑狼疮药物中的用途

技术领域

本发明属中药领域，涉及中药杜仲总多糖新的药用用途。具体涉及杜仲总多糖在制备系统性红斑狼疮药物中的用途。

背景技术：

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种病因不甚明确的炎性结缔组织病，主要发病在女性，也可累及儿童。一项多国多中心研究表明，目前系统性红斑狼疮的发病率为12.5/10万～39/10万。SLE是一种累及多系统、临床表现复杂、病程迁延反复的、致死率高的自身免疫性疾病，通常被视为代表性的自身免疫病。SLE自身免疫异常的表型具有高度多样性，包括免疫耐受缺损、淋巴细胞凋亡障碍、T或B细胞功能调节障碍、N K细胞功能缺损、补体缺陷、自身抗原抗体形成的免疫复合物清除障碍、细胞因子分泌调节障碍等，几乎涉及整个免疫系统。除皮肤、粘膜外，常累及肾脏、心脏、肝脏、肺及神经系统等内脏器官，常伴有发热、乏力、关节痛等全身症状，并在血液中存在多种抗自身抗体。

补体系统在自身免疫性疾病的预防发病及疾病损伤中，起着所谓″双刃剑″的作用。一方面，补体系统功能的正常，可以有效地促进循环免疫复合物的运送及清除：另一方面，补体系统功能的缺陷，包括组分的缺失或功能的失常，又会参与对组织的损伤。SLE活动期患者体内B淋巴细胞活性增强，产生大量抗自身尤其是抗ds-DNA抗体，与自身抗原在体内形成大量免疫复合物，活化补体，消耗大量补体C3和C4成分，使C3、C4水平降低。而非活动期SLE患者B淋巴细胞活性基本正常，体内自身抗体水平也基本正常，补体消耗减少，使补体正常或轻度偏高。因此，血清中高Ig，低补体C3、C4是SLE活动性的重要指标。补体活化造成的III型变态反应的直接作用和对免疫细胞功能的影响可加重SLE的病理损害，影响SLE病程的发展和临床表现。

由于SLE患者体内产生大量的循环免疫复合物沉积于组织、器官等，尤其是肾脏，常可引起肾小球肾炎(即狼疮性肾炎Lupus Nephritis，LN)。一旦免疫复合物沉积于肾组织内即可激活补体系统，引起一系列的免疫损伤反应(III型变态反应)：血管内凝血 因子的激活，毛细血管通透性增加，中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞的浸润，局部组织细胞的坏死，蛋白溶解酶或裂解酶的大量释放，以及一系列调节肾小球细胞增殖、基质增生的细胞因子的释放等等，从而产生肾脏的各种病理变化。

狼疮性肾炎是SLE的重要临床组成部分。SLE患者中约35％～90％有肾脏累及的临床表现，如蛋白尿、红白细胞尿，管型尿及肾小管和小球滤过功能的变化。肾脏病理检查发现：90％患者在光镜下可出现异常；采用免疫荧光或电镜等复杂技术观察，几乎所有SLE患者均有不同程度的肾脏累及。肾脏损害的严重程度与SLE的预后密切相关。多数SLE患者最终出现肾功能不全，严重影响着患者的生命。(毕志刚，刘晓华.红斑狼疮现代诊疗.第1版[M].江苏：江苏科学技术出版社，2000.98-100)。目前临床治疗主要以对症的长期监控性治疗为主，治疗药物主要为非甾体类抗炎药、免疫抑制剂、静脉注射免疫球蛋白、性激素等治疗药物等。尽管糖皮质激素及免疫抑制剂等能控制病情，但其不良反应也是患者致死原因之一。

研究表明，高水平抗自身抗体和补体系统的过度激活所引发的免疫性组织损伤是SLE患者发病的重要机制，而且与SLE的发生与预后有显著联系。通过特异性抑制补体组成成分的激活，降低抗ds-DNA抗体水平，可能提高治疗SLE的临床疗效，减少不良反应。因此临床急需高效低毒的药物。

杜仲(Eucommia ulmoides Olive.)，又名“思仙”、“木棉”、“扯丝皮”、“丝连皮”等，是杜仲科杜仲属的落叶乔木，系地质史上第四纪冰川运动残留下来的古生孑遗树种。中国传统以杜仲干燥树皮入药，是常用的名贵滋补药材，已有两千多年应用历史。从古至今，对杜仲的化学成分、药理作用和临床应用的研究一直十分活跃。《神农本草经》，将杜仲列为上品120种之一，记载“杜仲味辛平。主腰膝痛，补中益精气，坚筋骨，强志。除阴下痒湿，小便馀沥。久服轻身耐老。一名思仙。”杜仲的化学成分主要有木脂素类、环烯醚萜甙类、苯丙素类、黄酮类，其它成分还有酚类、三萜、甾体、挥发油、多糖、有机酸、氨基酸、磷脂、烷烃、醇类、维生素、微量元素及杜仲胶等。杜仲的药理药效作用主要有降压作用、抗炎抗病毒的作用、有抗癌和防癌的作用、增强机体非特异性免疫功能、强壮抗衰老作用、利尿作用以及其他美白肌肤，消除老人斑，增加头发黑色素细胞，提高头发黑色素细胞活性，防止白发。

文献(徐诗论等，中草药，1982，13：24；1983，14：27；周彦刚等，浙江省医学科学院学报1993，37：32-35)报道杜仲能增加大鼠血皮质酮水平，减轻胸腺重量， 并表现抗炎，增加肝糖元等皮质激素样生理功效能；但未涉及对系统性红斑狼疮的作用。综观国内外的研究，均未见报道杜仲总多糖的防治系统性红斑狼疮的药效及其药物。

发明内容

本发明的目的是提供中药杜仲总多糖新的药用用途，具体涉及杜仲总多糖在制备系统性红斑狼疮药物中的用途。

本发明从中药杜仲中分离提取得到总多糖提取物。所述总多糖提取物经体外实验证实有较强抗补体活性，整体动物模型试验证实其具有很强的防治系统性红斑狼疮作用。所述杜仲总多糖可作为唯一活性成分制备防治自身免疫性疾病的药物。

本发明的杜仲总多糖通过下述方法制备：

杜仲药材粉碎后以95％乙醇冷浸提取三次，每次7天，滤过，药渣于室温下通风处晾干，然后用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液浓缩后流水透析3天，透析液浓缩至小体积后加乙醇至含醇量80％，沉淀用丙酮、乙醇洗涤后冷冻干燥即得总多糖提取物，收率达2％以上，多糖含量超过68％。

上述杜仲总多糖用于抗补体和系统性红斑狼疮样综合征试验：

1)抗补体激活经典途径细胞溶血试验

采用豚鼠(购自复旦大学实验动物部)血清1∶80液作为补体，抗原激活补体经典途径导致羊红细胞溶血，结果显示，测得杜仲总多糖可抑制细胞溶血。IC₅₀＝462μg.ml^-1(n＝4)。

2)抗补体激活旁路途径细胞溶血试验

采用健康人血清1∶10稀释液作为补体，激活补体旁路途径导致兔红细胞溶血，结果显示，测得杜仲总多糖可抑制溶血。AP₅₀＝1.675mg.ml^-1(n＝4)。

3)总多糖用于防治系统性红斑狼疮样综合征试验：

选用昆明种和BALB/c小鼠，以空肠弯曲菌灭活菌株免疫，建立系统性红斑狼疮综合征模型。杜仲总多糖灌胃给药，观察试验动物的血清中抗体水平及尿蛋白水平。取肾，石蜡固定，切片，显微镜下观察病理改变，取脾和胸腺测定器官指数。结果证实，口服杜仲总多糖对小鼠狼疮样综合征引起的肾损伤有明显的保护作用。

整体试验结果证实，杜仲总多糖对小鼠系统性红斑狼疮有防治作用。

附图说明

图1是SLE模型小鼠(昆明种)尿蛋白水平。

图2是空白对照组小鼠(昆明种)肾病理切片图。

图3是模型对照组小鼠(昆明种)肾病理切片图。

图4是SLE模型组小鼠(昆明种)肾病理切片图。

图5是杜仲多糖给药组小鼠(昆明种)肾病理切片图。

图6是阳性对照(泼尼松)组小鼠(昆明种)肾病理切片图。

图7是SLE模型小鼠(BALB/c)尿蛋白水平。

图8是SLE模型小鼠(BALB/c)抗ds-DNA抗体水平。

图9是SLE模型小鼠(BALB/c)抗组蛋白抗体水平。

图10是空白对照组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。

图11是模型对照组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。

图12是SLE模型组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。

图13是杜仲多糖(30mg/kg)给药组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。

图14是杜仲多糖(15mg/kg)给药组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。

图15是阳性对照(泼尼松)组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。

具体实施方式

实施例1

取杜仲药材100g粉碎后以95％乙醇冷浸提取三次，每次7天，滤过，药渣于室温下通风处晾干，然后用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液浓缩后流水透析3天，透析液浓缩至小体积后加乙醇至含醇量80％，沉淀用丙酮、乙醇洗涤后冷冻干燥即得总多糖提取物，收率达2％以上，多糖含量超过68％。

实施例2

将杜仲(Eucomia ulmoides Olive.)总多糖3.0mg.ml^-1用巴比妥缓冲液(VBS2+)对倍稀释得八个浓度的溶液，各取0.2ml各浓度样品加入0.2ml补体(豚鼠血清1∶32稀释液)，0.1ml 2％羊红细胞(sheep red blood cell，SRBC)和0.1ml 1∶1000溶血素(抗 SRBC血清)，将每管37℃水浴30分钟后放置入低温高速离心机2500G、4℃离心，20min后分别取每管上清0.25ml于酶标仪405nm下测定吸光度。同时将0.2ml各浓度样品溶液与0.4mlVBS2+混合，放置入低温高速离心机以2500G、4℃离心10min，取每管上清0.25ml于酶标仪405nm下测定吸光度，作为样品吸光本色值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本色值为加入药物后的溶血吸光度，并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照，计算药物抑制溶血的半数抑制浓度(IC₅₀)为462μg.ml^-1(n＝4)。

实施例3

将杜仲(Eucomia ulmoides Olive.)总多糖3.0mg.ml^-1用含EGTA的巴比妥缓冲液(EGTA-VBS)对倍稀释得八个浓度的溶液，取0.15ml各浓度样品加入0.15ml补体(人血清1∶10稀释液)，0.2ml 2％兔红细胞，将每管37℃水浴30分钟后放置入低温高速离心机2500G、4℃离心，20min后分别取每管上清0.25ml于酶标仪405nm下测定吸光度。再将0.15ml各浓度样品溶液与0.35mlEGTA-VBS混合，放置入低温高速离心机以2500G、4℃离心10min，取每管上清0.25ml于酶标仪405nm下测定吸光度，作为样品吸光本色值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本色值为加入药物后的溶血吸光度，并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照，计算药物抑制溶血的半数抑制浓度(AP₅₀)为1.675mg.ml^-1(n＝4)。

实施例4

昆明种小鼠30只(16-20g)，随机分为5组(A、B、C、D、E组)。A组为正常对照组，B组为模型对照组，C组为SLE模型组，D组为杜仲多糖组，E组为醋酸泼尼松组。初次免疫，A组为正常对照组，尾根部皮下注射生理盐水，B组为模型对照组，尾根部皮下注射弗氏完全佐剂，其余各组以空肠弯曲菌配合弗氏完全佐剂尾根部皮下注射，免疫诱导SLE样综合征，每只小鼠注射量为50μl。初次免疫后第14天加强免疫1次：A组和B组皮下注射生理盐水，其余各组皮下注射空肠弯曲菌菌悬液，每只小鼠注射量为0.2ml。小鼠在免疫当天开始灌胃给药，每天一次至第32天。D组杜仲多糖给药剂量为30mg/kg，E组醋酸泼尼松组给药剂量为5mg/kg，B组和C组均给予配药用空白赋形剂(5％羧甲基纤维素钠，CMC)，A组不灌胃。

小鼠于免疫后d32，常规检测尿蛋白水平及显微镜下观察肾石切片病理改变，病理损伤评级，按损伤的严重程度分为轻、中、重度，分别给1、2、3分，无病理损伤给0分。

结果显示，与正常对照组和模型对照组相比，SLE模型鼠的尿蛋白明显升高，杜仲多糖对SLE样综合征小鼠尿蛋白有明显的降低作用(附图1)。

肾病理检测显示，正常组小鼠肾脏正常，模型对照小鼠基本正常。模型组小鼠肾脏均有炎性细胞侵润、肾小球增大和肾小球囊腔缩小。杜仲多糖给药组所有小鼠都无肾小球增大、肾小球囊腔缩小现象，无炎性细胞侵润。阳性对照药强地松仅有一只小鼠的肾小球部分增大、囊腔缩小，伴炎性细胞侵润(附图2，3，4，5，6)。

结果表明，杜仲总多糖在体内降低尿蛋白水平，明显改善肾小球的增大，抑制炎性细胞侵润，有缓解SLE样小鼠肾损伤作用。

表1是昆明种小鼠肾病理损伤评级(X±SD)(n＝25)。

表1

其中，*与SLE模型组比较P＜0.05；**与SLE模型组比较P＜0.01。

实施例5

BALB/c小鼠48只(16-20g)，随机分为5组(A、B、C、D、E组)。A组为正常对照组(n＝8)，B组为模型对照组(n＝8)，C组为SLE模型组(n＝10)，D组为杜仲多糖组(n＝9)，E组为醋酸泼尼松组(n＝8)。初次免疫，A组为正常对照组，足跖部皮下注射生理盐水，B组为模型对照组，足跖部皮下注射弗氏完全佐剂，其余各组以空肠弯曲菌配合弗氏完全佐剂足跖部皮下注射，免疫诱导SLE样综合征，每只小鼠注射量为50μl。初次免疫后第14天加强免疫1次：A组和B组尾静脉注射 生理盐水，其余各组注射空肠弯曲菌菌悬液，每只小鼠注射量为0.2ml。在免疫当天开始给小鼠灌胃给药，每天一次至第34天。D组杜仲多糖给药剂量为30mg/kg、15mg/kg，E组醋酸泼尼松组给药剂量为5mg/kg，B组和C组均给予配药用空白赋形剂(5％羧甲基纤维素钠，CMC)，A组不灌胃。

免疫后第35天，BALB/c小鼠常规取血测定血清抗自身抗体水平。取小鼠胸腺、脾称重，求器官指数。器官指数＝脏器重(mg)/10g体重。取双侧肾，石蜡固定，切片，显微镜下观察病理改变，病理损伤评级，按损伤的严重程度分为轻、中、重度，分别给1、2、3分，无病理损伤给0分。

结果显示，与正常对照组和模型对照组相比，SLE模型鼠的尿蛋白明显升高，杜仲多糖30mg/kg对SLE样综合征小鼠的尿蛋白有明显的降低作用(附图8)。

与正常对照组和模型对照组相比，SLE模型鼠的抗ds-DNA抗体和抗组蛋白抗体水平明显升高，杜仲总多糖30mg/kg和15mg/kg对SLE样综合征小鼠的抗ds-DNA抗体有明显的降低作用。杜仲总多糖30mg/kg对抗组蛋白抗体水平明显的降低作用(附图9，10)。

与正常小鼠和模型对照组相比，免疫使模型组小鼠的脾指数升高。与模型组相比，杜仲总多糖15mg/kg和阳性对照药泼尼松均抑制小鼠免疫后脾指数升高，但泼尼松对脾指数有过度抑制作用，脾指数低于正常小鼠(p＜0.001)。

与正常小鼠和模型对照组相比，免疫使模型组小鼠的胸腺指数升高。与模型组相比，杜仲总多糖15mg/kg对胸腺指数有明显的降低作用。

肾病理检测显示，正常组小鼠肾脏正常，模型对照小鼠基本正常。模型组小鼠肾脏肾小球的肿胀、肾小球囊腔缩小、肾小球细胞数的增多，杜仲总多糖对以上病变有明显的改善作用。与模型组小鼠相比，正常组小鼠肾小管正常，模型对照小鼠基本正常，模型组小鼠肾小管有明显的肿胀。由于模型对照组也给予弗氏完全佐剂，造成模型对照组小鼠与正常组相比肾脏有轻度损伤。杜仲总多糖对SLE样模型小鼠的肾小管肿胀也有改善作用(附图11，12，13，14，15)。

结果表明，杜仲总多糖在体内抑制SLE样综合征小鼠的抗自身抗体水平的升高(抗ds-DNA抗体和抗组蛋白抗体)，改善小鼠的体液免疫应答亢进，抑制脾和胸腺的肿大；杜仲总多糖降低SLE样综合征小鼠的尿蛋白水平，明显改善肾小球和肾小管的病变，有缓解SLE样小鼠的肾损伤的作用。

表2是BALB/c小鼠的脾指数和胸腺指数(X±SD)(n＝39)。

表3，是BALB/c小鼠肾病理损伤评级(X±SD)(n＝39)

表2

其中，*与SLE模型组比较P＜0.05；**与SLE模型组比较P＜0.01，***与SLE模型组比较P＜0.001。

表3

其中，*与SLE模型组比较P＜0.05；**与SLE模型组比较P＜0.01。

Claims (1)

1.杜仲总多糖作为唯一活性成分在制备防治系统性红斑狼疮药物中的用途；所述的杜仲总多糖通过下述方法和步骤制备：

杜仲药材粉碎后以95％乙醇冷浸提取三次，每次7天，滤过，药渣于室温下通风处晾干，然后用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液浓缩后流水透析3天，透析液浓缩至小体积后加乙醇至含醇量80％，沉淀用丙酮、乙醇洗涤后冷冻干燥即得总多糖提取物，收率达2％以上，多糖含量超过68％。

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