CN104784195A - 山茱萸环烯醚萜苷抗糖尿病的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了山茱萸环烯醚萜苷抗糖尿病的应用，属于生物医药技术领域。本发明从山茱萸中提取的主要活性成分环烯醚萜苷可用于制备治疗糖尿病的药物，解决西药降糖途径单一、副作用大等问题，为中药活性成分降糖提供依据。本发明的山茱萸环烯醚萜苷更安全、更有效、温和持久、无毒副作用，且作用机理多效应、多靶点、多功能，其疗效不仅在于降低血糖，同时在防治糖尿病并发症中也具有举足轻重的地位。因此，山茱萸环烯醚萜苷在改善糖尿病方面具有可观的开发和应用价值。

Description

山茱萸环烯醚萜苷抗糖尿病的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及山茱萸环烯醚萜苷抗糖尿病的应用。

背景技术

糖尿病是由胰岛素绝对或相对分泌不足而导致的以高血糖和糖、脂及蛋白质代谢紊乱为主要特征的一种慢性疾病。研究表明，全球约有2.85亿糖尿病患者并预计到2030年糖尿病发病率将达到4.38亿。因此，糖尿病药物的研发成为一个迫在眉睫的任务，而化学合成的口服降糖药是目前治疗糖尿病的主要方法，如，磺脲类、噻唑烷酮类、二甲双胍类和α葡萄糖苷酶抑制剂等，尽管这些降糖药在治疗糖尿病方面具有显著的疗效，但其会引发各种副作用、耐药性，且价格昂贵，尤其是大多化学合成的降糖药作用途径单一，而糖尿病是一种具有多种病因的慢性疾病，单纯的降糖疗法只能缓解症状，并不能解决其他诸如糖脂代谢紊乱，炎症、氧化应激等症状。因此，从天然中草药中寻找更安全、更有效的口服降糖药物，已成为糖尿病药物开发的方向。

胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是糖尿病发病的主要原因，而糖脂代谢紊乱、炎症反应、氧化应激及胰岛素信号转导通路异常是导致IR的主要机制。

山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，其味酸、涩，性微温，归肝、肾经，具有补益肝肾、涩精固脱、眩晕耳鸣、内热消渴等功效。其中，环烯醚萜苷为山茱萸中主要活性成分，开发利用山茱萸环烯醚萜苷的药理作用尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供山茱萸环烯醚萜苷抗糖尿病的应用，从山茱萸中提取的主要活性成分环烯醚萜苷可用于制备治疗糖尿病的药物，解决西药降糖途径单一、副作用大等问题，为中药活性成分降糖提供依据。

本发明是通过以下技术方案来实现：

山茱萸环烯醚萜苷在制备抗糖尿病的药物和/或保健品中的应用。

所述的药物和/或保健品为增强机体糖耐量、升高胰岛素敏感指数及降低胰岛素抵抗指数的药物和/或保健品。

所述的药物和/或保健品为改善脂代谢异常的药物和/或保健品。

所述的药物和/或保健品为降低总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白的含量的药物和/或保健品。

所述的药物和/或保健品为升高高密度脂蛋白胆固醇含量的药物和/或保健品。

所述的药物和/或保健品为通过抗氧化机制发挥降血糖作用的药物和/或保健品。

所述的药物和/或保健品为降低肝脏组织MDA含量、升高肝脏组织中SOD含量的药物和/或保健品。

所述的药物和/或保健品为降低炎症因子IL-6、TNF-α、CRP水平的药物和/或保健品。

所述的药物和/或保健品为干预胰岛素信号转导通路改善胰岛素抵抗的药物和/或保健品。

所述的药物和/或保健品为升高GLUT-4、INSR、PI3K及PKB mRNA表达的药物和/或保健品。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明应用山茱萸环烯醚萜苷分别处理各组小鼠，结果显示，经4周给药治疗后，各组小鼠的状况均有所改善，其中CIG-M、CIG-H、PC组小鼠体重均具上升趋势；山茱萸环烯醚萜苷各剂量组及PC组FBG均显著降低(P＜0.01)；FINS、ISI、HDL-C显著升高(P＜0.05)，IRI、T-CHO、TG、LDL-C则显著降低(P＜0.05)；OGTT及各脏器指数得到一定程度的改善，可见山茱萸环烯醚萜苷可以通过改善糖脂毒性、刺激胰岛β细胞或者修复损坏的胰岛β细胞释放更多的胰岛素来降血糖；山茱萸环烯醚萜苷各剂量组及PC均能降低TNF-α、IL-6、CRP、MDA含量，升高SOD含量，显示山茱萸环烯醚萜苷能够减少肝脏组织炎症因子的含量，降低脂质过氧化，提高抗氧化酶的活性，减少氧化应激对组织的损伤，进而增强组织抗氧化能力，通过多靶点改善胰岛素抵抗作用而降低血糖；组织病理学切片结果显示，山茱萸环烯醚萜苷可明显改善糖尿病小鼠肝细胞和胰腺细胞的病变程度；CIG-H和PC组均能显著上调小鼠骨骼肌GLUT-4、INSR、PI3K及PKB基因的mRNA表达(P<0.01)，说明山茱萸环烯醚萜苷可通过上调胰岛素信号通路中关键靶基因的表达量，改善小鼠胰岛素抵抗从而治疗糖尿病。因此，山茱萸环烯醚萜苷对高脂高糖饮食辅助低剂量注射链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型小鼠具有显著的降血糖作用。

与现有口服降糖药相比，该发明是从天然中草药山茱萸中提取的一类主要活性成分—环烯醚萜苷，该成分在降血糖方面更安全、更有效、温和持久、无毒副作用，且作用机理多途径、多靶点、多功能；本发明分别从糖尿病小鼠糖脂代谢、肝脏炎症与氧化应激、骨骼肌IR的关键靶基因mRNA表达等方面探究了引发IR的四个重要因素，糖脂毒性、肝脏及骨骼肌胰岛素抵抗，以期为解决现有降糖药作用途径单一、毒副作用较大等因素，为进一步开发山茱萸环烯醚萜苷干预糖尿病机制研究提供实验依据。

附图说明

图1为山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠糖耐量的影响结果图；

图2为山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠肝细胞肝脏的形态和变化的影响结果荧光显微照片；

其中，A1、A2分别表示正常对照组放大倍数为200倍和400倍的照片；B1、B2分别表示糖尿病模型组放大倍数为200倍和400倍的照片；C1、C2分别表示阳性对照组放大倍数为200倍和400倍的照片；D1、D2分别表示山茱萸环烯醚萜苷低剂量组放大倍数为200倍和400倍的照片；E1、E2分别表示山茱萸环烯醚萜苷中剂量组放大倍数为200倍和400倍的照片；F1、F2分别表示山茱萸环烯醚萜苷高剂量组放大倍数为200倍和400倍的照片；

图3为山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠胰腺组织病理影响的荧光显微照片；其中，其中，A正常对照组；B糖尿病模型组；C阳性对照组；D山茱萸环烯醚萜苷低剂量组；E山茱萸环烯醚萜苷中剂量组；F山茱萸环烯醚萜苷高剂量组；扩大倍数为400倍。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一、实验材料

山茱萸环烯醚萜苷的制备：准确称取山茱萸果肉粉末(过40目筛)1.00g，加入80％甲醇溶液21mL，于微波功率641W，超声功率360W条件下提取9min，抽滤，挥去甲醇，60～90℃石油醚萃取3次，减压蒸干，蒸馏水复溶，D101型大孔树脂纯化(吸附时间1.5h、洗脱时间2h、洗脱浓度50％乙醇，洗脱体积7BV)，洗脱液减压浓缩，真空冷冻干燥即得。

实验动物与饲养：SPF级雄性4周龄昆明小鼠90只，体重18±2g，购于西安交通大学医学院动物中心。饲养条件为25±2℃，相对湿度范围40～60％，自由摄食饮水。

实验试剂：链脲佐菌素(美国sigma公司)；盐酸二甲双胍缓释片(河北山姆士药业有限公司，国药准字：H20123024)；总胆固醇(T-CHO)测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司)；甘油三酯(TG)测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司)；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司)；低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司)；总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(货号：A001-1，南京建成生物工程研究所)；丙二醛(MDA)测试盒(货号：A003-1，南京建成生物工程研究所)；小鼠C反应蛋白酶联免疫分析试剂盒(北京科盈美科技有限公司)；小鼠肿瘤坏死因子α酶联免疫分析试剂盒(北京科盈美科技有限公司)；小鼠白细胞介素6酶联免疫分析试剂盒(北京科盈美科技有限公司)；小鼠胰岛素酶联免疫分析试剂盒(北京科盈美科技有限公司)；PrimeScript^TMRTreagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa(宝生物)，货号：RR047B)；DL2,000DNAMarker(TaKaRa(宝生物)，货号：3427Q)；Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseHPlus)(Tli RNaseH Plus)，ROX plus(TaKaRa(宝生物)，货号：RR82LR)。TRNzol总RNA提取试剂(天根生化科技(北京)有限公司)。

实验所用水均为Millipore超纯水，0.9％生理盐水；分析乙醇(天津市天力化学试剂有限公司)；多聚甲醛(北京化学试剂公司)；RNA保存液(天根生化科技(北京)有限公司)。

二、实验方法

1、药品溶液的制备

山茱萸环烯醚萜苷溶液的配制：精密称取山茱萸环烯醚萜苷提取物1125mg、2250mg、4500mg，加体积分数为0.9％的生理盐水溶解并定容至100mL，即得11.25mg/mL、22.50mg/mL、45.00mg/mL的悬浊液，避光保存于4℃冰箱中备用。

二甲双胍溶液的配制：现用现配，用研钵将二甲双胍缓释片研磨成粉末状，精密称取225mg，加体积分数0.9％的生理盐水溶解并定容至10mL，即得22.50mg/mL的溶液，避光保存于4℃冰箱中。

链脲佐菌素(STZ)溶液的配制：现用现配，避光下精密称取链脲佐菌素粉末90mg，加0.1mol/L柠檬酸钠缓冲溶液溶解并定容至10mL，即得9mg/mL的链脲佐菌素溶液，避光保存于4℃冰箱中。

高脂高糖饲料的配制：于66.98％的普通饲料中加入20％的蔗糖、10％的猪油、3％的胆固醇以及0.02％的猪胆盐即得。

2、糖尿病模型的建立

将购买的90只雄性昆明小鼠，适应性饲养3天后称重，按体重大小随机分为正常组和模型组两大组。其中，正常组小鼠10只，分两笼饲养，造模小鼠共80只，分15笼饲养，每笼5-6只小鼠，正常组喂养正常饲料，模型组饲喂高脂高糖饲料。

饲养一个月后，对模型组小鼠连续3天腹腔注射STZ(60mg/kg)，注射STZ5天后，所有小鼠禁食不禁水12h，尾静脉取血检测小鼠空腹血糖，若血糖值≥11.1mmol/L，则判定为糖尿病，对照组小鼠注射等体积生理盐水。

3、动物分组实验及给药

按照造模结果，将造模不成功的小鼠予以剔除，将60只造模成功的小鼠按照血糖值和体重随机分为5组，即糖尿病模型组(Diabetic model，DM)、阳性对照组(Positive control，PC)、山茱萸环烯醚萜苷低剂量组(Cornus officinalisiridoid glycoside low，CIG-L)、山茱萸环烯醚萜苷中剂量组(Cornus officinalisiridoid glycoside middle，CIG-M)、山茱萸环烯醚萜苷高剂量组(Cornusofficinalis iridoid glycoside high，CIG-H)，以及正常对照组(Normal control，NC)。给药浓度见表1。

表1 各组的试剂与浓度

4、标本的采集

①、血液样本的制备

给药4周后处死各组小鼠取样，处死前禁食不禁水12h，取样前乙醚麻醉各组小鼠，眼球取血，3000r·min^-1离心10min，分离血清，分装于1mL离心管中，密封且冻存于-20℃的冰箱中备用。

②、组织样本的制备

小鼠眼球取血后断颈处死，立即解剖，快速找到胰腺、肝脏、肾脏、脾脏和骨骼肌，并将它们完整的从其他组织中分离，生理盐水冲洗干净后，将胰腺放入4％的多聚甲醛溶液中以备光镜检测；将整片肝脏称重后，剪取0.5g肝脏组织以1:10的比例置于生理盐水中进行组织匀浆，其余肝脏组织放入4％的多聚甲醛溶液中以备光镜检测；分离出的脾脏和肾脏称重，测定肝脏、脾脏和肾脏脏器指数；小鼠大腿骨骼肌置于RNA保存液中，-20℃保存备用。

5、检测指标

1)空腹血糖测定

在给药的4周期间，分别于给药2周、4周后，尾静脉取血测定各组小鼠的空腹血糖值(FBG)，测定前对各组小鼠禁食不禁水12h。

2)口服糖耐量的测定

给药4周后，测定各组小鼠的口服糖耐量(OGTT)，测定前各组小鼠禁食不禁水12h，尾静脉取血测定空腹血糖，作为0min样本；测定空腹血糖后各组小鼠分别灌胃2g/kg的葡萄糖溶液，随后CIG-L、CIG-M、CIG-H各组分别灌以75mg/kg、150mg/kg、300mg/kg的山茱萸环烯醚萜苷溶液，PC组灌胃150mg/kg二甲双胍溶液，NC组和DM组分别灌胃等量的生理盐水；给药后分别于30min、60min、120min和180min测定各组小鼠的血糖值。

3)空腹血清胰岛素(FINS)的测定

灌胃4周后，取各组小鼠的血清测定血清胰岛素浓度，测定方法为“竞争性抑制法酶联免疫吸附实验”，具体操作按照试剂盒说明书，主要原理为待测样品中的胰岛素和酶标记的抗原共同竞争包被于微孔板上的抗体，形成标记抗原复合物，最终酶与底物产生黄色的颜色反应。当样品中胰岛素浓度较低时，与抗体结合的酶标记抗原就多，则黄色深，反之，亦然。通过在450nm波长下读取吸光值来绘制标准曲线，并据标准曲线推算出待测样品的浓度。

4)胰岛素抵抗指数和敏感指数的测定

按照HOMA模型等引进的方法，胰岛素抵抗指数(HOMA-IRI)和胰岛素敏感指数(ISI)的计算方法为：HOMA-IRI＝(FINS×FBG)/22.5，HOMA-ISI＝ln[1/(FINS×FBG)]。

5)血清血脂四项检测

血脂四项包括总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，T-CHO含量的测定采用COD-PAP法，TG含量的测定采用GPO-PAP法，HDL-C和LDL-C含量的测定均采用直接法测定，实验步骤按照试剂盒说明书操作。

6)肝脏、肾脏和脾脏脏器指数的测定

准确称取小鼠肝脏、肾脏和脾脏脏器的湿重，按照公式“脏器指数＝(脏器湿重/小鼠体重)×100％”计算各组小鼠脏器指数。

7)肝脏炎症因子的测定

肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)含量的测定，均采用竞争性抑制法酶联免疫吸附(Elisa)法，取肝脏组织匀浆的上清液，按照试剂盒操作说明进行操作。

8)氧化应激指标的检测

总超氧化物歧化酶(T-SOD)按照羟胺法测定，丙二醛(MDA)采用TBA法测定，具体的操作步骤按照试剂盒说明书操作。

9)肝脏和胰腺组织病理学观察

①取肝脏组织和胰腺组织分别于10％福尔马林中固定24h，流水冲洗，酒精梯度(50％乙醇→70％乙醇→80％乙醇→90％乙醇→95％乙醇→100％乙醇→100％乙醇)脱水，二甲苯透明。

②石蜡包埋：将上述已透明的肝脏组织和胰腺组织置于溶化的石蜡中，待石蜡完全浸入组织后进行包埋；

③切片：将包埋好的组织进行切片，厚度为4μm，置于用防脱剂处理过的载玻片上，60℃烘箱中烘片12h；

④HE染色：苏木精染色10min，自来水冲洗至泛蓝，酸酒精分色5s，酒精梯度洗脱；伊红染色10min，酒精梯度脱色，二甲苯透明；

⑤中性树胶封片，荧光显微镜下观察各组小鼠肝脏、胰腺病理学切片并拍照保存。

10)山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠骨骼肌GLUT-4、INSR、PI3K及PKBmRNA表达的测定

(1)样本总RNA的提取

采用TRNzol总RNA提取试剂进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

把组织放入已预冷的研钵中进行研磨,待组织样本成粉末状后：

①加入Trizol，室温保存5分钟；

②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；

③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管,加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；

⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀,加入DEPC处理过的水溶解沉淀，冻存于-80℃。

(2)总RNA的浓度和纯度测定

采用Nanodrop2000紫外分光光度计测定230、260、280nm下的吸光度。RNA浓度(ng/uL)＝(OD₂₆₀/OD₂₈₀，OD₂₆₀/₂₃₀)。

取上述总RNA提取液5μL，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统观测结果并照相保存，根据结果鉴定所提RNA是否存在特征性条带。

(3)RNA逆转录合成cDNA

采用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

①去除基因组DNA反应

按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。

表2 反转录反应体系I

将上述样品混匀，42℃孵育2分钟。

②反转录反应

为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装10μl到每个反应管中，轻柔混匀后立即进行反转录反应。

表3 反转录反应体系Ⅱ

将上述所加样37℃孵育15分钟，85℃孵育5秒，即获得cDNA，存放-20℃冰箱备用。

(4)Real Time PCR

①引物设计：real-time PCR检测目的基因引物均由北京Invitrogen公司合成。四种目的基因的引物序列见表4：

表4 引物序列

②反应体系：用Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)，ROX plus进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序：95°30sec，(95℃5sec，60℃40sec)×45个循环。见表5real-time反应体系(20ul)：

表5 real-time反应体系

利用ABI 7500型荧光定量PCR仪进行上述扩增过程，以GAPDH作为内对照，相对定量2^-△△CT法进行数据分析：

三、统计学分析

实验数据应用SPSS16.0统计软件分析，各组数据均以均数±标准差()表示，组间比较用One way ANOVA方差分析，组间两两显著性比较采用LSD多重比较，P＜0.05表示统计学具有显著性差异，P＜0.01表示具有极显著性差异。

四、实验结果

1、山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠糖脂代谢的影响

1)各组小鼠一般状态

高脂高糖饲料联合低剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)5天后，尾静脉取血测其空腹血糖值，实验前禁食不禁水12h，若空腹血糖值≥11.1mmol·L^-1，则认为造模成功。在80只小鼠中，60只小鼠空腹血糖值超过11.1mmol·L^-1，造模成功率为75％。

给药期间，NC组小鼠状态良好，反应灵敏，活动正常，毛色有光泽，体重稳定持续上升，尿量正常；模型组小鼠出现明显的多饮、多食、多尿症状，精神萎靡、倦怠，行动迟缓，反应迟钝，喜扎堆蜷卧、嗜睡，皮毛干枯凌乱无光泽；给药2周后，CIG-L、CIG-M、CIG-H剂量组及PC组均有不同程度的改善作用，其中，CIG-H组和PC组改善作用明显，小鼠活动量增加，被毛光泽。

2)各组小鼠体重的变化

表6 山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠给药后体重的影响(n＝10，)

注：与正常组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阳性组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

从表6可以看出，给药前和给药一周后，各组小鼠体重无明显差异；给药两周后，DM组及CIG-M、CIG-H组小鼠体重明显减轻，与NC组小鼠体重之间有显著差异(p＜0.05)；给药3～4周后，DM组小鼠体重持续下降，而CIG-M、CIG-H组体重回升，其中CIG-H组与DM组之间达到显著差异(p＜0.05)。

3)各组小鼠空腹血糖的变化

如表7所示，给药2周后，CIG-M、CIG-H组以及PC组均较DM组空腹血糖降低且有极显著差异(P＜0.01)，与NC组相比，造模小鼠(DM组、CIG-L、CIG-M、CIG-H、PC组)空腹血糖(FBG)明显升高(P＜0.01)，而PC组与CIG-L、CIG-H组有显著差异(P＜0.05)，与CIG-M组没有达到显著差异。给药4周后，CIG-L、CIG-M、CIG-H各剂量组及PC组均较模型组空腹血糖(FBG)显著降低(P＜0.01)，且CIG-H组空腹血糖值(FBG)与PC组达到显著差异(P＜0.01)，说明山茱萸环烯醚萜苷高剂量组降糖作用优于二甲双胍阳性组。

表7 山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠空腹血糖的影响(n＝10，)

注：与正常组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阳性组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

4)山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠口服糖耐量的影响

如表8及图1所示，各组小鼠的血糖值均呈现先升高后降低的趋势，但DM组血糖值一直高于给药组；在0min时，DM组小鼠血糖值与其他各组均具有极显著差异(p＜0.01)，各给药组与NC组间也存在极显著差异(p＜0.01)，而PC组与NC组、DM组及CIG-H组间呈极显著差异(p＜0.01)，与CIG-L、CIG-M组差异没有统计学意义；在30min后，由于各组小鼠灌胃葡萄糖且灌药效还没有发挥作用，因此，各组小鼠的血糖值均增加；60min时，各组小鼠的血糖值均有所下降，但仅有PC组、CIG-H组及NC组与DM组有极显著差异(p＜0.01)；120min、180min各组小鼠的血糖值仍在下降，180min基本达到稳定，除了CIG-L组与DM组血糖值没有达到显著差异外，其他各组均比DM组血糖值低且达到显著差异(p＜0.05)，CIG-M、CIG-H剂量组血糖值比PC组低，但未达到统计学差异；表明山茱萸环烯醚萜苷具有改善各组小鼠糖耐量的作用，且作用效果较优于市面上的二甲双胍降糖药。

表8 山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠糖耐量的影响(n＝10，)

注：与正常组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；

与阳性组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

5)各组小鼠空腹胰岛素、胰岛素敏感指数和抵抗指数的变化

如表9所示，给药4周后，与DM组相比，各给药组空腹胰岛素水平均升高，CIG-M、CIG-H及PC组与其具有极显著差异(p＜0.01)；PC组、CIG-H组与NC组相比无明显差异；DM组、CIG-L组、CIG-M组与PC组均具有极显著差异(p＜0.01)。

给药4周后，与DM组相比，各给药组小鼠胰岛素敏感指数(HOMA-ISI)升高，且PC组、CIG-M、CIG-H组均与DM组呈显著差异(p＜0.05)，而胰岛素抵抗指数(HOMS-ISI)降低且各组与其具有显著差异(p＜0.05)；与NC组相比，各给药组小鼠胰岛素敏感指数(HOMA-ISI)降低，胰岛素抵抗指数(HOMA-IRI)升高，均达到极显著差异(p＜0.01)；CIG-L组、CIG-M组与PC组的胰岛素敏感指数(HOMA-ISI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IRI)均无统计学差异。

表9 山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠给药后的空腹胰岛素水平、胰岛素敏感指数及胰岛素抵抗指数的影响(n＝10，)

注：与正常组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阳性组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

6)山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠血清血脂四项的影响

如表10所示，与DM组相比，各给药组小鼠T-CHO、TG、LDL-C均有降低的趋势，其中CIG-M、CIG-H组均与DM组有显著差异(P＜0.05)，对于甘油三脂(TG),PC组、CIG-L组与DM组呈极显著差异(P＜0.01)，而HDL-C则相比DM组升高，且PC组、CIG-L、CIG-M、CIG-H组与其具显著差异(P＜0.05)；CIG-L、CIG-M、CIG-H各剂量组T-CHO、TG、HDL-C与PC组均无统计学差异，LDL-C的CIG-M、CIG-H组与PC组具有极显著差异(P＜0.01)，说明山茱萸环烯醚萜苷具有降低糖尿病小鼠T-CHO、TG、LDL-C、升高HDL-C的水平，改善脂代谢异常的作用。

表10 山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠血脂水平变化影响(n＝10，)

注：与正常组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阳性组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

糖脂毒性是糖尿病发生IR的已知主要机制，长期高血糖对机体造成一种病理的、持续的、不可逆的状态，成为“葡萄糖毒性”，一方面加重糖尿病的发生、发展，另一方面引起各种糖尿病血管病变。正常状态下，胰岛素与其受体结合，激活下游细胞内一系列磷酸化过程，使GLUT-4从细胞内转移到细胞膜上，完成细胞内葡萄糖的氧化分解，脂代谢紊乱将破坏这一过程，使葡萄糖大量堆积于细胞外，细胞摄入葡萄糖减少，从而加重高血糖；同时也使糖尿病大血管并发症发生率及死亡率显著升高。因此，可通过降糖、降脂措施改善和修复胰岛β细胞，降低胰岛素抵抗，从而延缓和改善糖尿病的发生。

本研究中，高脂高糖饮食辅助低剂量注射链脲佐菌素(STZ)造成的糖尿病模型小鼠，出现明显的“三多一少”症状，FBG达27.71mmol/L，FINS、ISI、HDL-C显著降低，IRI、T-CHO、TG、LDL-C明显增高，OGTT和各脏器指数异常，说明机体出现糖脂代谢紊乱，内脏器官出现一定的损伤、胰岛素抵抗。经4周给药治疗后，各组小鼠的状况均有所改善，其中CIG-M、CIG-H、PC组小鼠体重均具上升趋势；山茱萸环烯醚萜苷各剂量组及PC组FBG均显著降低(P＜0.01)；FINS、ISI、HDL-C显著升高(P＜0.05)，IRI、T-CHO、TG、LDL-C则显著降低(P＜0.05)；OGTT及各脏器指数得到一定程度的改善，可见山茱萸环烯醚萜苷可以通过改善糖脂毒性、刺激胰岛β细胞或者修复损坏的胰岛β细胞释放更多的胰岛素来降血糖。

7)山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠脏器指数的影响

实验结果如表11所示，CIG-L、CIG-M、CIG-H及PC组肝脏指数与DM组相比，具有显著降低的趋势(p＜0.01)，PC组与CIG-L组无显著差异，与CIG-M、CIG-H剂量组具有极显著差异(P＜0.01)；CIG-L、CIG-M、CIG-H组脾脏指数与DM组相比，具有明显降低的趋势(P＜0.05)，且与NC组对应数据极为相近(p＞0.05)，PC组与各剂量组也无统计学差异；CIG-L、CIG-M及PC组肾脏指数与DM组具有显著差异(P＜0.05)，且与NC组无显著差异，说明山茱萸环烯醚萜苷对链脲佐菌素辅助高脂高糖饲料引起的糖尿病引发的脏器病变具有一定的改善作用。

表11 山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠脏器指数变化情况(n＝10，)

注：与正常组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阳性组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

2、山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠肝脏炎症、氧化应激及脏器指数的影响

1)山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠肝脏组织炎症因子TNF-α、IL-6、CRP影响

如表12所示，与DM组相比，各给药组的三个肝脏炎症因子IL-6、TNF-α、CRP均降低，其中CIG-M、CIG-H组与模型组存在显著差异(P＜0.05)；与NC组相比，CIG-M、CIG-H组IL-6、CRP与其无统计学差异，而在TNF-α因子中，CIG-L、CIG-M组均与NC组有显著差异(P＜0.05)；与PC组相比，CIG-L组IL-6炎症因子与PC组无显著差异，而CIG-M、CIG-H与PC组有极显著差异(P＜0.01)，CIG-L、CIG-M、CIG-H组TNF-α因子与PC组无统计学差异，CIG-H组CRP与PC组存在极显著差异(P＜0.05)，CIG-L、CIG-M组与其无显著性差异，说明山茱萸环烯醚萜苷高剂量组具有明显治疗小鼠肝脏炎症的作用，且治疗效果强于二甲双胍阳性对照组。

表12 山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠肝脏组织IL-6、TNF-α、CRP水平变化(n＝10，)

注：与正常组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阳性组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

2)山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠肝脏组织MDA含量、SOD水平的影响

如表13所示，相比NC组，DM组MDA活性显著升高(P＜0.01)，SOD活性急剧下降(P＜0.01)；与DM组相比，CIG-L、CIG-M、CIG-H组及PC组MDA含量降低，CIG-M组降低效果最明显(P＜0.01)且与NC组相应数据极为接近，CIG-L、CIG-M、CIG-H组及PC组SOD含量升高且CIG-H组与NC组无显著差异(p＞0.05)；与CIG-M、CIG-H组与PC组无统计学差异，而MDA和SOD均为反应肝脏氧化应激的指标，MDA是脂质过氧化反应的重要产物之一，SOD对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，因此，通过本实验可以证实山茱萸环烯醚萜苷可通过抗氧化机制发挥显著的降血糖作用。

表13 山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠肝脏组织丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性变化(n＝10，)

注：与正常组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阳性组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

肝脏是机体糖、脂代谢的主要场所，是发生IR的主要组织，而肝脏IR及代谢功能障碍是发生糖尿病的重要原因，因此，可通过改善肝脏IR及保护其功能来干预糖尿病。流行病学资料表明，IR的发生常与炎症因子呈正相关，大量研究表明，TNF-α参与IR的发生并在其发病机制中起重要作用，IL-6参与肝脏IR的形成，IL-6可干预饮食诱导的肥胖小鼠，进而增强胰岛素敏感性，CRP是由肝脏产生的一种重要炎症因子，CRP可导致靶细胞(肝脏、肌肉、脂肪组织)对胰岛素敏感性降低，形成高血糖、高血脂，进而加重胰岛β细胞的负担，产生胰岛素抵抗。

细胞炎症因子TNF-α、IL-6引起胰岛素抵抗的主要机制是通过胰岛素信号转导通路而作用，TNF-α、IL-6可通过激活JNK、IKK等阻碍INSR与IRS正常的酪氨酸磷酸化，促进其丝氨酸和苏氨酸磷酸化，导致INSR与IRS结合能力下降，亦能抑制PI3K与IRS的结合，进而抑制PI3K、GLUT的活性，干扰GLUT-1和GLUT-4的表达、合成及转位，使胰岛素信号传导受阻，导致胰岛素生物学功能下降，葡萄糖摄取和利用减少，产生IR。此外，胰岛素抵抗常常伴随体内活性氧(ROS)增加或减少，导致ROS生成和清除失衡，进而引起组织氧化应激水平的加剧，ROS在增加脂质过氧化物方面具有重要作用，MDA是一种脂质过氧化物，可反映肝脏受自由基攻击的损伤程度，SOD是机体清除细胞内自由基的一种抗氧化酶，其活力的高低可反映机体清除自由基的能力。同时，大量研究表明，IR状态下，氧化应激与炎症反应见可交互作用，TNF-α、IL-6等炎症因此刺激ROS产生，ROS可激活细胞内多种信号转导机制，最终导致IR的发生。

实验表明，糖尿病模型组小鼠肝脏组织TNF-α、IL-6、CRP、MDA显著升高(P<0.05)，SOD活性则显著降低(P<0.01)，表明肝脏组织出现炎症和氧化应激反应，山茱萸环烯醚萜苷各剂量组及PC均能降低TNF-α、IL-6、CRP、MDA含量，升高SOD含量，其中CIG-M、CIG-H组具有显著差异(P<0.05)，但是，对于TNF-α、CRP炎症因子，PC组对其虽具有一定程度的改善作用却未达到显著性水平，推测其原因可能是所选的阳性药二甲双胍作用机理主要是增强胰岛素敏感性，其作用靶点并不针对炎症因子而致，山茱萸环烯醚萜苷能够减少肝脏组织炎症因子的含量，降低脂质过氧化，提高抗氧化酶的活性，减少氧化应激对组织的损伤，进而增强组织抗氧化能力，通过多靶点改善胰岛素抵抗作用而降低血糖。

3、山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠肝脏和胰腺组织病理形态的影响

1)小鼠肝脏病理学形态变化

HE染色后，荧光显微镜下观察肝脏组织形态和变化。如图2所示：

NC组：小鼠肝脏结构完整，肝细胞在中央静脉周围呈放射状分布，排列规则。肝血窦规则，肝细胞呈多边形，形态正常，胞浆分布均匀。

DM组：小鼠肝细胞出现脂肪变性，排列紊乱，胞浆溶解、分离，出现透明的空泡，胞浆内有大小不等的游离脂肪小滴蓄积。

PC组：肝细胞排列紊乱，肝细胞脂肪变性没有明显的改善，部分胞核和胞浆分离。

CIG-L组：小鼠肝细胞脂肪变性减少，肝细胞排列较DM组相对好转，但胞浆空泡现象较严重。

CIG-M组：小鼠肝脏结构清晰，脂肪变性和空泡变性现象减少，胞浆分离现象好转。

CIG-H组：小鼠肝脏结构清晰，肝细胞脂肪变性和空泡现象明显减少，肝细胞排列较规则。

通过对比得出，山茱萸环烯醚萜苷对糖尿病小鼠的肝脏具有一定的保护作用，其中中高剂量组优于二甲双胍组。

2)小鼠胰腺病理学形态变化

HE染色后，荧光显微镜高倍下观察各组小鼠胰腺的形态和变化。如图3所示：

NC组：视野中胰岛和外分泌腺间界限清楚，胰岛体积大，胰岛内细胞较多且排列整齐，胞浆均匀。

DM组：视野中胰岛体积、数目减少，胰岛形态不规则，细胞空泡变性，胰岛受到破坏，胰岛素抵抗较为严重。

PC组：视野中胰岛和外分泌腺间界限较清楚，胰岛细胞数目增多，胞浆内细胞空泡变性减轻。

CIG-L组：视野中胰岛和外分泌腺间界限较清楚，胰岛内细胞数目轻度增多，体积略微增大，空泡变性减少，胰岛细胞有修复的趋势。

CIG-M组：视野中胰岛和外分泌腺间界限较清楚，胰岛内细胞数目中度增多，体积增大较显著，少见空泡变性，胞浆较均匀。

CIG-H组：视野中胰岛和外分泌腺间界限清楚，胰岛体积显著增大，细胞数目明显增多，偶见空泡变性，胞浆较均匀。

本实验通过观察肝脏的组织病理切片发现，模型组小鼠肝脏出现明显的脂肪变性、空泡，胞浆溶解，脂滴蓄积；光镜下显示，CIG-M、CIG-H剂量组肝脏结构清晰，肝细胞脂肪变性和空泡现象明显减少，肝细胞排列较规则，CIG-L及PC组改善现象不明显，推测其机制可能是肝脏脂质沉积导致肝脏及外周组织对胰岛素敏感性降低、或引发胰岛素抵抗，进而影响胰岛素信号传导通路，结果表明山茱萸环烯醚萜苷可使肝脏脂肪变性和空泡得以控制和改善，显示其对肝脏具有一定的保护作用。

观察各组小鼠的胰腺组织切片发现，模型组小鼠胰岛数量和体积明显减少，出现空泡变性；山茱萸环烯醚萜苷各剂量组及二甲双胍阳性对照组胰岛体积和数量减少有所好转，空泡变性减轻，其中CIG-H组胰岛体积增加明显，但与NC组相比还有一定差距，结果表明山茱萸环烯醚萜苷在一定程度上可修复受损的胰岛细胞，缓解胰岛素抵抗，但不能完全逆转高脂高糖辅助小剂量多次注射STZ导致的病理损伤。

4、山茱萸环烯醚萜苷对各组小鼠骨骼肌GLUT-4、INSR、PI3K及PKBmRNA表达的影响

各组小鼠骨骼肌组织GLUT-4、INSR、PI3K及PKB mRNA的表达如表14所示，与NC组相比，DM组小鼠骨骼肌组织GLUT-4、INSR、PI3K及PKB mRNA的相对表达含量均下调(P＜0.01)；与DM组相比，CIG及PC组各项指标mRNA相对表达含量显著上调(P＜0.01)，其中CIG及PC组INSR与NC组无统计学差异(P＞0.05)；CIG组PKB、PI3K mRNA相对表达含量比PC组上调但未达到显著差异，说明山茱萸环烯醚萜苷能上调糖尿病小鼠骨骼肌PKB、INSR、GLUT-4及PI3K mRNA的表达量。

表14 Real Time PCR检测各组小鼠骨骼肌组织PKB、INSR、GLUT-4及PI3K mRNA的相对表达含量(n＝10，)

注：与正常组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阳性组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

糖尿病发病的主要原因是肌肉、脂肪等外周组织和肝脏的胰岛素抵抗，IR除与胰岛素含量有关外，更主要的可能还与胰岛素信号转导途径有关，GLUT-4、IRS、PI3K、PKB是胰岛素信号转导途径和葡萄糖摄取的关键靶基因，其中任何一个环节出现问题，都可能引发IR，从分子水平探究药物干预IR机制已成为国内外学者研究热点。

GLUT-4是主要的葡萄糖转运蛋白，承担着全身50-80％的葡萄糖转运量，葡萄糖需通过GLUT-4的携带，才能穿过细胞膜的脂质双分子层并发挥作用，在骨骼肌组织中葡萄糖的转运过程是其糖代谢的重要限速步骤，GLUT-4表达水平下调或上调可导致外周组织对胰岛素的敏感性降低或引发外周组织胰岛素抵抗。正常状态下，CLUT-4存在于细胞内对胰岛素敏感的(骨骼肌、心肌、脂肪)囊泡细胞膜上，当受胰岛素刺激时，GLUT-4可从细胞外膜易位到细胞质膜上发挥作用。

INSR是胰岛素发挥功能的第一个效应分子，分布于机体各组织细胞膜上，胰岛素经血液循环到达相应靶器官后与其细胞表面INSR结合，同时在酪氨酸蛋白激酶的作用下引起INSR磷酸化，进而影响胰岛素信号转导通路，因此，增强INSR酪氨酸激酶活性使改善IR的重要途径。

PI3K的表达或活性降低，会使胰岛素信号无法通过PI3K通路进行传递，导致葡萄糖的摄取和利用受阻，导致IR。

PKB是胰岛素信号通路中的一个关键分子，通过其级联反应可使胰岛素发挥相应的生理效应，如刺激CLUT-4转位，糖原合酶，调节糖原合成，促进细胞摄取葡萄糖等。

本实验结果显示，糖尿病模型组小鼠骨骼肌GLUT-4、INSR、PI3K及PKBmRNA表达水平显著降低，表明调节糖代谢的胰岛素信号转导出现障碍，进而导致IR；CIG-H和PC组均能显著上调小鼠骨骼肌GLUT-4、INSR、PI3K及PKB基因的mRNA表达(P<0.01)，说明山茱萸环烯醚萜苷可通过上调胰岛素信号通路中关键靶基因的表达量，改善小鼠胰岛素抵抗从而治疗糖尿病。

综上所述，本研究通过观察山茱萸环烯醚萜苷对糖尿病小鼠糖脂代谢、肝脏炎症与氧化应激、骨骼肌IR的关键靶基因mRNA表达等方面的作用，探究了引发IR的四个重要因素，糖脂毒性、肝脏和骨骼肌胰岛素抵抗，以期为山茱萸环烯醚萜苷干预糖尿病机制研究提供实验依据。

Claims (10)

1.山茱萸环烯醚萜苷在制备抗糖尿病的药物和/或保健品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为增强机体糖耐量、升高胰岛素敏感指数及降低胰岛素抵抗指数的药物和/或保健品。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为改善脂代谢异常的药物和/或保健品。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为降低总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白的含量的药物和/或保健品。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为升高高密度脂蛋白胆固醇含量的药物和/或保健品。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为通过抗氧化机制发挥降血糖作用的药物和/或保健品。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为降低肝脏组织MDA含量、升高肝脏组织中SOD含量的药物和/或保健品。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为降低炎症因子IL-6、TNF-α、CRP水平的药物和/或保健品。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为干预胰岛素信号转导通路改善胰岛素抵抗的药物和/或保健品。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为升高GLUT-4、INSR、PI3K及PKB mRNA表达的药物和/或保健品。