CN106214696A - 蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用。本发明的有益效果为：蕨麻多糖是蕨麻的主要化学成分之一，具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抑菌、降血糖等生物学活性，其生产制备工艺简单、易于获得，体内及体外毒理学实验均未发现其具有损伤毒性。本发明经过试验验证，表明在慢性镉沉积所致的肾损伤中，蕨麻多糖具有显著增加组织细胞的抗氧化、抗凋亡能力，能够使镉损伤所致的脏器指数降低，减轻慢性炎症反应、脂质过氧化、组织纤维化等，对慢性镉沉积所致的肾脏损伤具有保护作用。

Description

蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药应用技术领域，具体涉及蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用。

背景技术

镉（Cd）作为有毒重金属是常见的环境污染物之一，是机体非必须元素，在自然界中常与锌元素共同存在。当环境受到Cd污染时，Cd可经食物链在生物体内富集，在人体内的半衰期长达10-20年。长期低剂量接触可引起多器官毒性损伤，甚至致畸致突变，因而受到毒理学界的广泛关注，国际癌症研究机构确定Cd为人类及实验动物的肺癌和前列腺癌的确认致癌物，美国毒物管理委员会（ATSDR）已将Cd列为第6位危及人类健康的有毒物质。关于Cd的致病机制研究仍不完全清楚，大多数学者认为与其所致的氧化损伤有关。它可引起生物膜结构的脂质过氧化，还可与还原型巯基结合并改变细胞内的抗氧化系统，诱导机体产生过量的ROS，同时消耗还原型谷胱甘肽、半胱氨酸等抗氧化物质。Cd引起的脂质过氧化可改变细胞膜的通透性、致线粒体膜流动性下降、线粒体内酶活力下降、释放促凋亡蛋白等。镉在人或动物体内主要经肾脏代谢，长期慢性镉沉积可导致肾脏组织活性氧水平升高，诱发肾脏的慢性炎症及脂质过氧化，引起肾小球及肾小管纤维化，损伤肾脏从而影响肾功能。目前尚无具有特殊疗效的抗慢性镉损伤的中药材。

蕨麻，乃蔷薇科植物鹅绒委陵菜（Potentilla anserina L）的块根，属多年生草本植物。藏名又曰戳玛、卓老洒曾、延寿草、仙人果等。主产于我国华北、东北和西北等地域，遍布于海拔3000多米的青藏高原。就药性而言，蕨蔴性“甘、温”，具有养阴生津、益胃健脾、益补血气、兼有止血、止泻、止咳之功效，能治妇人崩中、下血、吐血、痈疮疟疾、脾虚腹泻、下痢等症。藏医学著作《月王药诊》中治“小肠出血、干燥、粘连胃壁、眼不闭合之症”；在《四部医典》中亦记载蕨麻治疗出血症及脾胃虚弱等疾病。近年来蕨麻在中医临床应用上也有了新的突破，如用以治疗狼疮性肾炎、慢性肾衰竭、大病初愈、身体虚弱等。在民间它既可当药物治病，又可作为养生保健食品，具有很高的药用和营养价值。蕨麻含有多种化学成分，诸如多糖、萜类、酚类、黄酮类、氨基酸类等，其中对蕨麻多糖的研究相对广泛，较多实验团队已证实其具有明确的生物学活性，可发挥抗氧化应激、抗衰老、调节免疫、抗炎、抗菌等多方面的作用。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了蕨麻多糖（PAP）的新应用，具体为蕨麻多糖对慢性重金属镉沉积所致的肾损伤具有预防及保护作用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用。

进一步的，上述的蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用，所述治疗肾损伤的药物为治疗由慢性镉沉积所致的肾损伤的药物。

进一步的，上述的蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用，所述药物中，蕨麻多糖的应用形式为水溶液，保护浓度为10mg/kg。

进一步的，上述的蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用，所述蕨麻多糖是由以下方法制备的：

1）称取蕨麻，洗净、自然干燥、粉碎，加石油醚至蕨麻与石油醚的料液比为1g：10 ml，40℃回流浸提2h脱去表面脂肪，得到脱脂蕨麻滤渣；

2）将步骤1）得到的脱脂蕨麻滤渣定量称取，加入水作溶剂，以料液比1:25、100℃回流浸提1h，重复3次，合并滤液并浓缩至原滤液体积的1/4，得到浓缩液；

3）将步骤2）得到的浓缩液，加入4倍体积的浓度为95%的乙醇，静置24h离心取絮状沉淀，依次用4倍体积的无水乙醇及丙酮分别洗涤沉淀2次，冷冻干燥得到蕨麻粗多糖；

4）将步骤3）得到的蕨麻粗多糖加蒸馏水配制成质量体积百分比为0.5%的蕨麻粗多糖溶液，将蕨麻粗多糖溶液与配置好的sevag试剂，即体积比为5:1的氯仿-正丁醇混合溶液，以料液比1g:1ml混合，震荡0.5h后静置、分离，除去蛋白，冷冻干燥获得蕨麻精多糖。

本发明的有益效果为：蕨麻多糖是蕨麻的主要化学成分之一，具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抑菌、降血糖等生物学活性，其生产制备工艺简单、易于获得，体内及体外毒理学实验均未发现其具有损伤毒性。本发明经过试验验证，表明在慢性镉沉积所致的肾损伤中，蕨麻多糖具有显著增加组织细胞的抗氧化、抗凋亡能力，能够使镉损伤所致的脏器指数降低，减轻慢性炎症反应、脂质过氧化、组织纤维化等，对慢性镉沉积所致的肾脏损伤具有保护作用。

附图说明

图1为各组小鼠肾脏形态。

图2为小鼠肾脏组织切片HE染色示意图（400×）：其中，A. 正常对照组肾脏组织结构；B. 实验对照组肾脏组织结构；C.单纯蕨麻多糖组肾脏组织结构；D. 蕨麻多糖保护组肾脏组织结构。

图3为小鼠肾脏组织fas蛋白免疫组化染色示意图（400×）：其中，A. 正常对照组肾脏组织免疫组化结果；B. 实验对照组肾脏组织免疫组化结果；C.单纯蕨麻多糖组肾脏组织免疫组化染色结果；D.蕨麻多糖保护组肾脏组织免疫组化结果。

图4为小鼠肾脏组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化染色示意图（400×）：其中，A. 正常对照组肾脏组织免疫组化染色结果；B. 实验对照组肾脏组织免疫组化染色结果；C. 单纯蕨麻多糖组肾脏组织免疫组化染色结果；D.蕨麻多糖保护组肾脏组织免疫组化染色结果。

图5为小鼠肾脏组织Masson’s染色示意图（400×）：其中，A. 正常对照组肾脏组织Masson’s染色结果；B. 实验对照组肾脏组织Masson’s染色结果；C. 单纯蕨麻多糖组肾脏组织Masson’s染色结果；D.蕨麻多糖保护组肾脏组织Masson’s染色结果。

图6为小鼠肾脏组织抗/促凋亡蛋白水平变化示意图：其中，A. 免疫印迹蛋白表达结果；B. bcl-2/bax比值水平变化（注：* 与正常对照组相比， * P<0.05，** P<0.01；# 与实验对照组相比，## P<0.01）。

具体实施方式

实施例1：

蕨麻多糖的制备方法及含量测定：

称取蕨麻，洗净、自然干燥、粉碎，加石油醚（蕨麻与石油醚的料液比为1g：10 ml）40℃回流浸提2h脱去表面脂肪，定量称取滤渣，加入水作溶剂，以料液比1:25、100℃回流浸提1h，重复3次，合并滤液并浓缩至原滤液体积的1/4；将浓缩液加入4倍体积95%的乙醇，静置24h离心取絮状沉淀，依次用4倍体积的无水乙醇及丙酮分别洗涤沉淀2次，冷冻干燥得到蕨麻粗多糖。将蕨麻粗多糖加蒸馏水配制成质量体积百分比为0.5%蕨麻粗多糖溶液，将配置好的sevag试剂（氯仿：正丁醇=5:1，v/v）与粗多糖溶液以1:1混合，震荡0.5h后静置、分离，除去蛋白，冷冻干燥获得精多糖。以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定蕨麻精多糖含量。葡萄糖标准品液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，分别加入10ml比色皿中，各自补水至2.0ml，加5%苯酚溶液1ml，浓硫酸5ml，40℃水浴0.5h，冷却后在280nm波长处测定吸光度，计算得到回归方程为：y=0.1965x+0.0422，R=0.9902。根据回归方程计算得到蕨麻多糖含量为60.4%。

实施例2：

蕨麻多糖对慢性镉沉积所致肾损伤的保护作用：

1.实验分组及步骤：

雄性BalB/c小鼠40只（20±2g），随机分为正常对照组、实验对照组、单纯蕨麻多糖组和蕨麻多糖保护组。蕨麻多糖保护组小鼠给予蕨麻多糖水溶液腹腔注射（每天上午9:00腹腔注射10mg/kg蕨麻多糖水溶液，共30d）；给予氯化镉水溶液腹腔注射（连续注射多糖5天后，每天下午4：00注射2mg/kg氯化镉水溶液，共25d）。实验对照组每天上午注射等量的生理盐水，下午注射2mg/kg氯化镉水溶液。单纯蕨麻多糖组每天上午注射10mg/kg蕨麻多糖，下午注射等量的生理盐水溶液。正常对照组每天均注射等量的生理盐水。

给药30d，处死前一天，禁食不禁水，处死前称重。取血测定血尿素氮（BUN）水平，经心脏行生理盐水灌注，取脏器称重并计算脏器指数。左侧肾脏固定、包埋、制备4厚度的组织切片，分别做HE染色、fas蛋白及α-SMA蛋白免疫组化染色、Masson’s染色并摄片；右侧肾脏制备组织匀浆，测定组织匀浆还原型谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（MDA）水平，提取组织蛋白以免疫印迹法测定抗凋亡蛋白（bcl-2）及促凋亡蛋白（bax）水平。

2.实验结果：

实验结果表明，实验对照组小鼠肾脏显著缩小，脏器指数降低、血BUN升高（p＜0.05），肾组织GSH水平下降（p＜0.01）、MDA含量升高（p＜0.05），光镜下见肾小球轮廓基本清楚、肾小管排列疏松、上皮细胞空泡样变性显著，严重者正常结构消失，肾小管内管型增加；免疫组化染色见 fas及α-SMA蛋白阳性表达显著增强；Masson’s染色见肾小管纤维化显著增加；免疫印迹结果提示促/抗凋亡蛋白（bcl-2/bax）比值显著降低（p＜0.0 1）。蕨麻多糖保护组脏器指数恢复，血BUN水平明显下降，肾组织GSH水平升高、MDA含量下降，肾小管结构清晰，上皮细胞空泡样变性减少，肾小球及肾小管纤维化得到改善，fas及α-SMA蛋白阳性表达降低，bcl-2/bax比值恢复。单纯蕨麻保护组未见异常表现。结果如表1及图1～4所示。表1显示为小鼠肾脏脏器指数及相关生化参数变化。

表1

其中，* 与正常对照组相比， * P<0.05，** P<0.01；# 与实验对照组相比，# P<0.05。

上述实验表明，蕨麻多糖能有效的对抗慢性镉沉积所致的肾脏损伤，改善脏器指数，提高组织细胞的抗氧化能力，缓解镉所致的慢性炎症反应，改善组织细胞水肿变性，减轻肾小球及肾小管组织纤维化，增加抗凋亡蛋白bcl-2表达、抑制促凋亡蛋白bax表达，且无明显毒性作用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用，其特征在于，所述治疗肾损伤的药物为治疗由慢性镉沉积所致的肾损伤的药物。

3.根据权利要求1或2所述的蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用，其特征在于，所述药物中，蕨麻多糖的应用形式为水溶液，保护浓度为10mg/kg。

4.根据权利要求3所述的蕨麻多糖在制备治疗肾损伤的药物中的应用，其特征在于，所述蕨麻多糖是由以下方法制备的：

1）称取蕨麻，洗净、自然干燥、粉碎，加石油醚至蕨麻与石油醚的料液比为1g：10 ml，40℃回流浸提2h脱去表面脂肪，得到脱脂蕨麻滤渣；

2）将步骤1）得到的脱脂蕨麻滤渣定量称取，加入水作溶剂，以料液比1:25、100℃回流浸提1h，重复3次，合并滤液并浓缩至原滤液体积的1/4，得到浓缩液；

3）将步骤2）得到的浓缩液，加入4倍体积的浓度为95%的乙醇，静置24h离心取絮状沉淀，依次用4倍体积的无水乙醇及丙酮分别洗涤沉淀2次，冷冻干燥得到蕨麻粗多糖；

4）将步骤3）得到的蕨麻粗多糖加蒸馏水配制成质量体积百分比为0.5%的蕨麻粗多糖溶液，将蕨麻粗多糖溶液与配置好的sevag试剂，即体积比为5:1的氯仿-正丁醇混合溶液，以料液比1g:1ml混合，震荡0.5h后静置、分离，除去蛋白，冷冻干燥获得蕨麻精多糖。