CN111632082B - 一种西洋参枳椇子组合物及其在制备防治酒精性肝损伤的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种西洋参枳椇子组合物，由质量比为(1～2)：(1～2)的西洋参和枳椇子制备而成。本发明通过西洋参与枳椇子配伍后提取出有效成分，并发现其对酒精性肝损伤具有保护作用，其作用机制可能与改善脂质代谢和提高抗氧化能力有关，这一结果为西洋参与枳椇子配伍应用提供了理论基础。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种西洋参枳椇子组合物及其在制备具有防治酒精性肝损伤的药物中的应用。
背景技术
酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)是长期过量饮酒导致的肝脏疾病，严重时可发展为肝纤维化、肝硬化、肝癌等，已成为严重危害人类健康的常见疾病[7-8]。几十年来，医治ALD仍未找到特效药物，因此，开展中药配伍理论的研究思路可能是治疗疾病的新方向。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种西洋参枳椇子组合物及其在制备具有防治酒精性肝损伤的药物中的应用，本发明提供的西洋参枳椇子组合物对急性酒精诱导的肝损伤有明显的预防保护作用。
本发明提供了一种西洋参枳椇子组合物，由质量比为(1～2)：(1～2)的西洋参和枳椇子制备而成。
本发明还提供了一种上述西洋参枳椇子组合物的制备方法，包括以下步骤：
A)将干燥粉碎后的西洋参和枳椇子与水混合浸泡，回流提取，得到提取液；
将所述提取液离心后得到上清液和残渣；
B)将所述残渣与水混合进行回流提取，得到提取液；
将所述提取液离心后得到上清液和经过二次提取后的残渣；
C)将步骤A)的上清液与步骤B)的上清液合并后真空冷冻干燥，得到西洋参枳椇子组合物。
优选的，步骤A)中，所述干燥粉碎后的西洋参和枳椇子与水的质量比为1:8～1:10。
优选的，步骤A)中，所述浸泡的时间为1～1.5h；所述回流提取的时间为1～1.5h。
优选的，步骤B)中，所述残渣与水的质量比为1:5～1:6。
优选的，步骤B)中，所述回流提取的时间为0.5～1h。
优选的，步骤C)中，所述真空冷冻干燥的温度为-50℃～-55℃，时间为46～48h。
本发明还提供了一种上述西洋参枳椇子组合物在制备防治酒精性肝损伤的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一种西洋参枳椇子组合物，由质量比为(1～2)：(1～2)的西洋参和枳椇子制备而成。本发明通过西洋参与枳椇子配伍后提取出有效成分，并发现其对酒精性肝损伤具有保护作用，其作用机制可能与改善脂质代谢和提高抗氧化能力有关，这一结果为西洋参与枳椇子配伍应用提供了理论基础。
结果表明，与模型组小鼠比较，西洋参枳椇子组合物能够明显降低由急性酒精摄入引起的血清中AST、ALT活力的升高(p<0.05)，降低血清中TG的水平(p<0.05)和肝组织中MDA含量(p<0.05)；提高肝组织中抗氧化酶SOD和GSH-Px的活力(p<0.05)，且升高肝组织中GSH水平(p<0.05)。病理切片观察表明模型组以出现脂肪滴为变性为主，部分出现炎性细胞浸润，各给药组对小鼠肝脏病理改变有不同程度的作用。
附图说明
图1为西洋参枳椇子组合物对小鼠血清ALT(A)和AST(B)活力的影响；
图2为西洋参枳椇子组合物对小鼠血清TG含量的影响；
图3为西洋参枳椇子组合物对小鼠肝组织中GSH-Px、SOD活性和MDA、GSH含量的影响；
图4为西洋参枳椇子组合物对小鼠肝组织病理形态(苏木精-伊红染色，×400)。
具体实施方式
本发明提供了一种西洋参枳椇子组合物，由质量比为(1～2)：(1～2)的西洋参和枳椇子制备而成。
西洋参Panax quinquefolium Linn.为五加科植物西洋参的干燥根，是具有补气养阴、清热生津的功效[1]。由于西洋参主要活性成分人参皂苷成分和多糖成分的存在，现代药理学研究证明西洋参具有抗肿瘤、免疫调节，抗氧化和抗炎等多种作用，且有研究究报道西洋参对高脂饮食小鼠肥胖、脂肪肝和高甘油三酯血症有明显的预防和治疗作用。2018年西洋参被列为药食同源食品名录，增加了对西洋参作用的关注。西洋参的特别之处在于补而无燥，作为单味中药经常出现在复方当中。
枳椇子(Hovenia dulcis Thunb)为鼠李科拐枣属植物枳椇的种子，具有解酒毒，止呕，清热利尿等功效，常被应用到解酒护肝的方剂和产品中。
本发明以西洋参枳椇子为原料进行配伍获得有效成分，并发现其对酒精性肝损伤具有保护作用，其作用机制可能与改善脂质代谢和提高抗氧化能力有关，这一结果为西洋参与枳椇子配伍应用提供了理论基础。
在本发明的一些具体实施方式中，所述西洋参枳椇子组合物，由质量比为1:1的西洋参和枳椇子制备而成；
在本发明的另一些具体实施方式中，所述西洋参枳椇子组合物，由质量比为2:1的西洋参和枳椇子制备而成；
在本发明的另一些具体实施方式中，所述西洋参枳椇子组合物，由质量比为1:2的西洋参和枳椇子制备而成。
作为最优选的，所述西洋参枳椇子组合物，由质量比为2:1的西洋参和枳椇子制备而成，该比例条件得到的组合物相比其他配比，具有显著的对酒精性肝损伤具有保护作用。
其中，所述西洋参枳椇子组合物的制备方法，包括以下步骤：
A)将干燥粉碎后的西洋参和枳椇子与水混合浸泡，回流提取，得到提取液；
将所述提取液离心后得到上清液和残渣；
B)将所述残渣与水混合进行回流提取，得到提取液；
将所述提取液离心后得到上清液和经过二次提取后的残渣；
C)将步骤A)的上清液与步骤B)的上清液合并后真空冷冻干燥，得到西洋参枳椇子组合物。
本发明首先将西洋参和枳椇子进行干燥，本发明对所述干燥的方法并没有特殊限制，本领域技术人员公知的干燥方法即可。
将干燥后的西洋参和枳椇子粉碎，然后过筛，得到混合物粉末。
然后，将所述混合物粉末与水混合，进行浸泡。其中，所述混合物粉末与水的质量比为1:8～1:10，优选为1:8。所述浸泡的时间为1～1.5h，优选为1h。
接着，进行回流提取。所述回流提取的时间为1～1.5h，优选为1h。
将回流提取后的提取液进行离心，得到上清液和残渣。
将所述残渣进行二次提取，即将所述残渣与水混合，进行回流提取，得到提取液。其中，所述残渣与水的质量比为1:5～1:6，优选为1:5。所述回流提取的时间为0.5～1h，优选为0.5h。
将所述提取液离心后得到上清液和经过二次提取后的残渣；
然后，将两次提取的上清液合并，得到混合上清液。将所述混合上清液真空冷冻干燥，得到西洋参枳椇子组合物。其中，在进行真空冷冻之前，将所述上清液进行冷冻，所述冷冻的温度为-70～-80℃，时间为2～4h。所述真空冷冻干燥的温度为-50～-55℃，时间为46～48h。
本发明还提供了一种西洋参枳椇子组合物在制备防治酒精性肝损伤的药物中的应用。
本发明将西洋参枳椇子配伍探讨其对酒精性肝损伤的作用，结果表明，西洋参枳椇子组合物对酒精性肝损伤具有保护作用，其作用机制可能与改善脂质代谢和提高抗氧化能力有关，这一结果为西洋参与枳椇子配伍应用提供了理论基础。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的西洋参枳椇子组合物及其在制备具有防治酒精性肝损伤的药物中的应用进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
以下实施例中所用的材料与仪器如下：
清洁级ICR健康雄性小鼠40只，体重为20-22g，辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证SCXK(辽)2015-0001，合格编号211002300023526；西洋参 吉林省抚松县；枳椇子 山东济南秦越人农业发展有限公司；天冬氨酸氨基转移酶(Aspartateaminotransferase，AST)试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(Alanineaminotransferase，ALT)试剂盒、甘油三酯(Triglyceride，TG)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)试剂盒、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)试剂盒、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒、BCA法总蛋白定量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
Heraeus Megafuge 8R型超高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技有限公司；IX51型显微镜 奥林巴斯公司；Epoch2型酶标仪 美国博腾仪器有限公司；MS204S型电子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；EG1150型生物组织包埋机、RM2265型切片机、HI1210型水浴锅、HI1220型烤片台徕卡显微系统(上海)贸易有限公司。
实施例1
1、西洋参枳椇子提取物的制备：
将西洋参和枳椇子放置于电热恒温鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥12h，分别按质量比1:1，2:1和1:2混合，将干燥的混合物粉碎，过60目筛网，向混合物中加入重量比为8倍量的蒸馏水，浸泡1h，回流提取1h，然后以5000r/min，离心10min，获得上清液；再向残渣中加入按重量比为5倍量的蒸馏水，回流提取0.5h，离心，获得上清液，合并两次上清液，将混合上清液放置于-80℃条件下冷冻4h后，置于真空冷冻干燥机中48h，即为组合物I(西洋参和枳椇子原料质量比1:1)、组合物Ⅱ(西洋参和枳椇子原料质量比2:1)和组合物Ⅲ(西洋参和枳椇子原料质量比1:2)，产率分别为16.7％、19.3％和16.75％。
2、动物分组与给药方法
ICR小鼠在控温22±3℃并在相对湿度为55±15％的环境中饲养，自由进食、饮水适应一周后，随机分为五组，每组8只，即为正常组，模型组，组合物I组、组合物Ⅱ组和组合物Ⅲ组。
西洋参枳椇子组合物组(组合物I组、组合物Ⅱ组和组合物Ⅲ组)以100mg/kg·bw的剂量连续灌胃小鼠14d，正常组及模型组给予生理盐水。末次灌胃30min后，除正常组外，24h内灌胃小鼠3次酒精(5g/kg)。末次灌胃后6h，麻醉处死小鼠，取血分离肝脏。
3、血液和组织样本的采集
末次给予酒精6h后，麻醉摘眼球取血，分离肝脏，选取左叶常温保存于福尔马林中，其余肝脏保存于-80℃。
4、生化指标的检测
血液中AST、ALT和TG与肝组织中GSH-Px、SOD、GSH和MAD指标的检测按照试剂盒提供的说明书严格进行操作。
实验结果以
表示，采用SAS 9.2软件GLM过程进行单因素方差分析，两两比较利用Duncan法进行显著性分析，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。
(1)西洋参枳椇子组合物对小鼠血清转氨酶的影响
肝细胞受损会释放出血清转氨酶ALT和AST，其在血清中的含量是检测肝损伤的主要指标。参见图1和表1，图1为西洋参枳椇子组合物对小鼠血清ALT(A)和AST(B)活力的影响。图1中，小写字母不同为显著差异(p<0.05)，大写字母不同为差异极显著(p<0.01)；字母相同为差异不显著(p>0.05)；图2～图4同。如图1和表1所示，与正常组相比，模型组中ALT和AST的活力显著升高(p<0.05，p<0.01)，表明酒精引起小鼠肝组织损伤；与模型组相比，组合物I显著降低AST的水平(p<0.05)，组合物Ⅱ、Ⅲ极显著降低了ALT和AST的水平，给药组各组间无显著性差异，说明西洋参枳椇子对酒精导致小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用。
表1西洋参枳椇子组合物对小鼠血清ALT(A)和AST(B)活力的影响
(2)西洋参枳椇子组合物对血清中甘油三酯的影响
急性酒精的摄入容易引起的肝脂肪变性，其特征为甘油三酯在肝细胞内过度积累。结果见图2和表2，图2为西洋参枳椇子组合物对小鼠血清TG含量的影响。由图2和表2可知，与正常组相比，酒精导致小鼠血清中TG含量极显著升高(p<0.01)；与模型组比较，组合物I、Ⅱ组小鼠血清中TG含量无显著性差异，组合物Ⅲ极显著降低TG的含量(p<0.01)，表明小鼠肝组织中脂类物质含量下降。
表2西洋参枳椇子组合物对小鼠血清TG含量的影响
(3)西洋参枳椇子对小鼠肝组织抗氧化能力的影响
氧化应激的产生主要源于活性氧与抗氧化剂和还原性物质之间的失衡，活性氧可能与脂质发生反应，导致脂质过氧化，从而破坏细胞膜。而丙二醛是脂质过氧化的主要产物，其含量作为衡量氧化损伤的重要指标。结果见图3和表3，图3为西洋参枳椇子组合物对小鼠肝组织中GSH-Px、SOD活性和MDA、GSH含量的影响。由图3和表3可知，与正常组相比，模型组的肝组织内抗氧化酶SOD、GSH-Px的活力明显降低(p<0.001)，还原型GSH的含量极显著降低(p<0.001)和MDA含量极显著升高(p<0.001)；与模型组相比，组合物I极显著升高了SOD的活力(p<0.01)，GSH和MDA的含量(p<0.01)，组合物Ⅱ、Ⅲ极显著提高了SOD与GSH-Px的活力(p<0.001)，GSH和MDA的含量(p<0.001)，提示小鼠肝组织中氧化应激状况得以改善。
表3西洋参枳椇子组合物对小鼠肝组织中GSH-Px、SOD活性和MDA、GSH含量的影响
由表1～表3的数据可知，组合物Ⅱ中GSH-Px、SOD的活力和GSH的含量高于组合物I，具有显著性差异，同时也高于组合物Ⅲ，但无统计学差异；组合物Ⅱ中MDA含量显著高于组合物I和组合物Ⅲ，由此可说明组合物Ⅱ的抗氧化能力高于组合物I和组合物Ⅲ。
5、肝脏病理学检测
将肝组织标本包埋在石蜡中，然后用旋转切片机将肝脏包埋块切成5μm厚度，用于苏木精和伊红(H&E)染色，中性树胶封片，显微镜下观察肝组织病理学变化。结果见图4，图4为西洋参枳椇子组合物对小鼠肝组织病理形态(苏木精-伊红染色，×400)，图4中，A正常组；B模型组；C组合物I组；D组合物Ⅱ组；E组合物Ⅲ组。肝脏H&E染色结果显示，正常组小鼠肝细胞条索排列规则，形态正常，未出现的变性、坏死(图4A)；模型组小鼠肝组织中细胞细胞间出现大量的白色脂滴，和炎性细胞浸润，变性以中央静脉为主(图4B)；西洋参枳椇子组中小鼠肝细胞排列逐渐紧密、逐渐减少脂滴数量并且减轻炎性浸润程度(图4C-D)。
肝脏是药物和毒物代谢过程中的重要器官，日常生活中过量饮酒或饮用中药都会引发肝脏的损伤。ALD早期损伤多可逆转，如及时进行针对性治疗可防止发展到肝硬化、肝癌等疾病。肝细胞中储存了大量的血清转氨酶AST和ALT，当细胞膜受损时，膜通透性增加，胞内大量AST、ALT扩散到血中，以AST、ALT的水平高低判断肝细胞是否损伤。而且在ALD早期发病机理研究表明，酒精进入机体后，乙醇可影响脂肪代谢，导致TG在肝细胞内沉积，大量蓄积导致病变。
本发明中24h内灌胃3次灌胃酒精建立小鼠急性酒精性肝损伤模型。结果显示模型组小鼠血清中AST、ALT的活力和TG的含量显著高于正常组，且病理组织切片中，观察到较多的脂肪滴，出现炎性浸润的情况，表明急性酒精引起小鼠肝损伤。西洋参枳椇子组合物治疗可以使损伤小鼠血清中AST和ALT水平明显降低，改善了肝细胞病理形态学变化，降低血清中TG的含量，提示西洋参枳椇子组合物对酒精性肝损伤具有保护作用。
机体进入酒精后，经酶代谢时，能够诱导细胞内产生氧自由基(ROS)，消耗大量还原性物质如GSH，从而无法清除过多的自由基，引起氧化应激，导致细胞脂质过氧化产物迅速增加，肝细胞膜受损，因此还原型GSH的多少是衡量抗氧化能力的重要因素，脂质过氧化发生的最终代谢产物MDA的含量可以反映过氧化损伤和细胞受损的程度。
实验结果显示与正常组比较，模型组小鼠肝组织中GSH-Px、SOD的活力和GSH水平显著降低，MDA的含量显著升高，而西洋参枳椇子组合物可以提高肝组织中SOD和GSH-Px的活力，减少肝组织中GSH的消耗，并抑制肝组织中MDA含量增加，降低氧化应激水平，提高机体抗氧化能力。
综上结果所述，本发明通过西洋参与枳椇子配伍后提取出有效成分，并发现其对酒精性肝损伤具有保护作用，其作用机制可能与改善脂质代谢和提高抗氧化能力有关且组合物Ⅱ抗氧化应激能力较强，这一结果为西洋参与枳椇子配伍应用提供了理论基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种西洋参枳椇子组合物，其特征在于，由质量比为(1～2)：(1～2)的西洋参和枳椇子制备而成。
2.一种如权利要求1所述的西洋参枳椇子组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)将干燥粉碎后的西洋参和枳椇子与水混合浸泡，回流提取，得到提取液；
将所述提取液离心后得到上清液和残渣；
B)将所述残渣与水混合进行回流提取，得到提取液；
将所述提取液离心后得到上清液和经过二次提取后的残渣；
C)将步骤A)的上清液与步骤B)的上清液合并后真空冷冻干燥，得到西洋参枳椇子组合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤A)中，所述干燥粉碎后的西洋参和枳椇子与水的质量比为1:8～1:10。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤A)中，所述浸泡的时间为1～1.5h；所述回流提取的时间为1～1.5h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤B)中，所述残渣与水的质量比为1:5～1:6。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤B)中，所述回流提取的时间为0.5～1h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤C)中，所述真空冷冻干燥的温度为-50℃～-55℃，时间为46～48h。
8.一种如权利要求1所述的西洋参枳椇子组合物在制备防治酒精性肝损伤的药物中的应用。
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