KR101968837B1 - 지칭개 추출물 또는 지칭개 추출물에서 분리한 헤미스텝신a를 유효성분으로 포함하는 염증성 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
지칭개 추출물 또는 지칭개 추출물에서 분리한 헤미스텝신a를 유효성분으로 포함하는 염증성 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 본 발명은 지칭개 추출물 또는 지칭개 추출물에서 분리한 헤미스텝신A를 유효성분으로 포함하는 염증성 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 지칭개 추출물 및 헤미스텝신A는 산화질소 생성억제 효과를 통한 항염효과가 우수하며, 특히 헤미스텝신A는 염증성 사이토카인 생성억제 및 NF-κB 경로의 억제를 통한 항염 작용이 우수함을 확인하였으며, 대식세포주에 대한 독성을 유발하지 않는다는 것을 확인함으로써, 염증성 간질환 치료제 또는 예방을 위한 건강기능성 식품의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 지칭개 추출물 또는 지칭개 추출물에서 분리한 헤미스텝신A를 유효성분으로 포함하는 염증성 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
간은 해독을 하는 가장 주요한 장기로써 인체 내외의 물질들로부터 신체를 방어하는 기능을 수행한다. 간질환의 대표적인 위험요소로 알려져 있는 알코올의 과다복용은 조직손상을 통해 장내 세균총의 내독소를 간으로 유입되게 한다. 간 내에 상주하는 대식세포인 쿠퍼세포는 이러한 내독소에 반응하여 염증반응을 일으키며, 사이토카인을 분비하여 주변 실질조직에 염증을 가속화시키는 특징을 가지고 있다. 또한 지속적이며 반복적인 간의 염증은 섬유화, 간경화, 간암으로 이어지는 간질환의 발전에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 간질환의 예방과 치료에 있어서도 염증은 중요한 인자 중 하나이다.
지칭개(Hemistepta lyrata Bunge)는 국화과에 속하는 식물로 한의학에서 청열, 해독, 지혈, 궤양 치료 등에 활용되고 있다. 지칭개의 지상부 및 꽃의 성분 연구 결과 세스퀴테르펜 락톤구로는 가지고 있는 헤미스텝신A와 헤미스텝신B, isoamberboin, 8-hydroxyzaluzanin 등을 함유하는 것으로 밝혀져 있으며. 이 중 헤미스텝신A는 항균효과 및 항암효과를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 하지만 대식세포를 통해 매개되는 급성 염증에 대한 헤미스텝신A의 효과에 관하여는 연구된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 Toll 유사수용체 리간드로부터 자극된 대식세포주에서 지칭개 추출물 및 지칭개 추출물에서 분리한 헤미스텝신A가 갖는 항염효과 및 그 기전을 in vitro상에서 규명하고, in vivo를 통하여 헤미스텝신A의 급성 간염에 대한 간보호 효과를 평가하여 염증성 간질환의 치료 및 예방을 위한 소재로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 지칭개 추출물 및 헤미스텝신A를 유효성분으로 함유하는 염증성 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 지칭개 추출물 및 헤미스텝신A를 유효성분으로 함유하는 염증성 간질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명은 지칭개(Hemistepita lyrata Bunge) 추출물 또는 지칭개 추출물에서 분리된 하기 화학식 1의 헤미스텝신(Hemistepsin)A를 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물을 물, C1~C4의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 이용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간질환은 염증성 간질환, 간경화, 간섬유증, 급성간염, 만성간염, 간경변증, 지방간 및 간암으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 지칭개 추출물 또는 지칭개 추출물에서 분리된 상기 화학식 1의 헤미스텝신A를 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물을 물, C1~C4의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 이용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간질환은 염증성 간질환, 간경화, 간섬유증, 급성간염, 만성간염, 간경변증, 지방간 및 간암으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
아울러 본 발명은 지칭개를 클로로포름로 추출하여 지칭개 클로로포름 추출물을 제조하는 단계; 상기 지칭개 클로로포름 추출물에 클로로포름과 메탄올 혼합용액을 이용하여 추출한 다음 농축하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 헤미스텝신A이 포함된 분획물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 지칭개 추출물 및 헤미스텝신A는 산화질소 생성억제 효과를 통한 항염효과가 우수하며, 특히 헤미스텝신A는 염증성 사이토카인 생성억제 및 NF-κB 경로의 억제를 통한 항염 작용이 우수함을 확인하였으며, 대식세포주에 대한 독성을 유발하지 않는다는 것을 확인함으로써, 염증성 간질환 치료제 또는 예방을 위한 건강기능성 식품의 유효성분으로 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 지칭개 추출물을 처치한 대식세포주의 산화질소억제 및 세포생존율 측정 결과이다:
A) 지칭개 추출물을 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 산화질소생성량 측정한 결과를 나타낸 그래프
B) 지칭개 추출물을 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 세포생존율 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 2는 본 발명의 헤미스텝신A를 처치한 대식세포주의 산화질소억제 및 세포생존율 측정 결과이다:
A) 헤미스텝신A의 구조
B) 헤미스텝신A를 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 산화질소생성량과 세포생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프
C) 헤미스텝신A을 처치 후, Toll유사수용체 리간드들을 처치한 대식세포주의 산화질소생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 3은 본 발명의 헤미스텝신A를 처치한 대식세포주의 iNOS 및 COX-2의 발현 측정 결과이다:
A) 헤미스텝신A를 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 iNOS, COX-2 발현 측정한 결과를 나타낸 그래프
B) 헤미스텝신A를 처치 후, Toll유사수용체 리간드들을 처치한 대식세포주의 iNOS, COX-2 발현 측정한 결과를 나타낸 사진.
도 4는 본 발명의 헤미스텝신A를 처치한 대식세포주의 염증성 사이토카인 생성 측정 결과이다:
A) 헤미스텝신A를 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주 (RAW 264.7 cells)의 염증성 사이토카인 생성 측정한 결과를 나타낸 그래프
B) 헤미스텝신A를 처치 후, LPS를 처치한 초계배양 쿠퍼세포의 염증성 사이토카인 생성 측정한 결과를 나타낸 사진과 그래프.
도 5는 본 발명의 헤미스텝신A의 NF-κB 경로 억제를 관찰한 결과이다:
A) 헤미스텝신A 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 IKKα/β 및 IκBα의 인산화 및 I-κBα의 발현 측정한 결과를 나타낸 그래프
B) 헤미스텝신A 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 NF-κB의 핵 내 발현 측정한 결과를 나타낸 그래프
C) 헤미스텝신A 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 NF-κB의 핵 내 발현 측정한 결과를 나타낸 사진
D) 헤미스텝신A의 NF-κB 전사활성 억제효과 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 6은 본 발명의 헤미스텝신A의 Nrf2 경로 활성화를 관찰한 결과이다:
A) H2O2 측정한 결과를 나타낸 그래프
B) Nrf2 인산화 및 전사활성화 측정한 결과를 나타낸 그래프
C) 항산화 유전자의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프
D) 헤미스텝신A의 MAPK 경로 활성화를 관찰한 결과를 나타낸 그래프
E) p38과 JNK1/2 억제제를 통한 헤미스텝신의A의 Nrf2 활성화 억제효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 7은 본 발명의 헤미스텝신A의 D-gal/LPS 투여로부터 유도된 급성 간염에 미치는 영향을 측정한 결과이다:
A) 동물 처치 방법에 대한 도표
B) 간손상 지표인 ALT와 AST 측정한 결과를 나타낸 그래프
C) 조직학 및 조직면역화학법을 이용한 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프.
도 8은 본 발명의 헤미스텝신A의 D-gal/LPS 투여로부터 유도된 급성 간염에 미치는 영향을 조직면역화학법을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
A) 지칭개 추출물을 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 산화질소생성량 측정한 결과를 나타낸 그래프
B) 지칭개 추출물을 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 세포생존율 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 2는 본 발명의 헤미스텝신A를 처치한 대식세포주의 산화질소억제 및 세포생존율 측정 결과이다:
A) 헤미스텝신A의 구조
B) 헤미스텝신A를 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 산화질소생성량과 세포생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프
C) 헤미스텝신A을 처치 후, Toll유사수용체 리간드들을 처치한 대식세포주의 산화질소생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 3은 본 발명의 헤미스텝신A를 처치한 대식세포주의 iNOS 및 COX-2의 발현 측정 결과이다:
A) 헤미스텝신A를 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 iNOS, COX-2 발현 측정한 결과를 나타낸 그래프
B) 헤미스텝신A를 처치 후, Toll유사수용체 리간드들을 처치한 대식세포주의 iNOS, COX-2 발현 측정한 결과를 나타낸 사진.
도 4는 본 발명의 헤미스텝신A를 처치한 대식세포주의 염증성 사이토카인 생성 측정 결과이다:
A) 헤미스텝신A를 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주 (RAW 264.7 cells)의 염증성 사이토카인 생성 측정한 결과를 나타낸 그래프
B) 헤미스텝신A를 처치 후, LPS를 처치한 초계배양 쿠퍼세포의 염증성 사이토카인 생성 측정한 결과를 나타낸 사진과 그래프.
도 5는 본 발명의 헤미스텝신A의 NF-κB 경로 억제를 관찰한 결과이다:
A) 헤미스텝신A 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 IKKα/β 및 IκBα의 인산화 및 I-κBα의 발현 측정한 결과를 나타낸 그래프
B) 헤미스텝신A 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 NF-κB의 핵 내 발현 측정한 결과를 나타낸 그래프
C) 헤미스텝신A 처치 후, LPS를 처치한 대식세포주의 NF-κB의 핵 내 발현 측정한 결과를 나타낸 사진
D) 헤미스텝신A의 NF-κB 전사활성 억제효과 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 6은 본 발명의 헤미스텝신A의 Nrf2 경로 활성화를 관찰한 결과이다:
A) H2O2 측정한 결과를 나타낸 그래프
B) Nrf2 인산화 및 전사활성화 측정한 결과를 나타낸 그래프
C) 항산화 유전자의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프
D) 헤미스텝신A의 MAPK 경로 활성화를 관찰한 결과를 나타낸 그래프
E) p38과 JNK1/2 억제제를 통한 헤미스텝신의A의 Nrf2 활성화 억제효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 7은 본 발명의 헤미스텝신A의 D-gal/LPS 투여로부터 유도된 급성 간염에 미치는 영향을 측정한 결과이다:
A) 동물 처치 방법에 대한 도표
B) 간손상 지표인 ALT와 AST 측정한 결과를 나타낸 그래프
C) 조직학 및 조직면역화학법을 이용한 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프.
도 8은 본 발명의 헤미스텝신A의 D-gal/LPS 투여로부터 유도된 급성 간염에 미치는 영향을 조직면역화학법을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 간질환을 예방 또는 치료할 수 있는 유효성분으로 지칭개 추출물과 지칭개 추출물로부터 분리한 하기 화학식 1의 헤미스텝신A를 이용할 수 있음을 밝힌 점에 특징이 있다.
본 발명의 헤미스텝신A는 지칭개로부터 분리된 세스퀴테르펜 락톤구조를 가지고 있는 천연물로서, 헤미스텝신A (10 또는 30 μM)을 LPS (lipopolysaccaride)로 자극된 RAW 264.7 대식세포에 처치한 결과 일산화질소 생성량이 감소하였으며, iNOS와 COX-2 생성이 감소하였음을 확인하였다. 추가적으로 헤미스텝신A 처치에 의하여 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL (interleukin)-1β, IL-6, MCP-1이 감소하는 것을 RAW 264.7 세포주와 초계배양된 쿠퍼세포에서 확인하였다. 헤미스텝신A 처치는 IKKα/β의 인산화를 억제함과 동시에 I-κB의 분해를 억제하였으며, 이는 결과적으로 NF-κB의 핵내 유입을 감소시켜 전사활성화를 감소시키는 결과를 얻었다.
또한, 헤미스텝신A는 Nrf2의 인산화를 증가시켰으며 그 전사활성화 또한 증가시켰다. 이에 따라 헤미스텝신A의 처치는 항산화유전자인 HO-1, Sestrin2, NQO-1, GCLC의 발현을 증가시켰으며, LPS로부터 유도된 RAW 264.7 세포의 H2O2 생성을 감소시켰다. 이러한 헤미스텝신A의 Nrf2 활성효과는 억제제를 통한 연구로 확인한 결과, p38과 JNK의 인산화에 의한 것으로 확인되었다. 추가적으로 D-galactosamine (D-gal)과 LPS의 병용투여로 유도된 마우스의 급성 간염모델을 통하여 헤미스텝신A의 염증성 간질환에 대한 효과를 확인하였다.
간의 조직학적 변화를 관찰한 결과, 헤미스텝신A의 처치는 D-gal/LPS로부터 유도된 간세포의 변성과 염증세포의 침윤을 감소시켰으며, 면역조직화학적 평가를 통해 산화적 스트레스의 지표인자인 nitrotyrosine (NT), 4-hydroxynoneal (4-HNE)와 세포자멸서 지표인자인 cleaved PARP 양성 세포의 수가 감소한 것을 확인하였다. 또한 헤미스텝신A 처치에 의한 염증의 지표인자인 iNOS와 COX-2, TNF-α, IL-1β의 감소를 확인하였다.
그러므로 본 발명의 지칭개 추출물 또는 지칭개 추출물에서 분리된 헤미스텝신A를 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물로 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 지칭개 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 지칭개를 대상으로 추출물을 분리 및 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 추출물은 적절한 용매를 이용하여 지칭개로부터 추출할 수 있다. 이때 추출물을 수득하기 위해 사용할 수 있는 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 지칭개 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.
바람직하게는 용매로서 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 열수을 이용하여 지칭개 추출물을 수득할 수 있으며, 지칭개 클로로포름 추출물에 클로로포름:메탄올 용액으로 추출한 다음 농축하면 헤미스텝신A가 포함된 분획을 얻을수 있다.
또한 상기 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
이러한 본 발명의 지칭개 조성물 또는 지칭개 추출물에서 분리된 헤미스텝신A가 치료, 예방, 개선할 수 있는 간질환은 이에 제한되지 않으나, 염증성 간질환, 간경화, 간섬유증, 급성간염, 만성간염, 간경변증, 지방간 및 간암으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 기술된 간질환 중, 간경화는 만성적인 염증으로 인해 정상적인 간조직이 광범위하게 파괴된 결과로 섬유조직의 증식과 재생성 결절 형성의 형태학적 특징을 보이며, 2차적으로 간 내 혈관의 변형 및 간기능의 저하가 초래되는 질병이다(Bataller B, Brenner DA. Hepatic Fibrosis. In : Arias IM et al., The liver biology and pathobiology. 5th ed. Wiley-Blackwell, 2009, p.433-452). 간경화의 증상은 매우 다양하게 나타나는데 피부에 거미상 혈관이 나타나거나, 호르몬 대사의 이상으로 손바닥이 정상인보다 붉어지고, 남성에서는 여성호르몬이 파괴되지 않아 가슴이 커지며 성기능이 저하될 수 있다. 비장이 커지면서 왼쪽 옆구리에서 만져질 수 있고, 복수가 차고 양쪽 다리가 부을 수 있으며, 피부 바깥쪽까지 확장된 혈관이 튀어나올 수 있다. 또한 간기능의 저하로 황달이 나타날 수 있고, 간성혼수(hepatic coma)로 인해 인격이 변하거나 의식을 잃을 수도 있다. 식도정맥류 출혈 등이 발생하면 피를 토하거나 흑변, 혈변이 보일 수도 있다(Goldmann DR, Complete home medical guide, DK publishing, 2003, p.643-651).
이러한 간경화는 섬유조직의 증식 및 재생성 결절을 나타내는 질환으로 정상상태로 되돌리는 것은 불가능하며, 간경화에 대한 치료는 완치를 목적으로 하는 것이 아닌 현재의 간기능을 최대한 활용할 수 있도록 하는 것이다.
바이러스성 간경화의 경우, 그 원인을 억제하기 위한 페그인터페론(Peginterferon)이나 항바이러스제 등의 약물을 사용할 수 있으나, 간경화를 적극적으로 치료하기 위한 치료제는 없는 실정이다.
또한, 간섬유화(간섬유증)는 결합조직의 합성 및 분해 과정의 균형이 상실된 상태로서, 간 조직 내에 결합조직이 과도하게 축적되어 발생되며 괴사나 염증이 동반된다. 특히 간에서 간기능이 정상적인 상태에서 비타민 A를 저장하는 역할을 하는 간성상세포(hepatic stellate cells : HSCs)는 급 만성 간 손상에 의해 근섬유아세포(myofibroblast) 형태로 전이되고 급속히 증식하여 콜라겐(collagen), 프로테오글리칸(proteoglycan), 히알유로난(hyaluronan) 등과 같은 세포외 기질의 생성을 증가시키고 이동시켜 과도한 결합조직을 생성함으로써 간의 섬유화 과정을 진행시키는 것으로 알려져 있다(Friedman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82: 8681, 1985. and Gressner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151: 222, 1988. and Gressner et al., J. Hepatol., 22: 28, 1995.)
간암 역시 상기 기술된 간손상 질환인 간경화 및 간섬유화와 같은 증상이 악화되고 간 손상의 지속적인 원인 작용으로 발병될 수 있어, 본 발명의 지칭개 추출물 또는 지칭개 추출물에서 분리된 헤미스텝신A는 간암의 치료에도 효과적일 수 있다.
나아가 본 발명의 조성물은 간질환 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물 이외에도 식품 조성물로 사용될 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 지칭개 추출물 또는 지칭개 추출물에서 분리된 헤미스텝신A을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스,슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 지칭개 추출물 또는 지칭개 추출물에서 분리된 헤미스텝신A 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 지칭개 추출물 또는 지칭개 추출물에서 분리된 헤미스텝신A는 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 장기간 복용시에도 안심 하고 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 간손상을 개선 및 예방하기 위한 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<
준비예
> 재료 및 시약준비
CpG oligodeoxynucleotides (CpG), loxoribine (LOX), flagellin (FLA), poly I:C, peptidoglycan (PGN)는 InvivoGen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. Anti-iNOS과 anti-laminA/C 항체는 BD Biosciences (San Diego, CA, USA)에서 구입하였으며, anti-COX-2 항체는 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다. Anti-p38, anti-phosphorylated p38, anti-extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), anti-phosphorylated ERK1/2, anti-c-Jun N-terminal kinase 1/2 (JNK1/2), anti-phosphorylated JNK1/2, anti-inhibitory κBα (IκBα), anti-phosphorylated IκBα, anti-phosphorylated IκB kinase α/β (IKKα/β) 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로부터 얻었다. Anti-iNOS (면역조직화학법), anti-NF-κB, anti-F4/80, anti-cleaved poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), anti-TNF-α, and anti-IL-1β 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. Anti-nitrotyrosine (NT) 항체와 SB203580 (p38 억제제), SP600125 (JNK 억제제)는 EMD Millipore Corporation (Temecula, CA, USA)에서 구입하였고, Anti-phosphorylated nuclearfactor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) 항체는 Novus Biologicals (Littleton, CO, USA)에서 구입하여 사용하였고, anti-4-hydroxynonenal (4-HNE) 항체는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다. Anti-hemeoxygenase-1 (HO-1) 항체는 Enzo LifeScience (Farmingdale, NY, USA)에서, anti-sestrin2 (SESN2) 항체는 Proteinteck (Chicago, IL, USA)에서 구입하였다. LPS (from Escherichia coli 055:B5), 2’,7’-dihydrodichlorofluorescein diacetate (H2DCF-DA), D-gal, dexamethasone, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), anti-β-actin 항체와 다른 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
<
실시예
1> 실험방법
<1-1>
지칭개
추출물 및
헤미스텝신A
제조
2016년 4월과 5월에 경상북도 경산시 유곡동 주변에 자생하는 지칭개를 채취하여 음건하였다. 말린 지칭개를 제분하여 50 g을 각각 500 mL의 에탄올, 메탄올, 클로로포름에 72시간 동안 침출시켰다. 열수추출물은 50 g의 지칭개 제분을 500 mL의 물에 2.5시간 동안 전탕하였다. 이후 수득한 추출액을 여과지 (No.2 filter paper, Clifton, NJ, USA)를 사용하여 여과한 후 진공회전농축기 (LABCONO, Kansas, MO, USA)로 농축하였다. 지칭개 추출물의 수율은 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 열수 각각 5.3%, 22.3%, 33.5% 43.3%이었다. 각각의 건조된 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 다음 0.22 μm filter (Nalgene, New York, NY, USA)에 여과하여 사용하였다. 모든 추출물 용액은 10 mg/mL의 농도로 제작하여 사용하기 전까지 20℃에 보관하였다.
헤미스텝신A를 추출하기 위하여 지칭개 클로로포름 추출물 150 g을 silica gel column (12 × 20 cm)에서 클로로포름:메탄올 (19:1) 용액으로 추출하였다. 이후 진공회전농축기 (EYELA, Tokyo, Japan)으로 농축하여 헤미스텝신A가 포함된 분획을 얻었다. 추출된 헤미스텝신A는 사용 전까지 20℃에서 보관하였으며, DMSO에 녹여 사용하였다.
<1-2> 세포배양
RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (서울, 한국)에서 분양받아 사용하였다. 초계배양 쿠퍼세포는 마우스의 간 현탁액으로부터 밀도기울기원심분리법과 플라스틱에 대한 선택적부착력을 이용하여 분리되었다. 세포는 10%의 fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin과 100 μg/mL의 steptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagles's medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양되었다.
<1-3> 산화질소 측정
처치 후 배양배지 내에 생성된 산화질소 (nitric oxide; NO)를 측정하기 위하여 배양배지 50 μL과 Griess 시약을 50 μL를 함께 10분간 반응 시킨 후, 마이크로플레이트 리더기 (Infinite 200 Pro, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 550 nm의 파장에서의 흡광도를 측정하였다.
<1-4>
세포생존율 측정
세포생존율은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. MTT assay는 처치된 세포에 최종 농도가 0.2 mg/mL가 되도록 MTT 시약을 넣고 2시간 동안 배양하고, 생성된 포마잔 크리스탈 (formazan crystals)를 DMSO에 녹여 마이크로플레이트 리더기 (Tecan)를 사용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 하기 수학식 1에 나타난 공식을 사용하여 control 세포군에 대한 백분율로 나타내었다.
<수학식 1>
Cell viability (%) = 처치된 세포의 흡광도/control 세포군의 흡광도 × 100
<1-5>
전세포
및 핵 분획 추출액 제조와
웨스턴블롯
전세포 추출액은 1 mM 플루오르화 나트륨 (sodium flouride), 1 mM 베타 글리세로포스페이트 (β-glycerophosphate) 1 mM 오소바나데이트 나트륨 (sodium orthovanadate), 2.5 mM 피로인산나트륨 (sodium pyrophosphate)와 프로테아제 인히비터 칵테일 (GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 포함하는 라이시스 (lysis) 버퍼에 세포를 녹인 후 40분 동안 얼음 위에서 반응한 뒤, 15,000×g 로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 핵 분획은 10 mM HEPES-KOH ph 7.9, 10 mM 염화칼륨 (KCl), 1.5 mM 염화마그네슘 (MgCl2), 1 mM 디이토트레이톨 (dithiothreitol), 0.1% Nonidet P-40과 프로테아제 인히비터 칵테일 (GenDEPOT)를 포함하는 저장성 완충용액에 녹여 10분간 4℃에 반응한 뒤 원심분리 (7,800×g, 5분)하였다. 분리된 핵은 10 mM HEPES-KOH pH 7.9, 400 mM 염화칼륨 (KCl), 0.1 mM 이디티에이 (EDTA; ethylenediaminetetraacetic acid), 0.1% Nonidet P-40와 프로테아제 인히비터 칵테일 (GenDEPOT)을 포함하는 고장성 용액에 녹인 뒤 1시간 동안 4℃에서 반응한 뒤 원심분리 (14,000×g, 15분)하여 상층액을 핵 분획으로 얻었다. 단백질 농도는 BCA (bicinchoninic acid; Thrermo Fischer Scientific, Rockford, IL, USA) 법을 이용하여 측정하여, 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE에 전기영동시킨 후 니트로셀룰로즈 (nitrocellulose) 혹은 폴리플루오린화비닐리덴 (polyvinylidene fluoride) 지에 전이 시켜 1차 항체와 결합하고 이어 2차 항체인 서양고추냉이 퍼록시다아제 공액 anti-rabbit 혹은 anti-mouse IgG (horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-mouse IgG) 항체와 함께 반응시켰다. ECL 발색시약 (GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 반응시킨 뒤 X-ray 필름 (Agfa-Gevaert,Mortsel, Belgium)에 감광하였다. 이후 이미지 분석 시스템 (ImageJ, NIH)를 이용하여 밀도 분석을 진행하였다.
<1-6> 사이토카인의 측정
세포 처치 후 배양배지 내에 존재하는 TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1의 양을 면역효소법 (BD Biosciences)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 450 nM에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더기 (Tecan)을 이용하여 측정하였다.
<1-7>
면역형광법
세포를 지름 18 mm의 커버 글라스 (Marienfeld-Superior,Lauda-Konigshofen, Germany)에 105개의 밀도로 배양한 뒤 처치하였다. 이후 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde, Santa Cruz Biotechnology) 15분간 고정시킨 뒤, 0.2% 트리톤X-100을 포함하는 PBS 완충용액으로 permeabilization한 후, 1차 항체와 12시간 동안 4℃ 항습조에서 반응하였다. 이후 Alexa Flour 488 혹은 594 와 결합된 2차 항체 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 한시간 동안 반응하였다. 핵은 DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindoledihydrochloride; Molecular Probes)로 염색한 뒤 형광현미경(EclipseTi-U, Nikon, Kanagawa, Japan)으로 세포를 관찰하였다.
<1-8>
리포터유전자
분석
NF-κB 부착서열이 포함된 리포터 유전자 (pGL4.32)와 ARE (antioxidant response element)가 포함된 리포터 유전자 (pGL4.37), 마우스 COX-2 유전자의 프로모터 서열이 포함된 리포터 유전자 (Promega, Madison, WI, USA)를 제작 및 구입하였다. 대식세포주 (RAW 264.7 cells)에 리포터 유전자를 6시간 동안 FuGENE HD 형질주입 시약 (promega)을 이용하여 형질주입 하였다. 형질주입의 효율은 Renilla 루시페라아제를 발현하는 유전자 pRL-TK를 동시에 주입하여 측정하였다. 모든 처치 후에 세포 내에 존재하는 루시페라아제를 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)를 이용하여 측정하였다. 상대적인 루시페라아제의 활성은 firefly 루시페라아제의 활성을 Renilla 루시페라아제의 활성 값으로 나누어 나타내었다.
<1-9>
H
2
O
2
생성량 측정
배양 배지에 H2DCF-DA를 최종 농도가 20 μM이 되도록 처치하여 30분간 반응하고, 방출되는 형광을 여기 (excitation) 485 nM 와 방출 (emission) 530 nM 파장에서 마이크로플레이트 리더기 (Tecan)를 이용하여 측정하였다.
<1-10> RNA의 분리 및 실시간 중합효소 연쇄 반응
RNA는 Tri-solution (Bioscience Technology, 대구, 한국)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 분리된 RNA는 역전사효소와 oligo dT16을 이용하여 상보적 DNA로 변환하였다. 이후 HO-1, sestrin2, NQO-1, GCLC 유전자를 각각의 프라이머와 CFX-96 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), SYBR green premix (TaKaRa Bio,Shiga, Japan)을 이용한 실시간 중합효소 연쇄 반응을 통해 발현 양을 확인하였다. 각각의 상대적인 유전자 발현 양은 glyceraldehyde -3-phosphate dehydrogenase의 발현에 대한 상대적인 양으로 계산되었다.
<1-11> 실험동물의 사육
실험동물은 6주령의 ICR 마우스 수컷을 새론바이오 (의왕, 한국)에서 구입하여 1주일 동안 실험실 환경에서 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 사육실 환경은 온도 20-25℃, 습도 40-60%, 12시간 간격으로 light/dark cycle을 유지하였다. 본 연구는 대구한의대학교의 실험동물 윤리위원회 (DHU IACUC)의 승인을 거친 후 (승인번호; DHU2016-057) 제반 규정을 준수하면서 진행하였다.
<1-12> 실험동물의 처치
헤미스텝신A는 Corn oil에 5 혹은 30 mg/kg로 희석하여 복강주사 (injection peritoneal, ip) 하였다. 2 mg/kg 농도의 덱사메타손을 양성대조군으로 복강주사 하였다. 급성 간염을 유발하기 위하여 헤미스텝신A 혹은 덱사메타손 투여 한 시간 후, 생리식염수에 최종 농도 700 mg/kg의 D-gal과 10 μg/mL의 LPS를 복강주사하였다. D-gal/LPS 복강주사 6시간 후 간과 혈액을 마우스로부터 채취하였다.
<1-13> 혈청분석
혈청 중 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (alanine aminotransferase, ALT)와 아스팔테이트 아미노트랜스퍼라제 (aspartate aminotransferase, AST)는 Analysis kits (아이비디랩, 의왕, 한국)와 Automated blood chemistry analyzer(Photometer 5010, Robert Riele GmbH & Co KG, Berlin, Germany)를 사용하여 분석하였다.
<1-14> 조직학적 평가
간의 외좌엽을 분리하여 10% 중성 포르말린에 고정시킨 다음, 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고, 3~4 μm의 절편을 제작하여 Hematoxylin-eosin 염색을 실시한 후에 광학현미경 (Nikon, Japan)하에서 관찰하였다. 간 조직의 손상 정도를 간 세포의 apoptosis, confluent necrosis 및 염증세포의 침윤 정도를 기준으로 하는 modified histological activity index (HAI) semiquantative histopathological scoring system을 이용하여, 최대 10점을 기준으로 평가하였으며, 간 실질 중 변성부위의 비율 (%/mm2 of hepatic parenchyma) 및 변성 간세포의 수 (Cells/1000 hepatocytes), 침윤 염증세포의 수 (cells/mm2 of hepatic parenchyma)를 자동영상분석장치 (iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Vancouver, Quebec, Canada)를 이용하여 각각 평가하였다.
<1-15> 면역조직화학적 평가
고정된 조직 표본에 내인성 퍼록시다아제 활성을 메탄올과 0.3% H2O2에서 30분간 배양하여 차단하고, normal horse serum으로 1시간 배양하여 면역글로불린의 비특이적 결합을 억제하였다. 이후 4℃ 항온항습기에서 overnight로 각각의 1차 항체를 반응시키고, 다시 2차 항체 및 avidin-biotin-peroxidase (ABC) 시약과 1시간 동안 반응시켰다. 이후 조직샘플을 peroxidase substrate kit (Vector Labs, Burlingame, CA, USA)로 실온에서 3분간 반응시켰다. 모든 조직샘플은 단계별로 0.01M PBS로 3차례 세척하였다. 각각 항체에 대한 양성 세포는 자동영상분석장치 (iSolution FL ver 9.1)를 사용하여 분석하였으며 cells/1000 hepatocytes로 나타내었다.
<1-16> 통계처리
서로 다른 두군 간의 통계적 유의성을 검증하기 위하여 Student의 t-test를 사용하였다. 서로 다른 세군이상의 통계적 유의성 검증을 위해서는 one-way ANOVA test를 수행하였으며, 등분산성 검정인 Levene의 등분산검정 결과에 따라, Tukey의 honest significance difference 검증 혹은 Dunnett의 T검정을 이용하여 사후분석을 진행하였다. 모든 평가값들은 mean ± S.D.로 나타내었으며. 통계적 분석은 SPSS (ver. 14.0K for Windows, SPSS Inc, Chicago, IL. USA)를 이용하여 진행하였으며, P값이 0.05 미만인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 인정하였다.
<
실시예
2>
지칭개
추출물이
LPS
자극으로부터 유도된
대식세포주의
산화질소생성 및 세포생존율에 미치는 영향 분석
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 지칭개 추출물이 LPS로부터 유도된 대식세포주 (RAW 264.7 cells)의 산화질소생성 및 세포생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 각각을 Griess assay와 MTT assay를 통하여 측정하였다. 산화질소의 생성량은 control군의 생성량의 배수로 나타내었으며 세포생존율은 상기 수학식 1에 나타난 공식을 사용하여 control군에 대한 백분율로 나타내었다.
구체적으로, 대식세포주 (RAW 264.7 cells)에 준비된 4종의 지칭개 추출물 (열수, 에탄올, 메탄올, 클로로포름)을 0.3, 1, 3, 10 μg/mL의 농도로 한 시간 전 처치 후, LPS (1 μg/mL, 18시간)을 처치하였다.
그 결과, 4종의 지칭개 추출물 모두 LPS 처치로부터 유도된 산화질소 생성이 통계적으로 유의하게 억제함을 확인할 수 있었으나, 열수, 에탄올, 메탄올을 이용한 추출물에 비해 클로로포름을 이용한 지칭개 추출물에서 가장 큰 억제효과를 확인하였다. 지칭개 클로로포름 추출물은 LPS 단독 처치군에서 5.47 ± 0.06배 증가한 산화질소생성을 0.3, 1, 3, 10 μg/mL의 농도에서 각각 5.10 ± 0.09, 4.58 ± 0.06, 3.25 ± 0.13, 1.14 ± 0.07배로 감소시키는 것을 확인하였다(도 1A). 4종의 지칭개 추출물이 LPS 처치된 대식세포주 (RAW 264.7 cells)의 세포생존율에 미치는 영향을 평가한 결과, 유의한 세포생존율의 변화는 발견되지 않았다(도 1B).
<
실시예
3>
헤미스텝신A의
Toll유사수용체
리간드 자극으로부터 유도된
대식세포주의
산화질소생성 및 세포생존율에 미치는 영향 분석
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 헤미스텝신A가 Toll유사수용체 리간드들로부터 유도된 대식세포주 (RAW 264.7 cells)의 산화질소생성 및 세포생존율에 미치는 영향을 각각 Griess assay와 MTT assay를 통하여 측정하였다.
구체적으로, 헤미스텝신A의 LPS로부터 자극된 대식세포주의 산화질소생성 및 세포생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤미스텝신A를 1, 10, 30 μM 농도로 한 시간 전 처치 후, LPS (1 μg/mL, 18시간) 처치한 후 산화질소 생성량을 측정하였다.
그 결과, 대조군 대비 LPS 처치군은 3.17 ± 0.18배 산화질소 생성량이 증가하였으며, 헤미스텝신A 10, 30 μM 농도 전처치군에서 각각 1.18 ± 0.08, 0.97 ± 0.04배로 억제되어, 헤미스텝신A의 통계적으로 유의한 산화질소생성 억제효능을 확인하였다. 또한 헤미스텝신A가 LPS로 자극된 대식세포주 (RAW 264.7 cells)의 세포생존율에 미치는 영향을 평가한 결과, 통계적으로 유의한 세포생존율의 변화는 발견되지 않았다(도 2B).
또한, 헤미스텝신A가 다른 여러 종류의 Toll유사수용체 리간드들로 유도된 대식세포주 (RAW 264.7 cells)의 산화질소생성 및 세포생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤미스텝신A를 10 μM 농도 한 시간 전 처치 후, CpG (1 μM). LOX (500 μM), FLA (1 μg/mL), poly I:C (10 μg/mL), PGN (30 μg/mL)을 각각 24 시간 동안 처치하였다.
그 결과, 헤미스텝신A의 전 처치는 각각의 Toll유사수용체 리간드들로부터 유도된 대식세포주의 산화질소생성을 통계적으로 유의하게 감소시켰음을 확인하였다. 헤미스텝신A가 Toll유사수용체 리간드들이 처치된 대식세포주 (RAW 264.7 cells)의 세포생존율에 미치는 영향을 평가한 결과, 통계적으로 유의한 세포생존율의 변화는 발견되지 않았다(도 2C).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 헤미스텝신A가 내독소들로부터 유도된 염증 상황의 간에서 대식세포에 독성을 유발하지 않으므로 염증성 간질환의 치료와 개선을 위한 치료제로써 사용될 수 있음을 확인하였으며, 헤미스텝신A가 대식세포로부터 유도된 산화질소의 생성을 감소시킴으로써 항염효과가 있음을 확인하였다.
<
실시예
4>
헤미스텝신A가
Toll유사수용체
리간드자극으로부터 유도된
대식세포주의
iNOS와
COX-2의 발현에 미치는 영향 분석
헤미스텝신A의 산화질소생성 억제효능이 iNOS 발현억제를 통해 나타나는지 확인하기 위하여, 헤미스텝신A를 1, 10, 30 μM 농도로 한 시간 전 처치 후, LPS (1 μg/mL, 18시간) 처치한 후 웨스턴 블롯을 통하여 iNOS의 발현을 관찰하였다.
그 결과, LPS 처치에 의하여 증가되는 iNOS의 발현이 헤미스텝신A 전처치에 의하여 통계적으로 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다(도 3A).
또한, 아라키돈산으로부터 프로스타글란딘 E2를 합성하여 염증을 유발하는 것으로 알려져 있는 COX-2 단백질발현을 위와 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, LPS 처치에 의하여 증가되는 COX-2의 발현이 헤미스텝신A 전처치를 통하여 통계적으로 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다다(도 3A).
또한, 다른 Toll유사수용체 리간드 자극으로부터 유도된 대식세포주 (RAW 264.7 cells)에서의 iNOS, COX-2의 발현에 헤미스텝신A가 미치는 영향을 확인하기 위하여. 헤미스텝신A를 10 μM 농도로 한 시간 전 처치 후, CpG (1 μM). LOX (500 μM), FLA (1 μg/mL), poly I:C (10 μg/mL), PGN (30 μg/mL)을 각각 24 시간 처치하였다. 위와 같은 방법으로 iNOS와 COX-2의 발현을 확인하였다.
그 결과, 헤미스텝신A 처치에 의하여 Toll유사수용체 리간드 자극으로부터 유도된 iNOS, COX-2의 발현이 감소함을 확인하였다(도 3B).
상기 실험의 결과를 통해 헤미스텝신A에 의하여 Toll유사수용체 리간드 자극으로부터 증가하는 iNOS, COX-2의 발현이 헤미스텝신A에 의하여 억제되는 것을 확인하였고, 이를 통해 헤미스텝신A의 항염효과를 확인하였다.
<
실시예
5>
헤미스텝신A가
LPS
자극으로부터 유도된
대식세포주의
염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향 분석
TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1 등의 염증성 사이토카인들은 대식세포를 포함한 선천면역세포를 통하여 분비되며, Toll유사수용체 리간드들은 이러한 염증성 사이토카인들의 분비를 유도함으로써 염증을 가속화시킨다. 따라서 헤미스텝신A가 LPS 자극으로부터 유도된 염증성 사이토카인의 생성에 미치는 영향을 효소면역측정법을 이용하여 측정하였다.
우선 대식세포주 (RAW 264.7 cells)에 헤미스텝신A를 1, 10, 30 μM 농도로 한 시간 전 처치 후, LPS (1 μg/mL, 18시간)를 처치하였다. 이후 배양배지 내의 염증성 사이토카인 함량을 효소면역측정법을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 10, 30 μM의 농도에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1의 배양배지 내 생성량이 LPS 단독처치군에 비해 통계적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(도 4A).
상기 결과를 생리적인 조건하에서 확인하기 위하여, 마우스의 간에서 쿠퍼세포를 분리하여 초계 배양하였다. 초계배양 12시간 후 쿠퍼세포에 헤미스텝신A를 1, 10, 30 μM 농도 한 시간 전 처치 후, LPS (1 μg/mL, 18시간) 처치하였다. 위와 동일한 방법으로 배지내의 염증성 사이토카인의 양을 확인하였다.
그 결과, 헤미스텝신A의 처치에 의하여 LPS 자극으로 인해 생성된 배양배지 내의 사이토카인의 생성이 감소하는 것을 확인하였다(도 4B).
상기 실험의 결과를 통해 헤미스텝신A에 의하여 LPS 자극으로부터 증가하는 염증성 사이토카인의 발현이 헤미스텝신A에 의하여 억제되는 것을 확인하였고, 이를 통해 헤미스텝신A의 항염효과를 확인하였다.
<
실시예
6>
헤미스텝신A가
LPS
자극으로부터 유도된
대식세포주의
NF
-
κB
신호경로에
미치는 영향 분석
헤미스텝신A의 항염 효과에 대한 분자적 기전을 규명하고자 NF-κB 신호경로에 미치는 영향을 확인하였다. 헤미스텝신A의 한 시간 전 처치는 LPS (1 μg/mL, 1시간)로부터 유도된 IKKα/β와 IκBα의 인산화를 억제하였으며, 결과적으로 IκBα의 분해 또한 억제하였다. 위와 동일한 처치조건에서 NF-κB의 핵 내의 유입의 확인하기 위하여 핵 분획을 웨스턴블롯을 통하여 관찰하였다.
그 결과, 헤미스텝신A (10, 30 μM) 처치는 LPS (1 μg/mL, 1시간)으로부터 유도된 핵 내의 NF-κB 유입을 유의하게 감소시켰으며, 이는 면역형광법을 통해서도 확인되었다(도 5A, 5B, 5C).
또한, 헤미스텝신A에 의한 NF-κB의 핵 내 유입감소가 그 전사활성화에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 리포터 유전자 분석을 시행하였다. 대식세포주 (RAW 264.7 cells)에 NF-κB 결합부 혹은 마우스 COX-2 유전자의 프로모터를 결합하여 제작한 리포터 유전자를 형질주입한 뒤, 헤미스텝신A (10, 30 μM, 1시간), LPS (1 μg/mL, 12시간)을 순차적으로 처치한 후 생성된 루시페라아제의 양을 측정하였다.
그 결과, LPS 처치에 의하여 증가한 NF-κB의 전사활성이 헤미스텝신A 처치에 의해 통계적으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 5D).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 헤미스텝신A의 대식세포주 (RAW 264.7 cells)에서의 항염 효과가 NF-κB 신호분자의 활성을 억제함으로써 나타난다는 것을 알 수 있었다.
<
실시예
7>
헤미스텝신A의
대식세포주의
p38과
JNK를
통한
Nrf2
활성화와 항산화유전자 발현에 미치는 영향 분석
Toll유사수용체 리간드에 의한 자극은 대식세포 내의 산화적 스트레스를 증가시키고, 이는 염증반응을 가속화시키는데 기여하는 것으로 알려져 있다. 또한 MAPK를 통한 Nrf2의 활성화는 세포내 산화적 스트레스를 조절하는 대표적인 인자로 알려져 있다. 따라서 헤미스텝신A가 대식세포주 내의 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 항염효과를 나타내는지 알아보았다.
구체적으로, 대식세포주 (RAW 264.7 cells)에 헤미스텝신A (10, 30 μM)와 LPS (1 μg/mL)를 순차적으로 처리한 후, H2DCF-DA (20 μM, 0.5시간)을 처치하여 세포내 H2O2 생성량을 측정하였다.
그 결과, 헤미스텝신A (10, 30 μM) 처치는 LPS로부터 유도된 H2O2 생성을 유의하게 감소시켰다(도 6A).
또한, Nrf2는 항산화 유전자의 전사에 관계하는 핵심인자로 알려져 있으므로 헤미스텝신A 처치가 대식세포주 (RAW 264.7 cells)에서 Nrf의 인산화에 관계하는지 알아보기 위하여 0 내지 2 시간 처치하였다.
그 결과, 헤미스텝신A (10 μM) 처치에 의하여 Nrf2의 인산화가 증가한 것을 확인하였으며, ARE를 포함하는 리포터유전자 분석을 수행한 결과, 헤미스텝신A (10, 30 μM)가 농도 의존적으로 Nrf2의 전사적 활성을 증가시키는 것을 확인하였다(도 6B).
또한, 헤미스텝신A을 10 혹은 30 μM 처치는 항산화 유전자인 HO-1, Sestrin2, NQO-1, GCLC mRNA의 발현을 증가시켰으며, HO-1과 Sestrin2의 단백질 발현 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 6C).
다음으로, 헤미스텝신A (10, 30 μM, 1시간) 처치에 의한 대식세포주 (RAW 264.7 cells)에서의 MAPK 신호분자의 변화를 관찰하였다.
그 결과, 헤미스텝신A 처치는 ERK1/2의 인산화를 증가시키지 않았으나, p38과 JNK1/2의 인산화를 증가시켰다(도 6D).
헤미스텝신A 처치에 의하여 증가된 p38과 JNK1/2가 Nrf2 활성화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 p38 억제제인 SB203580 (30 μM)과, JNK 억제제인 SP600125 (30 μM)를 대식세포주 (RAW 264.7 cells)에 동시에 한 시간 전 처치한 후, 헤미스텝신A (10 μM, 1시간)를 처치하였다.
그 결과, SB203580과 SP600125 처치는 헤미스텝신A에 의한 Nrf2의 인산화와 HO-1의 단백질 발현을 억제시켰다(도 6E).
이를 통해서 헤미스텝신A가 Nrf2 활성화를 통하여 항산화 유전자의 발현을 증가시키며, 이를 통하여 염증으로부터 유래된 대식세포내의 산화적 스트레스를 조절할 수 있다는 것을 밝혔으며, 또한 이는 p38과 JNK1/2의 인산화를 통해 나타난다는 것을 발견하였다.
<
실시예
8>
헤미스텝신A의
마우스에서 D-
galactosamine과
LPS
병용투여로부터 유도된 급성 간염에 미치는 영향 분석
헤미스텝신A의 항염 효능을 마우스에서 D-galactosamine과 LPS의 병용투여를 통해 유도된 급성 간염 모델을 활용하여 평가하였다. 헤미스텝신A (5 혹은 30 mg/kg)를 복강주사 후, 한 시간 후에 D-galactosamine (700 mg/kg)와 LPS (10 μg/kg)를 생리식염수에 녹여 복강주사 하였다. 덱사메타손 (2 mg/kg) 투여군을 양성대조군으로 삼았다. D-gal/LPS 복강주사 6시간 뒤 마우스의 혈액과 간을 얻었다.
그 결과, 혈청 중 ALT와 AST를 측정한 결과 D-gal/LPS 복강주사에 의하여 유의하게 증가하는 것을 확인하였으며 덱사메타손에 의하여 유의미한 감소를 보였다. 헤미스텝신A 처치는 ALT와 AST 활성도를 농도의존적으로 낮추는 경향을 보였으며, ALT의 경우 헤미스텝신A 30 mg/kg 군에서 vehicle군보다 통계적으로 유의미한 감소를 확인하였다(도 7A 및 도 7B).
또한, 헤미스텝신A가 D-gal/LPS로 유도된 간의 조직학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Hematoxylin-eosin 염색을 실시하여 관찰하였다. 간 실질 중 변성부위의 비율 및 변성 간세포의 수, 침윤 염증세포의 수를 측정하였다.
그 결과, D-gal/LPS 처치에 의하여 증가된 변성부위의 비율 및 변성 간세포의수 및 침윤된 염증세포의 수가 헤미스텝신A (5 혹은 30 mg/kg)에 의하여 농도의존적이며 통계적으로 유의미하게 감소함을 확인하였다(도 7C).
또한, 면역조직화학법을 통하여 간 조직 내의 NT, 4-HNE, cleaved PARP 양성인 세포의 수를 측정하였다.
그 결과, D-gal/LPS 처치로 인해 현저히 증가한 양성세포수가 헤미스텝신A 처치에 의하여 통계적으로 유의미하게 감소하였다(도 7C).
또한, 면역조직화학법으로 간조직내의 염증지표인 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β 의 발현을 관찰하였다. 하기 표 1에 나타난 바와 같이, D-gal/LPS 처치에 의하여 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β 양성인 세포가 통계적 유의미하게 증가하였으며 헤미스텝신A 처치에 의하여 통계적으로 유의미하게 감소하였다(도 8).
| Groups | Vehicle | D-gal/LPS | D-gal/LPS +Dexamethasone |
D-gal/LPS +HsA 5 mg/kg |
D-gal/LPS +HsA 30 mg/kg |
HsA 30 mg/kg |
| NT | 33.00±14.68 | 563.00±121.07** | 176.38±32.43## | 346.88±130.82 | 212.50±86.76## | 34.25±17.82 |
| 4-HNE | 31.75±15.09 | 473.88±100.70** | 183.25±61.12## | 331.25±70.28 | 219.25±52.96## | 33.50±10.99 |
| PARP | 5.00±2.00 | 358.50±118.76** | 8.25±4.77## | 184.88±24.27# | 153.38±37.70# | 4.88±2.80 |
| iNOS | 21.25±11.02 | 263.00±54.68** | 89.38±44.78## | 196.13±16.81 | 155.25±37.03## | 25.00±11.44 |
| COX-2 | 2.88±1.36 | 362.00±111.85** | 36.88±18.36## | 208.25±61.40 | 43.88±17.61## | 2.63±1.30 |
| TNF-α | 1.88±1.55 | 70.00±12.80** | 7.13±0.99## | 45.63±13.66# | 22.38±10.91## | 1.75±1.39 |
| IL-1β | 1.25±1.04 | 86.50±29.11** | 12.88±4.97## | 52.75±10.02 | 16.88±7.88## | 1.38±1.19 |
Claims (5)
- 지칭개(Hemistepita lyrata Bunge) 추출물에서 분리된 하기 화학식 1의 헤미스텝신(Hemistepsin)A를 유효성분으로 포함하는 급성간염의 예방 또는 치료용 조성물
[화학식 1]
.
- 삭제
- 지칭개(Hemistepita lyrata Bunge) 추출물에서 분리된 하기 화학식 1의 헤미스텝신(Hemistepsin)A를 유효성분으로 포함하는 급성간염의 예방 또는 개선용 건강기능식품
[화학식 1]
.
- 삭제
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| 생약학회지. 1999. 제30권 제1호, pp.74-78. |
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