KR20060049386A

KR20060049386A - 서바이빈의 발현을 억제하는 ｓｉＲＮＡ

Info

Publication number: KR20060049386A
Application number: KR1020050101375A
Authority: KR
Inventors: 최영철; 박한오; 정소림; 김영주
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2004-10-27
Filing date: 2005-10-26
Publication date: 2006-05-18
Also published as: KR100848665B1

Abstract

본 발명은 서바이빈의 발현을 억제하는 이중가닥 siRNA 및 전기 이중가닥 siRNA를 유효성분으로 하는 항암제를 제공한다. 본 발명의 이중가닥 siRNA는 서바이빈을 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합할 수 있고, 세포내에서 서바이빈 발현을 억제한다. 본 발명의 서바이빈을 암호화하는 mRNA와 상보결합할 수 있는 siRNA는 거의 모든 종양으로부터 공통적으로 발현되는 서바이빈의 발현을 억제할 수 있으므로, 범용적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

서바이빈, siRNA, 항암제

Description

서바이빈의 발현을 억제하는 ｓｉＲＮＡ{siRNA for Inhibiting Survivin Gene Expression}

도 1은 본 발명의 82개의 siRNA를 이용하여, 형질전환시킨 세포주에서 발현되는 서바이빈 mRNA의 수준을 나타내는 그래프이다.

도 2는 siRNA에 의하여 형질전환된 세포내에서 서바이빈의 mRNA 수준을 나타내는 노던블롯 사진이다.

도 3은 서열번호 43의 siRNA의 항암효과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 서열번호 43의 siRNA의 변형체의 시간의 경과에 따른 혈청내에서의 안정성을 비교한 전기영동사진이다.

본 발명은 서바이빈의 발현을 억제하는 siRNA에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 서바이빈의 발현을 억제하는 이중가닥 siRNA 및 전기 이중가닥 siRNA를 유효성분으로 하는 항암제에 관한 것이다.

특정 유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제의 확인과 표적 검증을 위한 중요한 도구가 된다. 종래에는 특정 유전자를 억제하기 위하여 특정 유전자에 대한 전이유전자(transgene)를 도입하는 방법을 사용하였는데, 프로모터를 기준으로 역방향(antisense)으로 전이유전자를 도입하는 방법(참조: Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:8805-8808, 1988; Smith et al., Nature, 334:724-726, 1988)과 프로모터 기준으로 정방향(sense)으로 이식유전자를 도입하는 방법이 보고되었다(참조: Napoli et al., Plant Cell, 2:279-289, 1990; van der Krol et al., Plant Cell, 2:291-299, 1990; 미국특허 제 5,034,323호; 미국특허 제 5,231,020호; 및, 미국특허 제 5,283,184호).

최근에는 20-25bp 정도의 이중가닥 RNA 단편의 축적에 의해 전사후 유전자 억제 또는 RNA 간섭(RNAi) 현상이 일어나는데, 전기 이중가닥 RNA는 RNA 주형으로부터 합성된다는 사실이 보고되었다(참조: Hamilton & Baulcumbe, Science, 286:950-952, 1999). 전기 이중가닥 RNA 단편은 "작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)"라고 명명되었으며, 포유동물을 포함한 다양한 생명체에서 siRNA는 유전자의 발현을 억제하는 중요한 요소라는 사실이 명백해지고 있다(참조: Fire et al., Nature, 391:806-811, 1998; Timmons & Fire, Nature, 395:854, 1998; WO 99/32619; Kennerdell & Carthew, Cell, 95:1017-1026, 1998; Elbashir et al., Nature, 411:494-497, 2001). 현재까지의 연구결과에 의하면, 이중가닥으로 구성된 siRNA는 세포내에서 RISC(RNA-induced silencing complex) 단백질 복합 체에 의하여, 단일가닥 RNA로 전환되고, 이어 목적하는 mRNA와 결합하여 mRNA를 불활성화시키는 것으로 예측되고 있다(참조: Novina & Sharp, Nature, 430:161-164, 2004).

이처럼 siRNA를 이용하여 유전자의 발현을 억제하는 기술은, 특정한 세포에서 특정한 유전자의 발현을 억제시키고, 이로 인한 변화를 관찰함으로써, 특정한 세포에서의 특정 유전자의 기능을 규명하는 연구에 유용할 뿐만 아니라, 감염성 바이러스 또는 암세포 등에서, 특정한 유전자의 기능을 억제함으로써 해당 질병을 치료하는 방법을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예측되었고, 실험실적 환경(in vitro)에서의 연구 및 실험동물을 이용한 연구를 수행한 결과, siRNA에 의한 목적 유전자의 발현억제가 가능하다고 보고되었다(참조: McCaffrey et al., Nature Biotechnology, 21:639-644, 2003; Giladi et al., Molecular Therapy, 8:769-776, 2003; Konishi et al., Hepatology, 38:842-850, 2003; Sen et al., Virus Research, 96:27-35, 2003; Yokota et al., EMBO Reports, 4:602-608, 2003; Song et al., Nature Medicine, 9:347-351, 2003; McCaffrey et al., Nature, 418:38-39, 2002). 뿐만 아니라, 국제특허공개공보 WO 03/070969호에는 siRNA를 이용하여 암세포에서 Bcl2 단백질의 발현을 억제시킴으로써, 암세포를 치료하는 방법이 개시되어 있고, WO 04/009769호에는 siRNA를 이용하여 혈관신생을 유발하는 VEGF 단백질의 발현을 억제시킴으로써, 암세포를 치료하는 방법이 개시되어 있다.

암(cancer)은 일반적으로 능동적이고 자발적인 세포의 죽음인 세포자멸(apoptosis)의 속도가 줄어들고 세포주기가 변하는 것과 연관되어 있기 때문에, 세포주기를 억제하거나 또는 세포자멸을 회복시키는 방법은 새로운 항암치료방법으로 대두되고 있다. 세포자멸이 억제되는 종양에서는 세포자멸 억제 단백질(IAPs; inhibitors of apoptosis)이 발현된다고 알려지고 있으며, 전기 IAPs는 세포자멸을 유도하는 단백질분해효소(caspase)의 활성을 직접적으로 억제하거나 또는 관련된 전사인사인 NF-kB의 활성을 조절하는 방식으로, 그 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.

최근의 연구결과로부터, IAPs의 하나인 서바이빈(survivin) 단백질이 암과 관련되어 있음이 밝혀지게 되었다. 서바이빈은 지금까지 테스트된 대부분의 신생 종양이나 형질변이된 세포주에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 지속적인 변이(mutation)가 일어나는 종양에서도 일정한 수준으로 발현된다고 알려지게 되어, 항암치료에 있어서 중요한 타겟이 될 것으로 예측되고 있다(참조: Ambrosini G, et al., Nat. Med., 3(8):917-921, 1997). 즉, 종래의 항암치료를 위한 방법 중에서, 특히 면역치료방법으로 종양을 치료할 경우에는 타겟으로서 종양에서 특이적으로 발현되는 항원단백질을 선택하여야 하는데, 전기 항원단백질은 환자의 체질, 종양발생부위 등에 따라 각기 상이하고, 심지어 같은 환자내에서도 종양세포가 전이되면서 선택된 항원단백질이 소멸하는 현상이 발생되므로, 항원단백질을 선택하기가 매우 어려웠다. 그 결과, 효과적인 항암치료가 수행되지 못하였다는 문제점이 있었으나, 거의 모든 종양세포에서 공통적으로 발현되는 서바이빈이 발견됨에 따라, 전기 문제점이 해결되어, 효과적인 항암치료가 가능하게 될 것으로 예견되었다.

한편, 최근의 연구결과에 의하면, 서바이빈은 세포자멸을 유도하는 단백질 분해효소의 활성을 직접적으로 억제하고, 임상적으로 서바이빈 단백질의 수치와 대장암의 생존율이 역비례한다고 보고되었으므로, 서바이빈의 발현을 억제시키거나 또는 서바이빈의 활성을 저해함으로써, 종양세포를 치료할 수 있다는 가정아래, 활발한 연구가 진행되고 있다(참조: Andersen MH, et al., Histol. Histopathol., 17(2):669-675, 2002). 예를 들어, 미국특허공개 제 2003-0211607호에는 안티센스를 이용하여 서바이빈의 발현을 억제하는 방법이 개시되어 있으나, 안티센스를 이용하는 방법은 서바이빈의 발현을 극히 낮은 확율로 억제시킬 수 있어, 효율성이 낮고, 서바이빈 이외의 다른 단백질의 발현을 함께 억제시키는 비특이적인 발현억제 양상을 나타낼 가능성이 있어, 실제적인 종양치료에 응용하기가 어려운 실정이다(참조: Burgess et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:4051-4055, 1995; Branch, TIBS, 23:45-50, 1998).

따라서, 서바이빈의 발현을 조절하여 효과적으로 종양세포를 치료할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 서바이빈의 발현을 조절하여 효과적으로 종양세포를 치료할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 서바이빈을 암호화하는 유 전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 전기 mRNA를 불활성화시킬 수 있는 siRNA를 직접 종양세포에 도입시켜서, 종양세포내에서 서바이빈의 발현을 억제시킬 경우, 종양세포를 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 서바이빈 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 서바이빈의 발현을 억제할 수 있는 이중가닥 siRNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 이중가닥 siRNA를 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공하는 것이다.

본 발명의 서바이빈의 발현을 억제할 수 있는 siRNA는 서열번호 1 내지 82, 92 내지 94, 96 내지 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114 및 116의 염기서열을 가지는 이중가닥 RNA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

본 발명자들은 서바이빈의 발현을 억제하는 방법을 개발하기 위하여, 다각적으로 연구를 수행한 결과, 서바이빈을 암호화하는 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있도록 설계한 염기서열을 가지는 siRNA를 이용할 경우, 서바이빈의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다. 이때, 본 발명자들이 개발한 siRNA의 목표 염 기서열은 다음과 같고, 실제 siRNA는 이중가닥 RNA이므로 아래의 목표 염기서열(sense)과 상보적인 앤티센스(antisense) 염기서열을 갖는 RNA와 결합된 구조로 만들어 지게 된다. 또한, 이 이중가닥 RNA에는 하나 또는 양쪽 가닥에 3‘ 오버행(overhang)을 포함할 수 있고, 이는 이중가닥 RNA의 3’-끝에 최소 하나, 일반적으로 두 개의 비결합(unpaired) 뉴클레오타이드를 갖는 구조를 의미한다:

5'-ucaaggaccaccgcaucuc-3'(서열번호 1), 5'-aaggaccaccgcaucucua-3'(서열번호 2), 5'-ggaccaccgcaucucuaca-3'(서열번호 3), 5'-gaccaccgcaucucuacau-3'(서열번호 4), 5'-caccgcaucucuacauuca-3'(서열번호 5), 5'-gcaucucuacauucaagaa-3'(서열번호 6), 5'-ucucuacauucaagaacug-3'(서열번호 7), 5'-acauucaagaacuggcccu-3'(서열번호 8), 5'-ucaagaacuggcccuucuu-3'(서열번호 9), 5'-cugagaacgagccagacuu-3'(서열번호 10), 5'-uuggcccaguguuucuucu-3'(서열번호 11), 5'-cccaguguuucuucugcuu-3'(서열번호 12), 5'-uucuucugcuucaaggagc-3'(서열번호 13), 5'-ggaacauaaaaagcauucg-3'(서열번호 14), 5'-aagcauucguccgguugcg-3'(서열번호 15), 5'-uucguccgguugcgcuuuc-3'(서열번호 16), 5'-ccgguugcgcuuuccuuuc-3'(서열번호 17), 5'-cgguugcgcuuuccuuucu-3'(서열번호 18), 5'-ugcgcuuuccuuucuguca-3'(서열번호 19), 5'-cgcuuuccuuucugucaag-3'(서열번호 20), 5'-uuuccuuucugucaagaag-3'(서열번호 21), 5'-uucugucaagaagcaguuu-3'(서열번호 22), 5'-ucugucaagaagcaguuug-3'(서열번호 23), 5'-ugucaagaagcaguuugaa-3'(서열번호 24), 5'-agaagcaguuugaagaauu-3'(서열번호 25), 5'-gaagcaguuugaagaauua-3'(서열번호 26), 5'-agcaguuugaagaauuaac-3'(서열번호 27), 5'-auuaacccuuggugaauuu-3'(서열번호 28), 5'-aacccuuggugaauuuuug-3'(서열번호 29), 5'-ccuuggugaauuuuugaaa-3'(서열번호 30), 5'-ggugaauuuuugaaacugg-3'(서열번호 31), 5'-aacuggacagagaaagagc-3'(서열번호 32), 5'-acagagaaagagccaagaa-3'(서열번호 33), 5'-agagccaagaacaaaauug-3'(서열번호 34), 5'-caagaacaaaauugcaaag-3'(서열번호 35), 5'-uugcaaaggaaaccaacaa-3'(서열번호 36), 5'-aaggaaaccaacaauaaga-3'(서열번호 37), 5'-acugcgaagaaagugcgcc-3'(서열번호 38), 5'-acuuccaggguuuauuccc-3'(서열번호 39), 5'-uagcaaugucuuaggaaag-3'(서열번호 40), 5'-gcaaugucuuaggaaagga-3'(서열번호 41), 5'-ugucuuaggaaaggagauc-3'(서열번호 42), 5'-aaggagaucaacauuuuca-3'(서열번호 43), 5'-ccuguuuugucuugaaagu-3'(서열번호 44), 5'-gcugcuucucucucucucu-3'(서열번호 45), 5'-uaccaggugagaagugagg-3'(서열번호 46), 5'-gaaggcagugucccuuuug-3'(서열번호 47), 5'-ggcagugucccuuuugcua-3'(서열번호 48), 5'-gacagcuuuguucgcgugg-3'(서열번호 49), 5'-ugugucuggaccucauguu-3'(서열번호 50), 5'-uugaggcugucacaguccu-3'(서열번호 51), 5'-gguuccuuaucugucacac-3'(서열번호 52), 5'-uccuuaucugucacaccug-3'(서열번호 53), 5'-uugguagaugcaugacuug-3'(서열번호 54), 5'-ugcaugacuugugugugau-3'(서열번호 55), 5'-gugugugaugagagaaugg-3'(서열번호 56), 5'-gugaugagagaauggagac-3'(서열번호 57), 5'-acauggcuuucuuauuuug-3'(서열번호 58), 5'-aauucacagaauagcacaa-3'(서열번호 59), 5'-agaauagcacaaacuacaa-3'(서열번호 60), 5'-acuaagcacaaagccauuc-3'(서열번호 61), 5'-aagcacaaagccauucuaa-3'(서열번호 62), 5'-agcacaaagccauucuaag-3'(서 열번호 63), 5'-agccauucuaagucauugg-3'(서열번호 64), 5'-gccauucuaagucauuggg-3'(서열번호 65), 5'-ggagacagaauagagugau-3'(서열번호 66), 5'-gagacagaauagagugaua-3'(서열번호 67), 5'-auaggaagcgucuggcaga-3'(서열번호 68), 5'-gcgucuggcagauacuccu-3'(서열번호 69), 5'-ucuggcagauacuccuuuu-3'(서열번호 70), 5'-cacugcugugugauuagac-3'(서열번호 71), 5'-ugugauuagacaggcccag-3'(서열번호 72), 5'-ggcaguggccuaaauccuu-3'(서열번호 73), 5'-uuaaaugacuuggcucgau-3'(서열번호 74), 5'-ccaaccuucacaucuguca-3'(서열번호 75), 5'-ccuucacaucugucacguu-3'(서열번호 76), 5'-ggcugaagucuggcguaag-3'(서열번호 77), 5'-gcugaagucuggcguaaga-3'(서열번호 78), 5'-ggcguaagaugauggauuu-3'(서열번호 79), 5'-uggauuugauucgcccucc-3'(서열번호 80), 5'-gauuguuacagcuucgcug-3'(서열번호 81) 및 5'-cggcuguuccugagaaaua-3'(서열번호 82).

상기 각각의 siRNA를 종양 세포에 도입시킬 경우, 세포내에서 서바이빈을 암호화하는 mRNA의 수준이 저하될 뿐만 아니라, 서바이빈의 단백질 수준이 현저하게 저하되며, 종양세포의 증식이 억제됨을 확인할 수 있었다. 아울러, 종양을 유발시킨 모델동물에 상기 각각의 siRNA를 도입시킬 경우, 모델동물에서 유발된 종양의 증식이 억제되고, 유발된 종양이 사멸함을 확인하였으므로, 본 발명의 siRNA가 항암제로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다. 특히, 서열번호 43의 siRNA는 서바이빈 mRNA의 발현을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 암세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

이에, 전기 서열번호 43의 siRNA의 염기서열을 일부 변형시켜서 작제한 변형체들이 전기 서열번호 43의 siRNA과 유사한 효과를 나타내는지를 확인한 결과, 다음과 같은 변형된 염기서열을 갖는 siRNA 역시 서바이빈 mRNA의 발현을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 암세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다:

5'-aggaaaggagaucaacauu-3'(서열번호 92), 5'-ggaaaggagaucaacauuu-3'(서열번호 93), 5'-gaaaggagaucaacauuuu-3'(서열번호 94), 5'-aggagaucaacauuuucaa-3'(서열번호 96), 5'-ggagaucaacauuuucaaa-3'(서열번호 97), 5'-ggagaucaacauuuucaaauuagdadu-3'(서열번호 98), 5'-aggagaucaacauuuucaaauuadgda-3'(서열번호 100), 5'-aaggagaucaacauuuucaaauudadg-3'(서열번호 102), 5'-aaaggagaucaacauuuucaaaududa-3'(서열번호 104), 5'-gaaaggagaucaacauuuucaaadudu-3'(서열번호 106), 5'-ggaaaggagaucaacauuuucaadadu-3'(서열번호 108), 5'-aggaaaggagaucaacauuuucadada-3'(서열번호 110), 5'-uaggaaaggagaucaacauuuucdada-3'(서열번호 112), 5'-ggcagugucccuuuugcuagagcdTdg-3'(서열번호 114), 5'-agaauagcacaaacuacaauuaadada-3'(서열번호 116)

뿐만 아니라, 서열번호 43의 siRNA에 2'-F, 메틸(2'-O-methyl) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)기를 도입하여 제조된 대부분의 변형체는 서바이빈의 발현을 효과적으로 감소시키면서도, 혈청내에서 우수한 안정성을 나타냄을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 항암제는 서바이빈을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 siRNA를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특히, 본 발명의 항암제는 서바이빈을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 siRNA를 주사용 조성물과 혼합하여 종양이 발생한 부위에 주사형태로 투여하거나, 겔 조성물 또는 경피흡수용 점착 조성물과 혼합하여, 직접 환부에 바르거나 붙여서 투여할 수 있도록 구현함이 바람직하다: 이때, 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 전기 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 및/또는 리포좀 제제)를 함유하며, 겔 조성물은 카르복시메틸 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 아크릴산 중합체, 카르보폴(carbopol) 등의 젤제제와 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유하며, 경피흡수용 점착제제는 유효성분층이 점착제층, 피지흡수를 위한 흡착층 및 치료약물층을 포함하고, 치료약물층은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유한다.

서바이빈을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 siRNA 의 유효량

본 발명의 서바이빈을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 siRNA의 투여량은, 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라, 체중 kg 당 0.05 내지 0.1㎍을 비경구 투여할 수 있다. 특이 증상을 나타내는 환자에 대한 투 여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 등에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수도 있다.

서바이빈을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 siRNA 의 급성독성실험

6 내지 7주령 된 비설치류 비글견(beagle)을 대상으로 본 발명의 siRNA를 비경구투여하여 24시간내의 개체사망율을 조사하였으며, 이때 암컷은 6 내지 8㎏인 개체를, 수컷은 7 내지 9㎏인 개체를 각각 8마리 사용하였다. 그 결과, 10㎍/kg 까지 죽은 개체가 발생하지 않았는 바, 본 발명의 서바이빈을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 siRNA는 kg당 10㎍까지도 급성독성을 관찰할 수 없을 만큼 안전하므로, 생체내에 안전하게 투여할 수 있다.

본 발명의 서바이빈을 암호화하는 mRNA와 상보결합할 수 있는 siRNA는 거의 모든 종양으로부터 공통적으로 발현되는 서바이빈의 발현을 억제할 수 있으므로, 범용적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 목표 염기서열의 디자인 및 siRNA의 제조

서바이빈 mRNA 서열(NM_001168)에서 siRNA가 결합할 수 있는 목표 염기서열을 디자인하고, 전기 목표 염기서열과 결합할 수 있는 이중가닥 siRNA를 제조하였다.

먼저, 퀴아젠사(Qiagen Inc., Germany)의 홈페이지에서 제공하는 유전자 디자인 프로그램(http://www1.qiagen.com/default.aspx), 다마콘사(Dharmacon Inc. USA)의 홈페이지(http://www.dharmacon.com/)에서 제공하는 유전자 디자인 프로그램 및 진스크립트사(Genscript Corp., USA)의 홈페이지(http://www.Genscript.com/)에서 제공하는 유전자 디자인 프로그램을 사용하여, 서바이빈 mRNA 서열(NM_001168)에서 siRNA가 결합할 수 있는 목표 염기서열을 디자인하였다.

한편, β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 DNA 구조의 골격을 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 사용하여, 전기 디자인된 목표 염기서열과 결합할 수 있는 siRNA를 합성하였다(참조: Sinha et al., Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984).

즉, RNA 합성기(Perseptive Biosystems 8909, PE Biosystems, USA)를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반 복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다. 이어, 전기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan)을 사용한 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)에 적용하여, RNA를 분리하고 이를 MALDI-TOF 질량 흡광분석기(Shimadzu, Japan)에 적용하여, 합성하고자 하는 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 그런 다음, 센스와 안티센스 RNA가닥을 결합시켜서, 목적하는 이중가닥 siRNA(서열번호 1 내지 서열번호 82)를 각각 제조하였다.

실시예 2: siRNA를 이용한 종양 세포주에서의 서바이빈의 발현억제

전기 실시예 1에서 제조한 각각의 siRNA를 이용하여, 종양 세포주인 인간 폐암 세포주(A549)와 인간 자궁암 세포(Hela)를 형질전환시키고, 전기 형질전환된 종양 세포주에서 서바이빈의 발현양상을 측정하였다.

실시예 2-1: 종양 세포주의 배양

미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암 세포주(A549)를 DMEM 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100units/ml 및 스트렙토마이신 100ug/ml)에서 37℃, 5%(v/v) CO₂의 조건하에 배양하였다. 한편, 인간 자궁암 세포(Hela)는 역시 미합중국 종균협회로 부터 입수하여, RPMI 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100units/ml 및 스트렙토마이신 100ug/ml)에서 37℃, 5%(v/v) CO₂의 조건하에 배양하였다.

실시예 2-2: siRNA를 이용한 종양 세포주의 형질전환

전기 실시예 2-1에서 배양된 각각의 종양 세포주 3.3 X 10⁵를 6-웰 플레이트에서 전기 실시예 2-1의 조건으로 24시간 동안 배양하고, Opti-MEM 배지(GIBCO/Invitrogen, USA)로 세척한 다음, 각 웰당 800㎕의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.

한편, 전기 배양된 세포주를 형질전환시키기 위한 형질전환용 용액은 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 사이포트 아민(siPORT Amine, Ambion, USA) 10㎕와 Opti-MEM 배지 188㎕를 혼합하고, 실온에서 20분간 반응시킨 다음, 전기 실시예 1에서 제조한 각각의 siRNA 2㎕(50μM/㎕)를 첨가하고, 다시 실온에서 20분간 반응시켜서, 형질전환용 용액을 제조하였다. 그런 다음, 전기 Opti-MEM이 분주된 종양 세포주의 각 웰에 형질전환용 용액을 각각 200㎕씩 분주하고, 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하고, 각 종양 세포주에 DMEM 배양배지 또는 RPMI 배양배지 2.5㎖를 각 웰에 분주한 다음, 24시간 동안 37℃, 5%(v/v) CO₂의 조건하에 배양하였다.

실시예 2-3: 서바이빈 mRNA의 정량분석

RNA 추출키트(RNeasy mini kit, Qiagen, Germany)를 이용하여, 전기 실시예 2-2에서 배양된 형질전환된 종양 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 전체 RNA 중 서바이빈 mRNA의 양을 RNA 정량키트(Quantigene, Genospectra, USA)를 사용하여, 다음과 같은 방법으로 정량하였다.

즉, 96-웰 플레이트의 각 웰에 RNA 정량키트의 캡쳐 혼성화 용액 50㎕와 용해 작용시약 50㎕를 넣고, 전기 수득한 전체 RNA 4㎍을 가한 다음, 53℃에서 20시간 혼성화시킨 후, 반응용액을 제거하였다. 이어, 각 웰에 키트의 증폭 작용시약 100㎕를 넣고 53℃에서 60분동안 혼성화시키고, 반응용액을 제거한 다음, 키트의 라벨 프로브 작용시약 100㎕를 각 웰에 분주하였으며, 다시 53℃에서 60분동안 혼성화시켰다. 그런 다음, 반응시약을 제거하고, 키트의 기질 작용시약 100㎕를 각 웰에 분주하였으며, 다시 53℃에서 30분동안 반응시켰다. 끝으로, 반응이 종료된 96-웰 플레이트를 형광 및 발광측정기(Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems, USA)에 넣고 발광값을 측정하여 정량하고, 이를 대조군의 정량값과 비교하였다. 이때, 대조군은 동일한 전체 RNA에서 측정한 β-액틴 mRNA을 사용하였다(참조: 도 1). 도 1은 본 발명의 82개의 siRNA를 이용하여, 형질전환시킨 세포주에서 발현되는 서바이빈 mRNA의 수준을 나타내는 그래프로서, NC는 대조군을 의미한다. 도 1에서 보듯이, 82개의 siRNA에 의하여 형질전환된 세포주에 존재하는 서바이빈 mRNA 의 수준은 대조군의 0 내지 20%, 20 내지 60%, 60 내지 99% 및 100%를 나타내는 4가지 그룹으로 구분되는데, 대조군의 0 내지 20%를 나타내는 siRNA는 서열번호 12, 19, 37, 41, 43, 44, 48, 52, 55, 59, 60, 62, 67, 69, 73, 77, 78, 79 및 82이고; 대조군의 20 내지 60%를 나타내는 siRNA는 서열번호 2, 3, 5, 6, 17, 18, 20, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 34, 36, 40, 42, 45, 47, 49, 53, 54, 56, 57, 63, 66, 70, 71, 76 및 81이며; 대조군의 60 내지 99%를 나타내는 siRNA는 서열번호 1, 7, 10, 11, 13, 14, 15, 23, 30, 32, 33, 39, 46, 50, 51, 61, 64, 65, 72, 74, 75 및 80이고; 대조군의 100%를 나타내는 siRNA는 서열번호 4, 8, 9, 16, 21, 22, 35, 38, 58 및 68임을 확인할 수 있었다. 특히, 서열번호 43의 siRNA는 대조군의 0%를 나타내었는 바, 서바이빈의 발현을 가장 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2-4: 서바이빈 mRNA의 노던 블럿(Northern blot) 분석

전기 실시예 2-3에서, 세포내 서바이빈 mRNA의 수준을 효과적으로 저하시킬 수 있는 siRNA를 이용하여, 형질전환시킨 세포주를 대상으로 하고, 서바이빈 유전자의 일부서열을 갖는 프로브를 이용하여, 노던 블럿을 수행하였다.

즉, RNA 추출키트(RNeasy mini kit, Qiagen, Germany)를 이용하여, 전기 실시예 2-2에서 배양된 형질전환된 종양 세포주 중, 서열번호 19, 26, 41, 43, 44, 48, 55, 59, 60, 67, 69, 73, 78 및 79로 형질전환된 각각의 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 전체 RNA 5㎍을 1% 아가로스/포름알데히드 젤 상에서 전기영동하고, Hybond-N+ 나일론 막(Amersham, USA)에 전이시킨 다음, UV 크로스링커(Amersham, USA)를 사용하여 막에 UV-가교결합(crosslinking)시켰다. 이어, RNA가 가교결합된 나일론 막을 혼성화 용액에 침지하고, 65℃에서 30분간 예비 잡종화시켰다(참조: Church & Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:1991-1995, 1984). 그런 다음, 열-변성된 방사성 서바이빈 프로브를 첨가하여 65℃에서 20시간동안 혼성화시켰다.

이때, 열-변성된 방사성 서바이빈 프로브는 네스티드(nested) PCR 방법과 라벨링 키트를 사용하여, 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 먼저, 서바이빈 cDNA를 주형으로 하고, 센스프라이머 5'-gtgtttcttctgcttcaagg-3'(서열번호 83)와 안티센스프라이머: 5'-cgaatcaaatccatcatctt-3'(서열번호 84)를 이용하여, PCR을 수행한 다음, 수득한 PCR 절편을 주형으로 하고, 센스프라이머: 5'-gtaacagtggctgcttctct-3'(서열번호 85)와 안티센스프라이머: 5'-cgaatcaaatccatcatctt-3'(서열번호 86)를 사용한 PCR을 수행하여 서바이빈 유전자의 염기서열 684번에서 1515번을 포함하는 832bp의 DNA 단편을 작제하였다. 전기 작제된 DNA 단편과 α-³²P을 라벨링 키트(Prime-It II random primer, Stratagene, USA)에 적용하여 열-변성된 방사성 프로브를 제조하였다.

또한, 대조군으로서 β-액틴 mRNA를 이용하였는데, 이를 위한 프로브는 β-액틴(NM_001101) cDNA를 주형으로 하고, 센스프라이머 5'-ccagatcatgtttgagacct- 3'(서열번호 87)와 안티센스프라이머: 5'-aaacaacaatgtgcaatcaa-3'(서열번호 88)를 이용하여, PCR을 수행한 다음, 수득한 PCR 절편을 주형으로 하고, 센스프라이머: 5'-ccagatcatgtttgagacct-3'(서열번호 89)와 안티센스프라이머: 5?-caactaagtcatagtccgcc-3'(서열번호 90)를 사용한 PCR을 수행하여 β-액틴 유전자의 염기서열 433번에서 1220번까지를 포함하는 788bp의 DNA 단편을 작제하였다. 전기 작제된 DNA 단편과 α-³²P을 라벨링 키트에 적용하여 대조군에 대한 방사성 프로브를 제조하였다.

서바이빈 프로브로 혼성화가 종료된 나일론 막을 세척하고, X-선 필름에 3일동안 감광시킨 다음, 인화하였다. 이어, 나일론 막을 액틴 프로브로 혼성화 및 세척후 X-선 필름에 1시간동안 감광시킨 후, 인화하고, 인화된 각 필름을 비교하였다(참조: 도 2). 도 2는 siRNA에 의하여 형질전환된 세포내에서 서바이빈의 mRNA 수준을 나타내는 노던블롯 사진으로서, NC는 대조군을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 본 발명의 siRNA에 의하여, 서바이빈의 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준이 감소됨을 알 수 있었고, 특히, 서열번호 43의 siRNA는, 도 1의 결과와 동일하게, 서바이빈의 mRNA를 가장 낮은 수준으로 감소시켰으므로, 서바이빈의 발현을 가장 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2-4: 서열번호 43의 siRNA의 암세포 증식 억제효과

서열번호 43의 siRNA를 50nM의 농도로 처리하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 2-2와 동일한 방법을 이용하여 형질전환된 암세포를 수득하고, 4일 동안 배양한 다음, 암세포를 수거하고, 이의 세포수를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 형질전환되지 않은 암세포를 사용하였다(참조: 도 3). 도 3은 서열번호 43의 siRNA의 항암효과를 나타내는 그래프로서, 서열번호 43의 siRNA로 형질전환된 암세포는 대조군의 암세포에 비하여, 현저하게 세포수가 감소되었음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 siRNA는 서바이빈의 mRNA 수준을 감소시킬 뿐만 아니라, 서바이빈의 발현감소에 따른 암세포의 증식억제를 직접적으로 유발시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 2-5: 변형된 서열번호 43의 siRNA의 서바이빈 발현억제효과(I)

상기 실시예 2-3 및 2-4에서 우수한 효과를 나타내는 서열번호 43의 siRNA의 3' 또는 5' 방향으로 뉴클레오티드를 가감하여, 서열번호 43의 siRNA와 동일한 수의 뉴클레오티드를 갖고, 하기의 변형된 서열을 갖는 서열번호 43의 siRNA의 변형체(서열번호 91 내지 97)를 각각 작제하였다(참조: 표 1a).

서열번호 43의 siRNA의 변형체의 염기서열

서열번호	염기서열
43 91 92 93 94 95 96 97	5'-aaggagaucaacauuuuca-3' 5'-uaggaaaggagaucaacau-3' 5'-aggaaaggagaucaacauu-3' 5'-ggaaaggagaucaacauuu-3' 5'-gaaaggagaucaacauuuu-3' 5'-aaaggagaucaacauuuuc-3' 5'-aggagaucaacauuuucaa-3' 5'-ggagaucaacauuuucaaa-3'

이어, 전기 작제된 변형체를 50nM의 농도로 처리하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 2-2와 동일한 방법을 이용하여 각각의 형질전환된 암세포를 수득하였다.

RNA 추출키트(RNeasy mini kit, Qiagen, Germany)를 이용하여, 전기 수득한 각각의 형질전환된 암세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 이를 시료로 사용하여, 전체 RNA 중 서바이빈 mRNA의 양을 실시간 PCR (Real-time PCR) 방법을 사용하여, 다음과 같은 방법으로 정량하였다.

즉, 각 시료의 전체 RNA 2㎍을 oligo-dT₁₈ (500ng/㎕) 0.5㎕ 및 dNTP(각 2.5mM) 3.2㎕와 같이 혼합하고, 70℃에서 5분간 반응시킨 다음, 얼음에서 1분간 냉각시키고, 역전사효소(Superscript II (200U/㎕), Invitrogen) 1㎕, 5X 반응완충액 4㎕ 및 적량의 멸균수를 혼합하여, 전체 부피를 20㎕로 맞춘 후, 42℃에서 1시간 반응시키고, 70℃에서 15분동안 반응시켜서 각각의 cDNA를 수득하였다. 그런 다음, 각각의 cDNA 0.5㎕, 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems Prism 7900 Sequence Detection System, Applied Biosystems, USA)의 SYBR Green Master Mix 10㎕, 서바이빈 및 GAPDH에 특이적인 각각의 센스 프라이머(10pM) 0.5㎕ 및 안티센스 프라이머(10pM) 0.5㎕을 혼합한 다음, 실시간 PCR을 수행하였다(50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 40회 반복).

이때, 사용된 센스 프라이머와 안티센스 프라이머의 서열은 다음과 같다:

서바이빈 특이적인 센스 프라이머 5'-gcaccacttccagggtttat-3'(서열번호 118)

서바이빈 특이적인 안티센스 프라이머 5'-ctctggtgccactttcaaga-3'(서열번호 119)

GAPDH 특이적인 센스 프라이머 5'-tgcaccaccaactgcttagc-3'(서열번호 120)

GAPDH 특이적인 안티센스 프라이머 5'-ggcatggactgtggtcatgag-3'(서열번호 121)

PCR이 종료된 후, cDNA 표준곡선을 사용하여, 각각의 수득한 서바이빈 PCR 산물의 양 및 GAPDH PCR 산물의 양을 측정하고, 서바이빈의 측정값을 GAPDH의 측정값으로 나누어, 서바이빈 상대적 발현량을 산출하고, 이로부터 서바이빈 mRNA의 발현감소율을 비교하였다(참조: 표 1b).

서열번호 43의 siRNA의 변형체의 서바이빈 발현 감소율(단위: %)

서열번호	서바이빈 발현 감소율
43 91 92 93 94 95 96 97	68.2 49.5 66.1 68.4 75.3 50.0 72.4 75.8

상기 표 1b에서 보듯이, 일부 변형체(서열번호 92, 93, 94, 96 및 97)는 서열번호 43의 siRNA와 유사한 수준의 서바이빈 발현 감소율을 나타내었으나, 일부 변형체(서열번호 91 및 95)는 서열번호 43의 siRNA보다 현저히 낮은 수준의 서바이빈 발현 감소율을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 2-6: 변형된 서열번호 43의 siRNA의 서바이빈 발현억제효과(II)

상기 실시예 2-3 및 2-4에서 우수한 효과를 나타내는 서열번호 43의 siRNA의 3' 및 5' 방향으로 뉴클레오티드를 증가시켜서, 서열번호 43의 siRNA보다 증가된 수의 뉴클레오티드를 갖고, 하기의 변형된 서열을 갖는 서열번호 43의 siRNA의 변형체(서열번호 98 내지 117)를 각각 작제하였다(참조: 표 1c).

서열번호 43의 siRNA의 변형체의 염기서열

변형체	센스 염기서열(5'-3')	서열번호	안티센스 염기서열(5'-3')	서열번호
Sur58-27R-0 Sur58-27R-1 Sur58-27R-2 Sur58-27R-3 Sur58-27R-4 Sur58-27R-5 Sur58-27R-6 Sur58-27R-7 Sur783-27R Sur1106-27R	ggagaucaacauuuucaaauuagau aggagaucaacauuuucaaauuaga aaggagaucaacauuuucaaauuag aaaggagaucaacauuuucaaauua gaaaggagaucaacauuuucaaauu ggaaaggagaucaacauuuucaaau aggaaaggagaucaacauuuucaaa uaggaaaggagaucaacauuuucaa ggcagugucccuuuugcuagagcug agaauagcacaaacuacaauuaaaa	98 100 102 104 106 108 110 112 114 116	aucuaauuugaaaauguugaucuccuu ucuaauuugaaaauguugaucuccuuu cuaauuugaaaauguugaucuccuuuc uaauuugaaaauguugaucuccuuucc aauuugaaaauguugaucuccuuuccu auuugaaaauguugaucuccuuuccua uuugaaaauguugaucuccuuuccuaa uugaaaauguugaucuccuuuccuaag cagcucuagcaaaagggacacugccuu uuuuaauuguaguuugugcuauucugu	99 101 103 105 107 109 111 113 115 117

이어, 상기 실시예 2-5와 동일한 방법을 이용하여, 각 변형체의 서바이빈 mRNA의 발현감소율을 비교하였다(참조: 표 1d).

변형체	서바이빈 발현 감소율
서열번호 43 Sur58-27R-0 Sur58-27R-1 Sur58-27R-2 Sur58-27R-3 Sur58-27R-4 Sur58-27R-5 Sur58-27R-6 Sur58-27R-7 Sur783-27R Sur1106-27R	68.2 63.4 58.8 66.1 69.0 69.6 62.9 63.5 74.3 75.2 67.0

상기 표 1d에서 보듯이, 대부분의 변형체가 서열번호 43의 siRNA와 유사한 수준의 서바이빈 발현 감소율을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 2-7: 변형된 서열번호 43의 siRNA의 서바이빈 발현억제효과(III)

서열번호 43의 siRNA의 혈청 내 안정성을 증가시키기 위하여, 전기 siRNA에 2'-F, 메틸(2'-O-methyl), 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 3'-인버티드 데옥시티미딘(3'-inverted deoxythymidine)기를 도입하여 다음과 같이 변형시킨 후 혈청 내 안정성과 서바이빈 mRNA 감소 효율을 측정하였다(참조: 표 1e).

서열번호 43의 siRNA의 변형체에 있어서, 변형된 위치와 수식

변형체	센스 염기서열	안티센스 염기서열
Me-SP Me-F py-1 py-5 py-6	5'- aaggagaucaacauuuuca dTdT-3' 5'- aaggagaucaacauuuuca dTdT-3' 5'-aaggaga uc aa c a uuuuc adTdT-3' 5'-aaggaga uc aa c a uuuuc adTdT-3' 5'-aaggaga uc aa c a uuuuc adTdT-3'	5'-dTdTu s u s c s c s u s c s u s a s g s u s u s g s u s a s a s a s a s g s u-3' 5'-dTdTdTdT *uuccucu* aguug u aaaag u -3' 5'-dTdT uuccucu ag uu g u aaaag u -3' 5'-dTdT uuccucu aguug u aaaag u -3' 5'-idTdT uuccucu ag uu g u aaaag u -3'

상기 표 1e에서, 밑줄친 굵은 글씨 는 메틸(2'-O-methyl)이 부가된 변형을 나타내고, 이탤릭 굵은 글씨 는 2'-F가 부가된 변형을 나타내며, 염기서열 사이의 밑줄친 s 는 포스포로티오에이트가 부가된 변형을 나타내고, 이탤릭 idT는 3'-인버티드 데옥시티미딘이 부가된 변형을 의미한다.

이어, 상기 실시예 2-5와 동일한 방법을 이용하여, 각 변형체의 서바이빈 mRNA의 발현감소율을 비교하고, 다음과 같은 방법으로 상기 각 변형체의 혈액내 안정성을 측정하였다.

즉, 각각의 변형체 9㎍을 안정성 반응액(사람 혈청 10% 포함) 90㎕에 가하고, 37℃에서 방치하였다. 이어, 0, 1, 3, 6, 24, 36 및 48시간이 경과한 시점에서 12㎕씩을 분주하여, -70℃에 즉시 얼려서 보관하고, 보관된 각각의 시간별 시료 2.5㎕를 전기 영동하여, 혈청내에서 각 변형체가 유지되는 지의 여부를 확인하였다(참조: 표 1f, 도 4).

변형체	서바이빈 발현 감소율
서열번호 43 Me-SP Me-F py-1 py-5 py-6	80 75 71 37 73 78

상기 표 1f에서 보듯이, 대부분의 변형체(Me-SP, Me-F, py-5 및 py-6)가 서열번호 43의 siRNA와 유사한 수준의 서바이빈 발현 감소율을 나타내었으나, 일부 변형체(py-1)는 서열번호 43의 siRNA보다 현저히 낮은 수준의 서바이빈 발현 감소율을 나타냄을 알 수 있었다.

도 4는 서열번호 43의 siRNA의 변형체의 시간의 경과에 따른 혈청내에서의 안정성을 비교한 전기영동사진으로서, a열은 변형되지 않은 서열번호 43의 siRNA를 나타내고, b열은 변형체 Me-SP를 나타내며, c열은 변형체 Me-F를 나타내고, d열은 변형체 py-1을 나타내며, e열은 변형체 py-5를 나타내고, f열은 변형체 py-6를 나타낸다.

도 4에서 보듯이, 서열번호 43의 siRNA는 1시간 이내에 모두 분해되는 반면, 다른 변형체들은 48시간까지도 상당량 잔류함을 확인하였다.

따라서, 서열번호 43의 siRNA에 2'-F, 메틸(2'-O-methyl) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)기를 도입하여 제조된 대부분의 변형체(py-1는 제외)는 서바이빈의 발현을 효과적으로 감소시키면서도, 혈청내에서 우수한 안정성을 나타내므로, 효과적인 비경구투여용 항암제의 제조에 활용될 수 있을 것으로 분석되었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 서바이빈의 발현을 억제하는 이중가닥 siRNA 및 전기 이중가닥 siRNA를 유효성분으로 하는 항암제를 제공한다. 본 발명의 서바이빈을 암호화하는 mRNA와 상보결합할 수 있는 siRNA는 거의 모든 종양으로부터 공통적으로 발현되는 서바이빈의 발현을 억제할 수 있으므로, 범용적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

<110> Bioneer Inc. <120> siRNA for Inhibiting Survivin Gene Expression <160> 121 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 1 ucaaggacca ccgcaucuc 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 2 aaggaccacc gcaucucua 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 3 ggaccaccgc aucucuaca 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 4 gaccaccgca ucucuacau 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 5 caccgcaucu cuacauuca 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 6 gcaucucuac auucaagaa 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 7 ucucuacauu caagaacug 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 8 acauucaaga acuggcccu 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 9 ucaagaacug gcccuucuu 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 10 cugagaacga gccagacuu 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 11 uuggcccagu guuucuucu 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 12 cccaguguuu cuucugcuu 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 13 uucuucugcu ucaaggagc 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 14 ggaacauaaa aagcauucg 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 15 aagcauucgu ccgguugcg 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 16 uucguccggu ugcgcuuuc 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 17 ccgguugcgc uuuccuuuc 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 18 cgguugcgcu uuccuuucu 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 19 ugcgcuuucc uuucuguca 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 20 cgcuuuccuu ucugucaag 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 21 uuuccuuucu gucaagaag 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 22 uucugucaag aagcaguuu 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 23 ucugucaaga agcaguuug 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 24 ugucaagaag caguuugaa 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 25 agaagcaguu ugaagaauu 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 26 gaagcaguuu gaagaauua 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 27 agcaguuuga agaauuaac 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 28 auuaacccuu ggugaauuu 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 29 aacccuuggu gaauuuuug 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 30 ccuuggugaa uuuuugaaa 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 31 ggugaauuuu ugaaacugg 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 32 aacuggacag agaaagagc 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 33 acagagaaag agccaagaa 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 34 agagccaaga acaaaauug 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 35 caagaacaaa auugcaaag 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 36 uugcaaagga aaccaacaa 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 37 aaggaaacca acaauaaga 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 38 acugcgaaga aagugcgcc 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 39 acuuccaggg uuuauuccc 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 40 uagcaauguc uuaggaaag 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 41 gcaaugucuu aggaaagga 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 42 ugucuuagga aaggagauc 19 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 43 aaggagauca acauuuuca 19 <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 44 ccuguuuugu cuugaaagu 19 <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 45 gcugcuucuc ucucucucu 19 <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 46 uaccagguga gaagugagg 19 <210> 47 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 47 gaaggcagug ucccuuuug 19 <210> 48 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 48 ggcagugucc cuuuugcua 19 <210> 49 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 49 gacagcuuug uucgcgugg 19 <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 50 ugugucugga ccucauguu 19 <210> 51 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 51 uugaggcugu cacaguccu 19 <210> 52 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 52 gguuccuuau cugucacac 19 <210> 53 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 53 uccuuaucug ucacaccug 19 <210> 54 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 54 uugguagaug caugacuug 19 <210> 55 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 55 ugcaugacuu gugugugau 19 <210> 56 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 56 gugugugaug agagaaugg 19 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 57 gugaugagag aauggagac 19 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 58 acauggcuuu cuuauuuug 19 <210> 59 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 59 aauucacaga auagcacaa 19 <210> 60 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 60 agaauagcac aaacuacaa 19 <210> 61 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 61 acuaagcaca aagccauuc 19 <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 62 aagcacaaag ccauucuaa 19 <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 63 agcacaaagc cauucuaag 19 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 64 agccauucua agucauugg 19 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 65 gccauucuaa gucauuggg 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 66 ggagacagaa uagagugau 19 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 67 gagacagaau agagugaua 19 <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 68 auaggaagcg ucuggcaga 19 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 69 gcgucuggca gauacuccu 19 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 70 ucuggcagau acuccuuuu 19 <210> 71 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 71 cacugcugug ugauuagac 19 <210> 72 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 72 ugugauuaga caggcccag 19 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 73 ggcaguggcc uaaauccuu 19 <210> 74 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 74 uuaaaugacu uggcucgau 19 <210> 75 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 75 ccaaccuuca caucuguca 19 <210> 76 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 76 ccuucacauc ugucacguu 19 <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 77 ggcugaaguc uggcguaag 19 <210> 78 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 78 gcugaagucu ggcguaaga 19 <210> 79 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 79 ggcguaagau gauggauuu 19 <210> 80 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 80 uggauuugau ucgcccucc 19 <210> 81 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 81 gauuguuaca gcuucgcug 19 <210> 82 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 82 cggcuguucc ugagaaaua 19 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 gtgtttcttc tgcttcaagg 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 cgaatcaaat ccatcatctt 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 gtaacagtgg ctgcttctct 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 cgaatcaaat ccatcatctt 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 ccagatcatg tttgagacct 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 aaacaacaat gtgcaatcaa 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 ccagatcatg tttgagacct 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 caactaagtc atagtccgcc 20 <210> 91 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 91 uaggaaagga gaucaacau 19 <210> 92 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 92 aggaaaggag aucaacauu 19 <210> 93 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 93 ggaaaggaga ucaacauuu 19 <210> 94 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 94 gaaaggagau caacauuuu 19 <210> 95 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 95 aaaggagauc aacauuuuc 19 <210> 96 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 96 aggagaucaa cauuuucaa 19 <210> 97 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 97 ggagaucaac auuuucaaa 19 <210> 98 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 98 ggagaucaac auuuucaaau uagau 25 <210> 99 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 99 aucuaauuug aaaauguuga ucuccuu 27 <210> 100 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 100 aggagaucaa cauuuucaaa uuaga 25 <210> 101 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 101 ucuaauuuga aaauguugau cuccuuu 27 <210> 102 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 102 aaggagauca acauuuucaa auuag 25 <210> 103 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 103 cuaauuugaa aauguugauc uccuuuc 27 <210> 104 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 104 aaaggagauc aacauuuuca aauua 25 <210> 105 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 105 uaauuugaaa auguugaucu ccuuucc 27 <210> 106 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 106 gaaaggagau caacauuuuc aaauu 25 <210> 107 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 107 aauuugaaaa uguugaucuc cuuuccu 27 <210> 108 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 108 ggaaaggaga ucaacauuuu caaau 25 <210> 109 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 109 auuugaaaau guugaucucc uuuccua 27 <210> 110 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 110 aggaaaggag aucaacauuu ucaaa 25 <210> 111 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 111 uuugaaaaug uugaucuccu uuccuaa 27 <210> 112 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 112 uaggaaagga gaucaacauu uucaa 25 <210> 113 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 113 uugaaaaugu ugaucuccuu uccuaag 27 <210> 114 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 114 ggcagugucc cuuuugcuag agcug 25 <210> 115 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 115 cagcucuagc aaaagggaca cugccuu 27 <210> 116 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 116 agaauagcac aaacuacaau uaaaa 25 <210> 117 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 117 uuuuaauugu aguuugugcu auucugu 27 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 gcaccacttc cagggtttat 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 ctctggtgcc actttcaaga 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 tgcaccacca actgcttagc 20 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 ggcatggact gtggtcatga g 21

Claims

서바이빈(survivin)을 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합할 수 있고, 세포내에서 서바이빈 발현을 억제하는 이중가닥 siRNA.
제 1 항에 있어서,

서열번호 1 내지 82, 92 내지 94, 96 내지 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114 및 116의 염기서열을 가지는 이중가닥 RNA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는

이중가닥 siRNA.
서열번호 41, 43, 44, 48, 60, 69 및 73으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종의 염기서열을 가지는 이중가닥 siRNA.
서바이빈(survivin)을 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합할 수 있고, 세포내에서 서바이빈 발현을 억제하는 이중가닥 siRNA를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암제.
제 4항에 있어서,

siRNA는 서열번호 1 내지 82, 92 내지 94, 96 내지 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114 및 116의 염기서열을 가지는 이중가닥 RNA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는

항암제.
제 4항 또는 제 5항에 있어서,

siRNA는 2'-F, 메틸(2'-O-methyl) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 기가 도입된 변형체 siRNA인 것을 특징으로 하는

항암제.