KR20080091108A

KR20080091108A - 안구의 혈관신생 치료용 ＨＩＦ１Ａ의 ＲＮＡⅰ－매개 억제

Info

Publication number: KR20080091108A
Application number: KR1020087015417A
Authority: KR
Inventors: 존 이. 차테르톤; 데이비드 피. 빙거먼
Original assignee: 알콘 리서치, 리미티드
Priority date: 2005-12-29
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2008-10-09
Also published as: US20190338287A1; CN101326287A; US20190256854A1; US20220042021A1; EP1966378A2; WO2007076351A3; US8471000B2; US20210108206A1; US20220162614A1; US20100144844A1; US20120245217A1; US7981870B2; US20220364097A1; TW200731980A; US20200392508A1; US20170198294A1; US20190071676A1; US20210230603A1; US20110257246A1; RU2008130857A

Abstract

안구의 혈관신생, 특히 망막 부종, 당뇨병성 망막증, 망막 허혈과 관련된 후유증, 후부 신혈관 형성(PSNV) 및 신생혈관성 녹내장을 갖는 환자 및 이러한 증상으로의 진행 위험에 있는 환자를 치료하기 위한 HIF1A mRNA의 발현 억제용 RNA 간섭이 제공된다.

Description

안구의 혈관신생 치료용 ＨＩＦ１Ａ의 ＲＮＡⅰ－매개 억제{RNAi-MEDIATED INHIBITION OF HIF1A FOR TREATMENT OF OCULAR ANGIOGENESIS}

본 발명은 직접 또는 간접적으로 안구 신생 혈관화, 망막 부종, 당뇨병성 망막증, 예를 들어, 망막 허혈, 후부 신혈관 형성 및 신생혈관성 녹내장과 관련된 후유증을 유도하는 HIF-1α의 전사 인자 활성에 의한 세포적 변화를 포함하는, 안구의 혈관신생에서 저산소 유도인자-1α(HIF-1α)의 발현, HIF1A mRNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현의 억제를 위한 간섭 RNA 조성물에 관한 것이다.

당뇨병성 망막증(DR)은 라인(line) 혈관, 즉 망막 미세혈관 내피세포의 변화에서 기인한 당뇨병에서 진행되는 안과 질환이다. 당뇨병 중에, 고혈당증은 여러가지 방식으로 손상을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 글루코오스 또는 글루코오스의 대사산물은 단백질의 아미노 그룹에 결합하여, 조직 손상을 초래한다. 또한, 과도한 글루코오스는 폴리올 경로에 들어가 솔비톨의 축적을 유도한다. 솔비톨은 망막 세포에 의해 물질대사로 변화시킬 수 없고 고삼투압, 세포내 부종, 손상된 확산, 조직 저산소증, 모세혈관 세표 손상 및 모세혈관 약화를 초래할 수 있다. 당뇨병 성 망막증은 번갈아 주위세포, 망막 모세혈관에서 우세한 혈관 주위 세포 타입, 내피 세포와 접촉하는 것을 저지하는 모세혈관 기저막의 두께와 관련있다. 주위세포 및 내피 세포 사멸은 당뇨병성 망막증 중에 아포토시스 기작을 통하여 발생하고, 여기에서 주위세포의 상실은 모세혈관의 투과성을 증가시킬 것이고, 혈액-망막 장벽의 파손 및 혈액 흐름 조절기능저하를 유도한다. 약화된 모세혈관은 동맥류 형성 및 추가의 누출을 유도한다. 고혈당증의 이러한 영향은 또한 망막에서 신경 기능을 손상시킬 수 있다. DR은 망막 미세동맥류, 출혈, 삼출물, 및 망막염, 증식 즉, 대량의 신생혈관 및 망망 내부 표면 상의 인접 조직 성장과 관련 있다. 당뇨병성 망막증은 미세동맥류; 내부망막 반점 출혈; 노란색 왁스의 함출물; 면-울 패치; 및 황반 부종에 의한 진행으로 특정지어지는, 배경 타입일 수 있다. 이는 비증식 당뇨병성 망막증이라 불리는 당뇨병성 망막증의 초기 단계이다.

당뇨로 유도된 미세혈관 질병 진행에서와 같이, 망막 모세혈관은 실제로 폐색되고 망막 내로 허혈 저산소증의 다발초점성 영역을 유도한다. 비관류 조직에서 저산소증 증상은 HIF-1α 수준의 증상을 초래한다. HIF-1-매개 유전자 발현에서 결과의 변화는 존재하는 관으로부터의 정상적인 새로운 혈관 성장을 촉진할 수 있는 성장 인자의 생산을 유도한다(신생혈관형성). 이들 병적인 새로운 혈관은 유리체로 성장하고, 부서지기 쉬워서 눈으로 혈액을 누출시키려는 경향이 있으므로, 시력 상실, 증식성 당뇨병성 망막증(PDR)이라 칭해지는 증상을 일으킬 수 있다. DR의 증식성 타입은 망막의 신혈관 형성 및 유리체로 돌출시킬 수 있는 시신경 원판, 섬유상 조직의 증식, 유리체 출혈, 및 망막 박리에 의해 특정지어 진다.

신혈관 형성은 또한 증가된 안구내 압력이 결합 조직의 성장 및 섬유주 상 새로운 혈관에 의해 기인되는 신생혈관성 녹내장이라 칭해지는 타입의 녹내장을 일으킬수 있다. 신생혈관성 녹내장은 챔버 각(chamber angle)에서 신혈관 형성에 의해 야기되는 제 2차 녹내장의 형태이다.

후부 신혈관 형성(PSNV)은 선진국에서 후천적 시각상실의 시력 손상 병리학에서 두 가지의 가장 흔한 원인이다: 삼출성 노인성 황반 변성(AMD) 및 PDR. 최근까지, 삼출성 AMD중에 발생하는 PSNV에 대하여 승인된 치료는 단지 레이저 광응고 또는 VISUDYNE™에 의한 광역학 치료법뿐이었다. 상기 양자의 치료는 영향받은 맥관구조의 폐색과 관련 있고, 이는 망막에 레이저-유도 손상을 영원히 초래하고, 신혈관 형성의 근본적인 원인을 어드레스하지는 않는다. 동일한 영역에서의 신혈관 형성의 재발은 일반적이다. PDR 환자에 있어서, 유리체 절제술 및 망막전 막의 제거를 갖는 외과적 처치술은 범망막 광응고라 불리는 레이저 치료에서뿐만 아니라 더이상의 새로운 관의 생산을 막기 위하여 단지 현행 가능한 옵션이다.

현행의 약제학적 연구는, 예컨대, VEGF, HIF-1을 조절하는 유전자와 같은 잠재적인 혈관신생 인자의 효능을 억제하는데 촛점을 맞추고 있다. 최근, LUCENTIS™의 유리체 주입, 항-VEGF 항체 단편이 AMD의 치료에 승인되었다. 이 항체 단편은 VEGF에 결합하도록 설계되어 VEGF를 억제하여 새로운 혈관 형성을 억제한다. 루센티스는 또한 당뇨성 황반 부종의 치료에 대한 임상적 시도이다. 다른 접근은 VEGF 또는 그의 수용체를 표적으로 하는 작은 간섭 RNA의 사용을 포함한다.

산소 감수성 수용체에서 통상의 작은 분자 억제제를 사용한 HIF-1 전사 인자 및 저산소증 반응 요소 사이의 상호작용의 붕괴는 매우 어려워 보인다. VEGF와 유사하게, HIF1A는 전통적인 지식으로는 "의약이 될만하다"고 고려되지 않았다. 또한, VEGF 또는 RTP801과 같은 HIF-1의 개별의 하류의 작동자의 억제(silencing)는 신혈관 형성을 단지 부분적으로 막을 것이다.

본 발명은 상술한 문제를 다루고, 혈관신생형성 및 도관 투과성(부종)과 관련된 하류 유전자에 대한 전사 조절 유전자, HIF1A를 표적으로 하는 간섭 RNA를 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 HIF1A mRNA 발현을 억제(silence)하는 간섭 RNA에 관한 것으로, HIF-1 유도성 유전자의 전사 활성을 감소시키고, 안구 혈관신생-전 및 혈관신생 세포 활성의 저하에 영향을 미침으로써 안구의 혈관신생을 치료하는 것에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 "안구의 혈관신생"은 안구 혈관신생-전 증상 및 안구 혈관신생 증상을 포함하고 예를 들어, 망막 허혈, PSNV 및 신생혈관성 녹내장과 관련 있는 안구의 혈관신생, 안구 신생 혈관화, 망막 부종, 당뇨병성 망막증, 후유증을 직접 또는 간접적으로 유발하는 HIF1-유도 유전자의 발현으로부터 유도된 세포 변화를 포함한다. 본 발명의 간섭 RNA는 안구의 혈관신생, 안구 신생 혈관화, 망막 부종, 당뇨병성 망막증, 및 망막 허혈, 후부 신혈관 형성(PSNV) 및 신생혈관성 녹내장과 관련된 후유증을 갖는 환자 또는 예를 들어, 이와 같은 증상으로의 진행 위험을 갖는 환자를 치료하는데 유용하다.

본 발명의 일 구체예는 대상에서 HIF1A 표적 mRNA의 발현을 약화시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 투여는 인간에서 안구의 혈관신생의 발현 약화를 위하여 대상의 눈에 투여된다.

본 발명의 일 구체예에서, 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥, 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함한다. 부가적으로 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에 각각 HIF1A 변이체 1 및 변이체 2(각각 GenBank accession no. NM_001530 및 NM_181054)를 코딩하는 센스 cDNA 서열인 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 부분에 혼성화된다. 안티센스 가닥은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 각각 상응하는 mRNA 부분의 혼성화 영역을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는다. 이러한 조성물의 투여는 대상의 HIF1A 표적의 발현을 약화시킨다.

본 발명의 일 구체예에서, 간섭 RNA는 뉴클레오티드 411, 580, 583, 868, 869, 1099, 1100, 1242, 1302, 1371, 1396, 1559, 1560, 1809, 2085, 2087, 2105, 2138, 2256, 2358, 2422, 2636, 2666, 2743, 2858, 2861, 3135, 3544, 3554, 1943, 1791, 2351 또는 1408을 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA를 표적으로 하도록 설계된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 간섭 RNA는 뉴클레오티드 2360, 2411, 2420, 2536, 2539, 2545, 2616, 2731, 2734, 3008 또는 3427을 포함하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA를 표적으로 하도록 설계된다.

본 발명은 또한 제 1의 간섭 RNA 이외에 대상에게 제 2의 간섭 RNA를 투여하는 것을 제공한다. 상기 방법은 대상에게 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 센스 뉴클레오티드 가닥, 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성의 영역을 포함하는 제 2의 간섭 RNA를 투여하는 것을 포함한다; 여기에서 제 2의 간섭 RNA의 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 제 2의 부분에 혼성화되고 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각에 상응하는 mRNA의 제 2의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성의 영역을 갖는다. 추가적으로, 제 3, 제 4 또는 제 5 등의 간섭 RNA가 유사한 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 단일 가닥 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상의 HIF1A 발현의 약화 방법이다.

HIF1A 발현의 약화를 위하여, 단일 가닥 간섭 RNA는 뉴클레오티드 411, 580, 583, 868, 869, 1099, 1100, 1242, 1302, 1371, 1396, 1559, 1560, 1809, 2085, 2087, 2105, 2138, 2256, 2358, 2422, 2636, 2666, 2743, 2858, 2861, 3135, 3544, 3554, 1943, 1791, 2351 또는 1408을 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 부 분에 혼성화하고 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성의 영역을 갖는다.

다른 구체예에서, HIF1A 발현의 약화를 위하여, 단일 가닥 간섭 RNA는 뉴클레오티드 2360, 2411, 2420, 2536, 2539, 2545, 2616, 2731, 2734, 3008 또는 3427을 포함하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화한다. 이로써 HIF1A의 발현이 약화된다.

또한 본 발명의 구체예는 그를 필요로 하는 대상의 안구 혈관신생의 치료 방법이다. 상기 방법은 대상의 눈에 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 센스 뉴클레오티드 가닥, 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성의 영역을 포함하는 간섭 RNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 상기 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화되고 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성의 영역을 갖는다. 이로써 안구의 혈관신생이 치료된다.

본 발명의 다른 구체예는 그를 필요로 하는 대상에서 안구의 혈관 신생을 치료하는 방법이고, 상기 방법은 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 51 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 눈에 투여하여, 안구의 혈관신생이 치료되는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예는 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 51 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하여, 대상에서 HIF1A 표적 mRNA의 발현을 약화시키는 방법이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 인접 뉴클레오티드의 영역은 서열 식별자의 서열에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 14개의 뉴클레오티드와 적어도 85% 서열 상보성 또는 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드 영역이다. 또한 다른 본 발명의 구체예에서, 인접 뉴클레오티드의 영역은 서열 식별자로 확인되는 서열에 각각 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 15, 16, 17 또는 18개의 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 상보성 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 적어도 15, 16, 17 또는 18개의 인접 뉴클레오티드 영역이다.

본 발명의 또다른 구체예는 RNA 간섭을 통하여 HIF1A 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상의 안구의 혈관신생의 치료 방법으로서, siRNA 분자의 각각의 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 27개의 뉴클레오티드 길이이고; siRNA 분자의 하나의 가닥은 HIF1A 유전자에 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴 클레오티드 서열을 포함하여 RNA 간섭을 통하여 직접 mRNA의 절단을 지시한다.

19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이 및 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 51의 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보물을 가지고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물은 본 발명의 구체예이다.

일 구체예에서, 간섭 RNA는 분리된다. 용어 "분리"는 간섭 RNA가 그의 전체적인 자연적인 환경에서 유리되었음을 의미한다.

본 발명의 또다른 구체예는 RNA 간섭을 통하여 HIF1A 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물로서, siRNA 분자의 각각의 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 27개의 뉴클레오티드 길이이고; siRNA 분자의 하나의 가닥은 HIF1A 유전자에 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 RNA 간섭을 통하여 mRNA의 절단을 지시한다.

HIF1A mRNA의 발현 약화를 위한 의약의 제조에서 본원에 기재된 임의의 구체예의 용도도 또한 본 발명의 구체예이다.

도는 HIF1A siRNAs #1, #3, #5 및 #6, 및 RISC-무함유 대조 siRNA 각각, 10 nM, 1 nM 및 0.1 nM; 비표적 대조 siRNA(NTC2) 10 nM 및 버퍼 대조(-siRNA)로 트랜스펙션된 HeLa 세포의 HIF-1α 웨스턴 블랏을 제공한다. 화살표는 93-kDa HIF-1α 단백질 및 42-kDa 액틴 단백질 밴드의 위치를 나타낸다.

RNA 간섭(RNAi)은 유전자 발현을 억제하기 위하여 이용되는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 이용하는 과정이다. 이론적인 결부없이, RNAi는 다이서인 RNaseⅢ-유사 효소에 의해 긴 dsRNA가 작은 길이의 간섭 RNA(siRNA)로 절단되는 것으로 시작된다. siRNA는 대부분 약 19 내지 28 뉴클레오티드 또는 20 내지 25 뉴클레오티드 또는 21 내지 22개의 뉴클레오티드 길이의 dsRNA이며, 종종 2-뉴클레오티드 3' 오버행 및 5' 인산기 및 3' 수산기 말단을 포함한다. siRNA의 한 가닥은 RISC(RNA-induced silencing complex)로 공지된 리보핵단백질 복합체로 통합된다. RISC는 통합되는 siRNA 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 mRNA 분자를 확인한 후, 이러한 표적 mRNA를 자르거나 이들의 번역을 억제하기 위하여 이러한 siRNA 가닥을 이용한다. 그러므로, RISC로 통합되는 siRNA 가닥은 가이드(guide) 가닥 또는 안티센스 가닥으로 공지되어 있다. 패신져(passenger) 가닥 또는 센스 가닥으로 공지된 다른 siRNA 가닥은 siRNA로부터 제거되며, 적어도 부분적으로 표적 mRNA와 상동성을 갖는다. 당업자들은 원칙적으로, siRNA의 두 가닥이 RISC에 통합될 수 있으며, 가이드 가닥으로서도 기능할 수 있다는 것을 알고 있다. 그러나 siRNA 설계(예를 들면, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 감소된 siRNA 듀플렉스 안전성)는 RISC로의 안티센스 가닥의 통합이 선호될 수 있다.

RISC 매개에 의한, 적어도 부분적으로 가이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 mRNA의 절단은 이 mRNA에 의해 코딩된 상응하는 단백질 및 이 mRNA의 안정된 상태의 수준 감소를 가져온다. 다른 방법으로, RISC는 또한 표적 mRNA의 절단 없이 번역의 저지를 통하여 상응하는 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다. 또한 다른 RNA 분자 및 RNA-유사 분자는 RISC와 상호작용할 수 있으며 유전자 발현을 억제한다. RISC와 상호작용하는 다른 RNA 분자의 예는 shRNA(short hairpin RNA), 단일 가닥 siRNA, miRNA(microRNA) 및 다이서-기질 27-mer 듀플렉스를 포함한다. 본 명세서에서 "siRNA"라는 용어는 달리 언급이 없으면, 이중 가닥 간섭 RNA를 언급하는데에 이용된다. RISC와 상호작용할 수 있는 RNA-유사 분자의 예는 화학적으로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 하나 이상의 비-포스포디에스테르 결합을 포함하는 RNA 분자를 포함한다. 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 유전자 발현에 있어서 RISC와 상호작용할 수 있으며 RISC에 의해 매개된 변화에 관여하는 모든 RNA 또는 RNA-유사 분자를 "간섭 RNA"라고 언급할 수 있다. 그러므로, SiRNA, shRNA, miRNA 및 다이서-기질 27-mer 듀플렉스는 "간섭 RNA"의 부분집합이다.

본 발명의 구체예의 간섭 RNA는 표적 mRNA의 절단을 위하여, 촉매적 방식으로 작용하며, 즉 간섭 RNA는 근사화학량론(Substoichiometric)의 양으로 표적 mRNA의 억제에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 절단 조건 하에 치료 효과를 제공하기 위해서는, 안티센스 치료와 비교할 경우, 유의하게 적은 간섭 RNA가 요구된다.

본 발명은 저산소 유도인자 1A(HIF1A)의 발현을 억제하기 위하여 간섭 RNA를 사용하는 것에 관한 것으로, 한편으로 유도된 산소 분압에 반응하여 유도되는 많은 유전자의 전사를 간섭한다. 본 발명에 따라, 외생적으로 제공되거나, 내생적으로 발현되는 간섭 RNA는 특히, HIF1A mRNA를 억제시키는데 효과적이다.

본 명세서에 기재된 핵산 서열은 달리 지적하지 않았다면, 5'에서 3'방향으로 기재되었다. 본원에서 "핵산"이라는 용어는 DNA 또는 RNA, 또는 DNA(아데닌"A," 시토신 "C," 구아닌 "G," 티민 "T") 또는 RNA(아데닌 "A," 시토신 "C," 구아닌 "G," 우라실 "U")에 존재하는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 이들의 변형된 형태를 언급하는데 이용되었다. 비록 "T" 염기는 RNA에 자연적으로 존재할 수 없지만, 본원에서 제공된 간섭 RNA는 특별히 3' 말단에서 "T" 염기를 포함할 수 있다. "핵산"은 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리올리고뉴클레오티드"의 용어를 포함하며, 단일 가닥 분자 또는 이중 가닥 분자를 언급하는 것일 수 있다. 이중 가닥 분자는 A와 T 염기, C와 G 염기 및 A와 U 염기 사이에서 왓슨-크릭 염기 쌍에 의해 형성된다. 이중 가닥 분자의 한 가닥은 서로에게 부분적이고, 실질적이거나 완전한 상보성일 수 있으며, 염기 서열 상보성의 본질 및 정도에 의해 좌우되는 결합의 힘으로 이중 잡종(duplex hybrid)을 형성할 것이다.

mRNA 서열은 상응하는 DNA 서열의 서열에서 쉽게 추론된다. 예를 들면, 서열 번호 1은 HIF1A 변이체 1에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다. mRNA 서열은 "T" 염기가 "U" 염기로 대체된 DNA 센스 가닥과 동일하다. 그러므로, HIF1A 변이체 1의 mRNA 서열은 서열 번호 1로 식별할 수 있으며, HIF1A 변이체 2의 mRNA 서열은 서열 번호 2로 식별할 수 있다.

저산소 유도인자 -1 mRNA ( HIF1A 변이체 1 및 변이체 2): 저산소 유도인자 (HIF-1)는 감소된 산소 분압에 대응해서 많은 유전자의 발현의 변화에 관여하는 전사 인자이다. HIF-1은 HIF1A 및 ARNT 각각에 의해 코딩되는 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된 헤테로다이머이다. 적어도 두개의 HIF-1-유도 유전자는 VEGF 및 RTP801(REDD1)을 포함하는 망막에서 병적인 신혈관 형성에 영향을 주어 왔다. 그러므로, 본원에서 HIF1A 발현의 억제는 이러한 유전자의 전사 및 유전자 산물의 활성을 약화시키기 위하여 제공된다.

진뱅크(GenBank, the National Center for Biotechnology Information at ncbi.nhn.nih.gov.)에서는 서열 번호 1로 "서열 목록"에 기재된 HIF1A 변이체 1의 DNA 서열을 수탁번호(accession no.) NM_0O153O으로 제공한다. 서열 번호 1은 HIF1A 변이체 1("U" 염기에 대한 "T" 염기를 제외함)을 코딩하는 mRNA에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다. HIF1A 변이체 1에 대한 코딩 서열은 뉴클레오티드 285-2765이다.

상기 상술한 HIF1A 변이체 1 mRNA 서열의 등가물은 선택적 스플라이싱(alternative splice) 형태, 대립 형태(allelic forms), 동질 효소 또는 이들의 동족이다. 동족은 서열 번호 1과 동일한 다른 포유류 종으로부터 유래한 HIF1A mRNA이다(예, 상동기관).

진뱅크(GenBank, the National Center for Biotechnology Information at ncbi.nhn.nih.gov.)에서는 서열 번호 2로 "서열 목록"에 기재된 HIF1A 변이체 2의 DNA 서열을 수탁번호(accession no.) NM_181054로 제공한다. 서열 번호 2는 HIF1A 변이체 2("U" 염기에 대한 "T" 염기를 제외함)을 코딩하는 mRNA에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다. HIF1A 변이체 2에 대한 코딩 서열은 뉴클레오티드 285-2492이다.

상기 상술한 HIF1A 변이체 2 mRNA 서열의 등가물은 선택적 스플라이싱(alternative splice) 형태, 대립 형태(allelic forms), 동질 효소 또는 이들의 동족이다. 동족은 서열 번호 2와 동일한 다른 포유류 종으로부터 유래한 HIF1A 변이체 2 mRNA이다(예, 상동기관).

mRNA 발현의 약화: 본 명세서에서 이용된 "mRNA 발현의 약화"는 mRNA의 절단 또는 번역의 직접적인 저지를 통하여 표적 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 감소시키는 간섭 RNA(예, siRNA)의 양을 발현시키거나 투여하는 것을 의미한다. 표적 mRNA 또는 상응 단백질의 발현 감소는 보통 "녹-다운"이라 언급되며, 비-표적 대조 RNA(예, 비-표적 대조 siRNA)의 투여 또는 발현 이후 존재하는 수준과 관련 있다고 보고되어 있다. 본 발명의 구체예에서 50% 내지 100%의 녹-다운의 발현량이 고려되었다. 그러나 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이러한 녹-다운 수준의 달성은 필수적이지 않다. 일 구체예에서, HIF1A의 생산을 감소시키기 위하여 HIF1A mRNA를 표적으로 하는 단일 간섭 RNA가 투여된다. 다른 구체예에서, 발현을 감소시키기 위하여, HIF1A 표적을 표적으로 하는 두개 이상의 간섭 RNA가 투여된다. 또 다른 구체예에서, HIF1A 발현을 감소시키기 위하여, HIF1A 변이체 1 표적을 표적으로 하는 제 1의 간섭 RNA 및 HIF1A 변이체 2 표적을 표적으로 하는 제 2의 간섭 RNA가 투여된다.

녹-다운은 주로 qPCR(quantitative polymerase chain reaction) 증폭으로 mRNA 수준을 측정하거나, 웨스턴 블랏 또는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 단백질 수준을 측정하여 평가된다. 단백질 수준 분석은 번역 억제뿐만 아니라 mRNA 절단의 평가도 제공한다. 더 나아가 녹-다운을 측정하는 기술은 RNA 용액 혼성화, 뉴클레아제 보호, 노던 혼성화, 마이크로어레이를 통한 유전자 발현 모니터링, 항체 결합, 방사 면역 검정법 및 형광에 의해 활성화된 세포 분석을 포함한다.

본원에서 기재한 표적의 억제는 예를 들어, 인간 또는 포유류에서 망막 부종, 당뇨병성 망막증, 망막 허혈 또는 후부 신혈관 형성(PSNV)에서 진행되는 안구의 혈관신생 증후에서 개선의 관찰에 의해 또한 언급된다.

간섭 RNA: 본 발명의 일 구체예에서, 간섭 RNA(예, siRNA)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지며, 센스 및 안티센스 가닥은 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함한다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 간섭 RNA(예: siRNA)는 HIF1A mRNA의 표적 서열을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 동일성 영역을 포함하는 센스 가닥 및 HIF1A mRNA의 표적 서열에 대하여 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 간섭 RNA는 mRNA내의 표적 서열에 상응하는 3' 말단의 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 뉴클레오티드 각각의 끝에서 두번째와 서열 상보성의 퍼센트 또는 서열 동일성의 퍼센트를 갖는 적어도 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 인접 뉴클레오티드의 영역을 포함한다.

간섭 RNA 가닥 각각의 길이는 19 내지 49개의 뉴클레오티드를 포함하며, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49 뉴클레오티드의 길이를 포함할 수 있다.

siRNA의 안티센스 가닥은 RISC에 통합하는 siRNA의 활성적인 안내제로서, RISC가 적어도 절단 또는 번역 저지를 위하여 안티센스 siRNA 가닥에 적어도 부분적인 상보성을 갖는 표적 mRNA를 확인하도록 한다.

본 발명의 구체예에서, 표적 mRNA 서열 내의 간섭 RNA 표적 서열(예, siRNA 표적 서열)은 이용가능한 설계 도구를 사용하여 선택된다. 이어서 HIF1A 표적 서열에 상응하는 간섭 RNA는 상기 기술된 녹다운 평가에 의한 표적 mRNA를 발현하는 세포의 트랜스펙션으로 조사된다.

siRNA의 표적 서열을 선택하는 기술은 록펠레 대학의 웹 싸이트에서 이용가능한 Tuschl 등("The siRNA User Guide" revised May 6, 2004)의 방법; 앰비온 웹 싸이트에서 이용가능한 불레틴(Bulletin) #506, "siRNA Design Guidelines"; 다른 웹-기초의 설계 도구 예를 들면, 인비트로젠, 다마콘, Integrated DNA Technologies, Genscript 또는 Proligo 웹 싸이트에 의해 제공된다. 초기 조사 기준은 G/C 함량이 35% 내지 55%이며, 19 내지 27 뉴클레오티드 길이의 siRNA를 포함할 수 있다. 표적 서열은 코딩 영역 또는 mRNA의 번역되지 않은 5' 또는 3'에 위치할 수 있다.

HIF1A 변이체 1 및 HIV1A 변이체 2에 대한 공통의 19-뉴클레오티드 DNA 표적 서열의 한 구체예는 서열 번호 1의 41 내지 429의 뉴클레오티드에 존재한다:

5 ' - CAGTTGCCACTTCCACATA -3 ' 서열 번호 3.

본 발명의 siRNA는 서열 번호 3에 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 21-뉴클레오티드 가닥 및 3' 오버행된 2-뉴클레오티드 가닥을 갖는다:

5'- CAGUUGCCACUUCCACAUANN -3' 서열 번호 4

3 '- NNGUCAACGGUGAAGGUGUAU -5' 서열 번호 5.

각각의 "N" 잔기는 임의의 뉴클레오티드(A, C, G, U, T) 또는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 3' 말단은 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하는 많은 수의 "N" 잔기를 가질 수 있다. 다른 가닥에서 "N" 잔기는 동일한 잔기(예, UU, AA, CC, GG 또는 TT) 또는 상이한 잔기(예, AC, AG, AU, CA, CG, CU, GA, GC, GU, UA, UC 또는 UG)를 가질 수 있다. 3'오버행은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 일 구체예에서, 양쪽 가닥 모두는 3'UU 오버행을 갖는다.

본 발명의 siRNA는 서열 번호 3에 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 21-뉴클레오티드 가닥 및 각각의 가닥에 3'UU 오버행을 갖는다:

5'- CAGUUGCCACUUCCACAUAUU -3' 서열 번호 6

3'- UUGUCAACGGUGAAGGUGUAU -5' 서열 번호 7.

또한 간섭 RNA는 뉴클레오티드의 5'오버행을 갖거나 평활성 말단(blunt end)을 가질 수 있다. 본 발명의 siRNA는 서열 번호 3에 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 19-뉴클레오티드 가닥 및 평활성 말단을 갖는다:

5'- CAGUUGCCACUUCCACAUA -3' 서열 번호 52

3'- GUCAACGGUGAAGGUGUAU -5' 서열 번호 53.

이중-가닥 간섭 RNA(예, siRNA)의 가닥은 헤어핀 또는 줄기-루프 구조(예, shRNA)를 형성하기 위하여 연결될 수 있다. 본 발명의 shRNA는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 19 bp 이중 가닥 줄기 영역 및 3'UU 오버행을 갖는다:

N은 뉴클레오티드 A, T, C, G, U 또는 당업자들에게 알려진 변형된 형태이다. 루프에 뉴클레오티드 N의 수는 3 내지 23, 5 내지 15, 7 내지 13, 4 내지 9 또는 9 내지 11 사이를 포함하거나 뉴클레오티드 N의 수는 9이다. 루프에서 뉴클레오티드의 몇몇은 루프에서 다른 뉴클레오티드와 상호작용하는 염기쌍과 관련 있다. 루프의 형태로 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 서열의 예는 5'-UUCAAGAGA-3'(Brummelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296: 550) 및 5'-UUUGUGUAG-3'(Castanotto, D. et al. (2002) RNA 8:1454)를 포함한다. 결과의 단일 사슬 올리고뉴클레오티드가 RNAi 기작과 상호작용 가능한 이중 가닥 영역을 포함하는 줄기-루프 또는 헤어핀 구조를 형성한다는 것은 당업자들에게 이해될 것이다.

상기 확인된 siRNA 표적 서열은 다이서-기질 27-mer 듀플렉스의 설계를 용이하게 하기 위하여, 3' 말단에서 연장될 수 있다. HIF1A DNA 서열(서열 번호 1)에서 6 뉴클레오티드로 확인된 19-뉴클레오티드 DNA 표적 서열(서열 번호 3)의 연장은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 411 내지 435에서 25-뉴클레오티드 DNA 표적 서열을 산출한다:

5 ' - CAGTTGCCACTTCCACATAATGTGA -3 ' 서열 번호 54.

본 발명의 다이서-기질 27-mer 듀플렉스는 서열 번호 54에 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 한다:

센스 가닥의 3' 말단에서 두개의 뉴클레오티드(예, 서열 번호 55의 GA 뉴클레오티드)는 공정을 강화하기 위하여 데옥시뉴클레오티드일 수 있다. 본 명세서에서 제공된 것과 같은, 19-21 뉴클레오티드 표적 서열 유래의 다이서-기질 27-mer의 설계는 더 나아가 IDT(Integrated DNA Technologies) 웹 싸이트 및 Kim, D.-H. et al, (February, 2005) Nature Biotechnology 23:2;222-226으로 검토될 수 있다.

간섭 RNA가 화학적으로 합성되어 생산될 경우, 한 가닥 또는 두 가닥 모두(존재할 경우)의 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서의 인산화 반응은 siRNA 효능 및 결합된 RISC 복합체의 특이성을 증진시킬 수 있으나, 인산화 반응은 세포 내적으로 일어날 수 있으므로, 요구되는 것은 아니다.

표 1은 상기 기술한 방식으로 설계된 본 발명의 siRNA로부터 유래한 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 HIF1A 변이체 1 및 변이체 2 DNA 표적 서열의 각각의 예시 목록이다. HIF1A는 상기에 기재한 것과 같이, 저산소 유도인자 1 알파를 코딩한다.

표 1. siRNA 를 위한 HIF1A 표적 서열

상기 예시에서 기술하였듯이, 당업자들은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에서 서열 위치를 참조하고, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각에 대하여 상보성이거나 거의 상보성인 뉴클레오티드를 첨가 또는 삭제하여 표에 제공된 서열보다도 더 짧은 길이 또는 더 긴 길이를 갖는 간섭 RNA를 설계하기 위하여 표 1에 제공된 표적 서열 정보를 이용할 수 있다.

siRNA 및 다른 간섭 RNA 형태로 가이드된 표적 RNA의 절단 반응은 높은 서열 특이성이 있다. 일반적으로, 표적 mRNA의 부분 서열과 동일한 센스 뉴클레오티드 가닥 및 표적 mRNA의 부분에 정확하게 상보적인 안티센스 뉴클레오티드 가닥을 포함하는 siRNA는 본 명세서에서 언급한 mRNA의 억제를 위한 예이다. 그러나 안티센스 siRNA 가닥 및 표적 mRNA 사이 또는 안티센스 siRNA 가닥 및 센스 siRNA 가닥의 사이의 100% 서열 상보성은 본 발명을 실시하는데 요구되지 않는다. 그러므로, 예를 들면, 본 발명은 유전적 돌연변이, 균주 다형성 또는 진화적 일탈에서 기인한 것으로 여겨지는 서열 변화를 허용한다.

본 발명의 일 구체예에서, siRNA의 안티센스 가닥은 표적 mRNA와 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성을 갖는다. 본 명세서에서 "거의-완벽한"이란 siRNA의 안티센스 가닥이 표적 mRNA의 적어도 한 부분에 "실질적으로 상보적인" 것을 의미하며, siRNA의 센스 가닥이 표적 mRNA의 적어도 한 부분에 "실질적으로 동일한" 것을 의미한다. 당업자들에게 공지된 "동일성"은 서열 사이의 뉴클레오티드의 순서 및 동일성을 매칭하여 결정된 뉴클레오티드 서열 사이에서의 서열 관련 정도이다. 일 구체예에서, 표적 mRNA 서열에 80% 및 80% 내지 100%이하의 상보성을 갖는, 예를 들어 85%, 90% 또는 95% 상보성을 갖는 siRNA의 안티센스 가닥이 거의-완벽한 상보성으로 간주되며, 본 발명에 이용될 수 있다. "완벽한" 인접 상보성은 인접 염기 쌍의 왓슨-크릭 염기 쌍을 기준으로 한다. "적어도 거의-완벽한" 인접 상보성은 본 명세서에서 이용된 "완벽한" 상보성을 포함한다. 동일성 또는 상보성을 결정하기 위한 컴퓨터 방법은 뉴클레오티드 서열의 최상의 매칭 정도를 확인하기 위하여 설계되었으며, 예로는 BLASTN(Altschul, S.F., et al. (1990) J. MoI . Biol . 215:403-410)이 있다.

"동일성 퍼센트"라는 용어는 이차 핵산 분자에서 같은 길이의 인접 뉴클레오티드의 세트와 동일한 일차 핵산 분자 내에서의 인접 뉴클레오티드의 퍼센트를 의미한다. "상보성 퍼센트"라는 용어는 이차 핵산 분자에서 인접 뉴클레오티드의 세트와 왓슨-크릭 센스에서 염기 쌍을 이룰 수 있는 일차 핵산 분자 내에서의 인접 뉴클레오티드의 퍼센트를 의미한다.

표적 mRNA(센스 가닥)와 siRNA의 한 가닥(센스 가닥) 사이의 관계는 동일성의 관계이다. 또한 siRNA의 센스 가닥은 본 명세서에서 패신져 가닥이라고 불린다. 표적 mRNA(센스 가닥) 및 siRNA의 다른 가닥(안티센스 가닥) 사이의 관계는 상보성의 관계이다. 또한 siRNA의 안티센스 가닥은 본 명세서에서 가이드 가닥이라고 불린다.

5'에서 3'방향으로 기재된 핵산 서열에서 끝에서 두번째 염기는 마지막 염기의 다음 염기를, 즉, 3' 염기의 다음 염기를 의미한다. 5'에서 3'방향으로 기재된 핵산 서열 13 염기의 끝에서 두번째는 3' 염기의 다음 염기, 13 염기의 마지막을 의미하며, 3' 염기는 포함하지 않는다. 유사하게 5'에서 3'방향으로 기재된 핵산 서열 14, 15, 16, 17 또는 18 염기의 끝에서 두번째는 각각 3' 염기의 다음 염기, 4, 15, 16, 17 또는 18 염기의 마지막을 의미하며, 3' 염기는 포함하지 않는다.

"임의의(서열 식별자) 3' 말단의 13 염기의 끝에서 두번째(서열 식별자)와 적어도 90% 서열 상보성 또는 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개 인접 뉴클레오티드 영역"이라는 구는 하나의 뉴클레오티드의 치환을 허용한다. 두개의 뉴클레오티드 치환(예, 11/13 = 85% 동일성/상보성)은 상기 구에 포함되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 인접 뉴클레오티드의 영역은 각각의 서열 식별자에 의해 확인된 서열의 3' 말단의 14 뉴클레오티드의 끝에서 두번째와 적어도 85% 서열 상보성 또는 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 14개의 인접 뉴클레오티드의 영역이다. 두개의 뉴클레오티드 치환(예, 12/14 = 86% 동일성/상보성)은 상기 구에 포함된다.

더 나아가 본 발명의 구체예에서는 인접 뉴클레오티드의 영역은 서열 식별자의 서열에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 14 염기의 끝에서 두번째와 적어도 80% 서열 상보성 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 적어도 15, 16, 17 또는 18개의 인접 뉴클레오티드의 영역이다. 3개의 뉴클레오티드 치환은 상기 구에 포함된다.

서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA에서 표적 서열은 mRNA의 코딩 영역일 뿐만 아니라 mRNA의 5' 또는 3'의 번역되지 않은 영역일 수 있다.

이중 가닥 간섭 RNA의 한 가닥 또는 두 가닥 모두는 1 내지 6개 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가질 수 있으며, 이는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 오버행의 뉴클레오티드는 염기 쌍을 이루지 않는다. 본 발명의 일 구체예에서, 간섭 RNA는 TT 또는 UU의 3' 오버행을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 간섭 RNA는 적어도 하나의 평활성 말단을 포함한다. 말단은 대부분 5' 인산기 또는 3' 수산기를 갖는다. 다른 구체예에서, 안티센스 가닥은 5' 인산기를 가지며, 센스 가닥은 5' 수산기를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 말단은 더 나아가 다른 분자 또는 기능기의 공유결합 첨가에 의해 변형된다.

이중 가닥 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 상기 언급한 두개의 단일 가닥의 듀플렉스 형성일 수 있거나, 상보성 영역이 염기 쌍 및 단일 가닥 형성을 위한 헤어핀 루프에 의한 공유결합으로 연결된 단일 분자일 수도 있다. 헤어핀은 두개의 개별적인 염기-쌍 RNA 분자의 간섭 RNA 형성하기 위하여 다이서라는 단백질에 의해 세포 내적으로 절단된다고 알려져 있다.

간섭 RNA는 첨가, 결실, 치환, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 변형에 의해 자연적으로 발생하는 RNA와 상이할 수 있다. 뉴클레오티드가 아닌 물질은 5' 말단, 3' 말단에서 또는 내부에서 간섭 RNA에 결합될 수 있다. 이러한 변형은 주로 간섭 RNA의 뉴클레아제 저항을 증가, 세포 흡수의 증진, 세포 표적의 증진, 간섭 RNA 추적을 원조, 더 나은 안정성 또는 인터페론 경로의 잠재적인 활성을 감소하기 위하여 설계된다. 예를 들어, 간섭 RNA는 오버행의 말단에 퓨린 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 피롤리딘 연결자에 의한 siRNA 분자의 센스 가닥 3' 말단에서 콜레스테롤의 접합은 또한, siRNA에 안정성을 제공한다.

더 나아가 변형은 3' 말단에 예를 들면, 비오틴 분자, 세포를 관통하는 성질을 갖는 것으로 공지된 펩티드, 나노 입자, 모방성 펩티드, 형광 염료 또는 덴드리머를 포함한다.

본 발명의 구체예에서 뉴클레오티드는 그들의 염기 부분, 그들의 당 부분 또는 분자 및 기능기의 인산염 부분에서 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어, 알킬, 알콕시기, 아미노, 디아자, 할로, 하이드록실, 티롤기 또는 이들의 배합물을 포함한다. 뉴클레오티드는 더 나은 안정성을 갖는 유사체로 치환될 수 있고, 상기 치환의 예로는 리보뉴클레오티드를 데옥시뉴클레오티드로 대체, 또는 예를 들면, 2' OH 기를 2' 아미노기, 2' O-메틸기, 2' 메톡시에틸기 또는 2'-O, 4'-C 메틸렌 가지로 대체하는 것과 같은 당 변형을 들 수 있다. 뉴클레오티드의 퓨린 또는 피리미딘 유사체의 예로는 크산틴, 하이포크산틴, 아자퓨린, 메틸티오아데닌, 7-데아자-아데노신 및, O- 및 N- 변형된 뉴클레오티드 등이 있다. 뉴클레오티드의 인산기는 인산기의 하나 이상의 산소를 질소 또는 황(포스포로티오에이트)으로 치환하여 변형될 수 있다. 변형은 예를 들면, 기능 증진, 안정성 또는 투과성의 증진, 또는 편재화 또는 표적을 지시하는데 유용하다.

안티센스 간섭 RNA 가닥의 영역 또는 영역들은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 부분에 상보성이 아닐 수 있다. 비-상보성 영역은 3', 5' 또는 상보성 영역의 양쪽 말단 부분 또는 두개의 상보성 영역의 사이일 수 있다.

간섭 RNA는 화학적 합성, 시험관 내의 전사 또는 다이서, 또는 유사한 활성을 갖는 다른 적당한 뉴클레아제에 의한 긴 이중 가닥 RNA의 절단으로 외생적으로 생성될 수 있다. 화학적으로 합성된 간섭 RNA, 통상의 DNA/RNA 합성기를 이용하여 보호된 리보뉴클레오시드 포스포라미디트로부터 생성된 간섭 RNA는 앰비온사(Austin, TX), 인비트로젠(Carlsbad, CA) 또는 다마콘(Lafayette, CO)과 같은 상업적 도구로 수득될 수 있다. 간섭 RNA는 예를 들면, 용매 또는 레진, 침전, 전기영동, 크로마토그래피 또는 이들의 조합에 의한 추출로 정제될 수 있다. 대안적으로, 임의의 정제가 시료 공정 과정에서 기인하는 손실을 피하기 위해서라면 간섭 RNA는 아주 소량 이용될 수 있다.

또한, 간섭 RNA는 플라스미드 또는 바이러스 발현 벡터 또는 최소 발현 카세트로부터, 예를 들면, 하나 이상의 프로모터 및 적절한 주형 또는 간섭 RNA에 대한 주형을 포함하는 PCR 산출 단편으로부터 내생적으로 발현될 수 있다. shRNA에 대하여 상업적으로 이용 가능한 플라스미드-기초의 발현 벡터는 pSilencer series(앰비온, Austin, TX) 및 pCpG-siRNA(인비트로젠, San Diego, CA)를 포함한다. 간섭 RNA의 발현을 위한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스(예, HIV, FIV 및 EIAV) 및 헤르페스 바이러스를 포함하는 다양한 바이러스로부터 유래될 수 있다. shRNA 발현을 위하여, 상업적으로 이용 가능한 바이러스 벡터의 예는 pSilencer adeno(앰비온, Austin, TX) 및 pLenti6/BLOCK-iT™-DEST(인비트로젠, Carlsbad, CA)를 포함한다. 바이러스 벡터의 선택, 벡터로부터 간섭 RNA를 발현시키는 방법 및 바이러스 벡터를 전달시키는 방법은 당업계의 일반적인 기술로 가능하다. PCR로 생성되는 shRNA 발현 카세트의 생산을 위한 키트의 예에는 Silencer Express(앰비온, Austin, TX) 및 siXpress(미루스, Madison, WT)가 있다. 일차 간섭 RNA는 일차 간섭 RNA를 발현할 수 있는 일차 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있으며, 제 2 간섭 RNA는 제 2 간섭 RNA를 발현할 수 있는 제 2 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있거나, 두개의 간섭 RNA는 두개의 간섭 RNA를 발현할 수 있는 하나의 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있다.

간섭 RNA는 당업자들에게 공지된 다양한 진핵세포 프로모터로부터 발현될 수 있으며, 상기 프로모터는 pol III 프로모터, 예컨대, U6 또는 H1 프로모터 또는 pol II 프로모터, 예컨대, 사이토메갈로바이러스 프로모터를 포함할 수 있다. 당업자들은 이러한 프로모터가 간섭 RNA의 발현 유도를 수용하기 위하여 개조할 수 있는지를 인지할 수 있다.

생리적 조건하의 혼성화 : 본 발명의 특정 구체예에서, 간섭 RNA의 안티센스 가닥은 생체 내에서 RISC 복합체의 부분으로서 mRNA와 혼성화한다.

"혼성화"는 상보적 또는 거의 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 핵산이 혼성물이라 불리는 수소-결합 복합체의 형태와 상호작용하는 프로세스를 의미한다. 혼성화 반응은 민감하며 선택적이다. 시험관 내에서의 혼성화 특이성(예, 엄격함)은 혼성화 전의 염 또는 포름아미드의 농도 및 예를 들면, 혼성화 용액 및 혼성화 온도에 의해 조절된다; 이러한 절차는 당업계에 잘 알려져 있다. 특히, 엄격함은 염 농도의 감소, 포름아미드 농도의 증가 또는 혼성화 온도를 올림으로써 강화된다.

예를 들어, 아주 엄격한 조건은 37℃ 내지 42℃에서 약 50% 포름아미드로 수행되는 것이다. 약화된 엄격한 조건은 30℃ 내지 35℃에서 약 35% 내지 25% 포름아미드로 수행되는 것이다. 혼성화를 위한 엄격한 조건의 예는 Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.에서 제공된다. 엄격한 혼성화 조건의 또 다른 예는 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃에서 12-16 시간 동안 혼성화 후, 세정, 또는 70℃, 1 × SSC 또는 50℃, 1 × SSC에서 50% 포름아미드로 혼성화 후, 70℃, 0.3 × SSC에서 세정 또는 70℃, 4 × SSC 또는 50℃, 4 × SSC에서 50% 포름아미드로 혼성화 후, 67℃, 1 × SSC에서 세정하는 것을 포함한다. 혼성화에 대한 온도는 혼성물의 T_m(melting temperature)보다 5-10℃ 낮으며, 19 내지 49개의 염기 쌍의 길이의 혼성물의 T_m은 하기의 계산식으로 결정한다: T_m℃ = 81.5 + 16.6(log₁₀[Na⁺]) + 0.41 (% G+C)-(600/N)(여기에서 N은 혼성물의 염기 수를 의미하며, [Na⁺]는 혼성화 버퍼의 나트륨 이온의 농도를 의미한다).

상술한 시험관 내에서의 혼성화 분석은 후보 siRNA 및 표적 사이에서 결합 특이성이 있는지를 예상하는 방법을 제공한다. 그러나, RISC 복합체의 경우, 표적의 특이적 절단은 시험관 내에서 혼성화를 위하여 매우 엄격한 조건이 요구되지 않는 안티센스 가닥으로 발생할 수 있다.

단일 가닥 간섭 RNA: 상술하였듯이, 간섭 RNA는 궁극적으로 단일 가닥으로 작용한다. 단일 가닥(ss) 간섭 RNA는 이중-가닥 siRNA보다 덜 효과적이지만, mRNA 스플라이싱에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. 그러므로, 본 발명의 구체예에서는 생리적 조건하에서 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 부분과 혼성화되며, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 ss 간섭 RNA의 투여를 제공한다. ss 간섭 RNA는 상술한 ds siRNA에 대한 것과 같이, 19 내지 49개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. ss 간섭 RNA는 5' 인산기를 갖거나 5' 위치에서 인사이츄 또는 생체 내에서 인산화된다. "5' 인산화"란 용어는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 당(예, 리보스, 데옥시리보스 또는 이들의 유사체)의 C5 수산기에 에스테르 결합을 통하여 부착된 인산기를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 기술하기 위하여 사용된다.

SS 간섭 RNA는 화학적으로 또는 시험관 내 전사에 의해 합성되며, ds 간섭 RNA에 대한 것과 같이 백터 또는 발현 카세트로부터 내생적으로 발현된다. 5' 인산기는 키나아제를 통해 첨가될 수 있거나, 5' 인산기는 RNA의 뉴클레아제 절단의 결과일 수도 있다. 전달은 ds 간섭 RNA에 대한 것과 같다. 일 구체예에서, 보호된 말단 및 뉴클레아제 내성 변형을 갖는 ss 간섭 RNA는 억제를 위해서 투여되었다. SS 간섭 RNA는 저장을 위하여 건조되거나 수용액 중에 용해될 수 있다. 상기 용액은 어닐링을 억제하거나 안정화를 위하여, 버퍼 또는 염을 포함할 수 있다.

헤어핀 간섭 RNA: 헤어핀 간섭 RNA는 줄기-루프 또는 헤어핀 구조(예, shRNA)의 간섭 RNA의 센스 및 안티센스 가닥 모두를 포함하는 단일 분자(예, 단일 올리고뉴클레오티드 사슬)이다. 예를 들면, shRNA는 DNA 벡터로부터 발현될 수 있으며, 여기서 센스 간섭 RNA 가닥을 코딩하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 짧은 스페이서에 의해 역 상보성 안티센스 간섭 RNA 가닥을 코딩하는 DNA 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 선택된 발현 벡터를 위하여 필요하다면, 3' 말단의 T 및 제한 자리를 형성하는 뉴클레오티드가 첨가될 수 있다. RNA 전사물의 결과는 줄기-루프 구조를 형성하여 그 자신의 뒤에 접힌다.

투여 형태: 간섭 RNA는, 예를 들어, 에어로졸, 구강, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복강내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 투여를 통하여 전달될 수 있다.

간섭 RNA는 눈주변, 결막, 테논낭하, 전방, 유리체, 안구내, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 주입과 같은 안조직 주입에 의해; 카테터 또는 망막 펠렛, 안구내 삽입, 좌약 또는, 다공성, 비다공성 또는 젤라틴 물질을 포함하는 임플란트와 같은 다른 대체 기구의 사용으로; 국소적 점안액 또는 연고로; 또는 쿨데삭(Cul-De-Sac)의 서방성 기구 또는 공막(공막을 통하여)에 인접하거나 눈 안의 임플란트에 의해 눈에 직접 전달될 수 있다. 전방 주입은 각막에서 안구의 전방으로 약제가 섬유주로 도달하는 것을 통하여 이루어질 수 있다. 시신경관내 주입은 쉴렘관으로 방출하는 정맥 채취기 채널로 또는 쉴렘관을 통하여 이루어질 수 있다.

대상: 안구의 혈관신생 치료를 필요로 하거나 안구의 혈관신생 진행의 위험이 있는 대상은 안구의 혈관신생을 갖거나 본원에서 기재한 바와 같이 HIF1A의 원하지 않거나 부적절한 발현 또는 활성과 관련된 안구의 혈관신생을 가질 위험이 있는 인간 또는 다른 포유류이다. 이러한 장애과 관련된 안구 구조는, 예를 들어, 눈, 망막, 맥락막, 렌즈, 각막, 섬유주, 홍채, 시신경, 시신경유두, 공막, 전방 또는 후부 또는 모양체를 포함할 수 있다. 또한 대상은 안구세포, 세포배양, 기관 또는 생채 외 기관 또는 조직일 수 있다.

제제 및 복용량: 약학적 제제는 물, 버퍼, 살린, 글리신, 히알루론산, 맨니톨 등과 같은 약제학적으로 허용되는 담체 매체와 혼합된 99% 중량부 이하로 본 발명의 간섭 RNA 또는 그의 염을 포함한다.

본 발명의 간섭 RNA는 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서 투여된다. 하기에 본 발명의 가능한 제제를 예시한다.

양(중량 %)

간섭 RNA 99까지; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

하이드록시메틸셀룰로오스 0.5

염화나트륨 0.8

염화 벤즈알코늄 0.01

EDTA 0.01

NaOH/HCl qs pH 7.4

정제수(RNase 없음) qs 100 ㎖

양(중량 %)

간섭 RNA 99까지; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

인산완충식염수 1.0

염화 벤즈알코늄 0.01

폴리소르베이트 80 0.5

정제수(RNase 없음) q.s. 100%까지

양(중량 %)

간섭 RNA 99까지; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

일염기성인산나트륨 0.05

이염기성인산나트륨(무수) 0.15

염화나트륨 0.75

디소디움 EDTA 0.05

크레모퍼 이엘 0.1

염화 벤즈알코늄 0.01

HCl 및/또는 NaOH pH 7.3-7.4

정제수(RNase 없음) q.s. 100%까지

양(중량 %)

간섭 RNA 99까지; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

인산완충식염수 1.0

수산화프로필-베타-사이클로덱스트린 4.0

정제수(RNase 없음) q.s. 100%까지

통상, 본 발명의 구체예의 간섭 RNA의 유효량은 100 pM 내지 1 μM, 또는 1 nM 내지 100 nM, 또는 5 nM 내지 약 50 nM, 또는 약 25 nM의 표적 세포 표면의 세포 외부적인 농도이다. 이 부분적인 농도를 달성하기 위하여 요구되는 투여량은 전달 방법, 전달의 자리, 전달 자리 및 표적 세포 또는 조직 사이의 세포층의 수, 전달이 전체적인지 또는 국소적인지 등을 포함하는 매우 다양한 요소에 달려 있다. 전달 자리에서의 농도는 표적 세포 또는 조직의 표면에서보다 상당히 높을 수 있다. 국소적 조성물은 하루에 1회 내지 4회, 표적 기관의 표면에 전달되거나 또는 숙련된 임상의의 관례적인 재량에 따라서 매일, 주마다, 격주마다, 달마다 또는 그 이상으로 전달 스케쥴을 연장할 수도 있다. 제제의 pH는 약 pH 4-9 또는 pH 4.5 내지 pH 7.4이다.

HIF1A mRNA에 대하여 직접적인 간섭 RNA로 수행되는 환자의 치료는 작용 기간이 연장되는 작은 분자 치료를 통한 효과가 예상되지므로, 투여량 횟수는 감소될 것이고 환자의 순응은 나아질 것이다.

제제의 효과적인 양은 예를 들면, 대상의 연령, 종족 및 성별, 안구의 혈관신생의 심각성, 표적 유전자 전사/단백질 전환의 비율, 간섭 RNA 효능 및 간섭 RNA 안정성과 같은 요소에 달려있다. 일 구체예에서, 간섭 RNA는 표적 기관에 국소적으로 전달되며 치료적 용량으로 망막 또는 시신경유두와 같은 HIF1A-함유 조직에 도달하므로, 안구의 혈관신생으로 매개되는 질환 진행을 개선한다.

허용되는 담체 : 허용되는 담체로는 최대한 안구 염증이 없고, 필요하다면 적절한 보존 상태가 제공되고, 동일한 투여량에서 본 발명의 하나 이상의 간섭 RNA를 전달할 수 있는 담체가 언급되어 진다. 본 발명의 구체예에서 간섭 RNA의 투여를 위하여 허용되는 담체는 양이온성 지질-기제의 트랜스펙션제 TransIT^®-TKO(미루스 사, Madison, WI), LIPOFECTIN^®, 리포펙타민, OLIGOFECTAMINE™(인비트로젠, Carlsbad, CA) 또는 DHARMAFECT™(다마콘, Lafayette, CO); 폴리에틸렌이민과 같은 폴리양이온; Tat, 폴리아르기닌 또는 페네트라틴(Antp 펩티드)과 같은 양이온 펩티드; 또는 리포좀을 포함한다. 리포좀은 표준 소낭-형성 지질 및 콜레스테롤과 같은 스테롤로부터 형성되며, 예를 들면, 내피 세포 표면 항원에 대하여 친화성 결합력을 갖는 단일 항체와 같은 표적 분자를 포함할 수 있다. 더 나아가 리포좀은 페길화 리포좀일 수 있다.

간섭 RNA는 용액에서, 현탁액에서 또는 생분해성 또는 비-생분해성 전달 장치에서 전달될 수 있다. 간섭 RNA는 단독으로 또는 공유 접합체로 정의된 성분으로서 전달될 수 있다. 또한, 간섭 RNA는 양이온의 지질, 양이온의 펩티드 또는 양이온의 폴리머와 복합체를 형성할 수 있으며; 단백질, 융합 단백질 또는 핵산과 결합하는 성질을 갖는 단백질 도메인(예, 프로타민)과 복합체를 형성할 수 있거나; 나노입자 또는 리포좀에 밀봉될 수 있다. 조직- 또는 세포-특이적 전달은 항체 또는 항체 절편과 같은 적절한 표적으로 하는 부분의 포함으로 이루어질 수 있다.

안과적 전달을 위하여, 간섭 RNA는 안과학적으로 허용되는 방부제, 공용매, 계면활성제, 점성 증진제, 침투 증진제, 버퍼, 염화나트륨 또는 물과 배합되어, 멸균된 안용 수성 현탁액 또는 용액을 형성할 수 있다. 용액 제제는 생리적으로 허용되는 등장성 수용성 버퍼 중에 간섭 RNA를 용해시켜 제조될 수 있다. 더 나아가, 용액은 억제제 용해를 보조하기 위하여 허용되는 계면활성제를 포함할 수 있다. 하이드록시메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등의 점성 형성 시약은 본 발명의 조성물에 첨가되어 화합물의 보유력을 증진시킬 수 있다.

멸균 안용 연고 제제를 제조하기 위하여, 간섭 RNA는 미네랄 오일, 액체 라놀린 또는 백색 바셀린과 같은 적절한 비히클에서 방부제와 조합된다. 멸균 안용 젤 제제는 간섭 RNA를, 예를 들면, 당업계에 공지된 방법에 따라 CARBOPOL^®-940(BF Goodrich, Charlotte, NC) 등의 조합으로부터 제조된 친수성 기제에 현탁함으로써 제조될 수 있다. VISCOAT^®(Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX)는 예를 들면, 안구내 주입에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 조성물은 눈에서 간섭 RNA의 침투성이 작을 경우, 크레모폴 및 TWEEN^® 80(polyoxyethylene sorbitan monolaureate, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)과 같은 침투 증진제를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 조성물은 눈에서 간섭 RNA의 침투성이 작을 경우, 크레모폴 및 TWEEN^® 80(polyoxyethylene sorbitan monolaureate, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)과 같은 침투 증진제를 포함할 수 있다.

키트 : 본 발명의 구체예에는 본원에서 상술하였듯이 세포에서 mRNA의 발현을 약화하는 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 siRNA 또는 shRNA 발현 벡터를 포함한다. siRNA 및 비-바이러스 shRNA 발현 벡터를 위하여, 키트는 또한 트랜스펙션 시약제 또는 다른 적절한 전달 비히클을 포함할 수 있다. 바이러스 shRNA 발현 벡터를 위하여, 키트는 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 벡터의 생산을 위해 필요한 성분(예, 바이러스 벡터 주형 및 패키지를 위한 추가적인 헬퍼 벡터를 포함하는 벡터뿐만 아니라 패키지된 세포주)을 포함할 수 있다. 또한 키트는 양성 및 음성 대조 siRNA 또는 shRNA 발현 벡터(예, 비-표적 대조 siRNA 또는 관련없는 mRNA를 표적으로 하는 siRNA)를 포함할 수 있다. 또한 키트는 관심 있는 표적 유전자(예, 상응하는 웨스턴 블랏용 단백질에 대한 표적 mRNA 및/또는 항체를 검출하기 위하여 정량 PCR에 이용되는 프라이머 및 프로브)의 녹다운을 평가하는 시약을 포함할 수 있다. 대안적으로, 키트는 siRNA 서열 또는 shRNA 서열 및 사용설명서 및 시험관 내에서 전사에 의해 siRNA를 생산하거나 shRNA 발현 벡터를 작제하기 위하여 필요한 물질을 포함할 수 있다.

패키지된 조합에서, 한정된 가까운 곳에 있어서 컨테이너 수단을 받기에 적당한 담체 수단 및 간섭 RNA 조성물과 허용되는 담체를 포함하는 제 1의 컨테이너 수단을 포함하는 키트 형태의 약학적 조합이 추가로 제공된다. 더 나아가, 이러한 키트는 원한다면, 하나 이상의 다양한 상업적 약학적 키트 성분, 예를 들면, 당업자들이 용이하게 알 수 있는 바와 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 추가의 컨테이너 등을 갖는 컨테이너를 포함할 수 있다. 투여되는 성분의 양 투여 안내 및/또는 성분 혼합을 안내하는 인쇄된 사용 설명서가 삽입물 또는 라벨로서 키트에 또한 포함될 수 있다.

예를 들면, 인간 안구 세포주에서 내생적 표적 유전자 발현의 녹다운 수준을 위한 간섭 RNA의 능력은, 예를 들면, 하기와 같이 시험관 내에서 평가될 수 있다. 형질전환된 인간 세포를 표준 성장 배지(예: 10% 우태아혈청이 보충된 DMEM)에서 트랜스펙션하기 24 시간 전에 평판 배양하였다. 트랜스펙션은 제조자의 지시에 따라 Dharmafect 1(Dharmacon, Lafayette, CO)을 사용하여, 0.1 nM-100 nM 범위의 간섭 RNA 농도에서 수행하였다. 비-표적 대조 siRNA 및 라민 A/C siRNA(Dharmacon)를 대조로서 사용하였다. 표적 mRNA 수준은, 예를 들어, TAQMAN^®정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 트랜스펙션 24 시간 후 qPCR로 평가되었다(Applied Biosystems, Foster City, CA). 표적 단백질 수준은, 트랜스펙션 약 72 시간 후(실제 시간은 단백질 전환 비율에 좌우됨), 예를 들어, 웨스턴 블랏으로 평가될 수 있다. 배양 세포로부터의 RNA 및/또는 단백질 분리를 위한 표준 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 비-특이적인 기회, 오프 표적 효과를 감소시키기 위하여, 가능한 가장 작은 간섭 RNA 농도가 표적 유전자 발현에서 원하는 녹다운의 수준 생산을 위하여 사용되어야 한다.

HIF1A 단백질 발현의 녹-다운 수준에 대한 본 발명의 간섭 RNA의 효능은 하기 실시예 1에서 더욱 예시된다.

실시예 1

HIF1A 을 특이적으로 억제하는 간섭 RNA

본 연구에서는 배양된 HeLa 세포에서 내생적 HIF-1α 단백질 발현의 녹다운 수준에 대한 HIF1A 간섭 RNA 효능을 실험하였다.

HeLa 세포의 트랜스펙션을 HIF1A siRNA의 시험관 내 표준 농도(0.1- 10 nM), siCONTROL RISC-무함유 siRNA #1 또는 siCONTROL 비-표적 siRNA #2(NTC2) 및 DHARMAFECT^® #1 트랜스펙션 시약(Dharmacon, Lafayette, CO)을 사용하여 수행하였다. 모든 siRNA를 1 X siRNA 버퍼, 20 mM KCl의 수용액, 6 mM HEPES(pH 7.5), 0.2 mM MgCl₂ 중에 용해시켰다. 버퍼 대조에 포함되는 대조 샘플은 siRNA의 용적을 동일한 용적의 1 × siRNA 버퍼 (-siRNA)로 대체하였다. 트랜스펙션 48 시간 후, 세 포를 100 μM CoCl₂로 4 시간 동안 처리하여 HIF-1α 단백질 발현을 유도하였고, 웨스턴 블랏을 수행하여 HIF-1α 수준을 평가하였다. HIF1A siRNA는 하기 표적에 대하여 특이성을 갖는 이중-가닥 간섭 RNA이다: siHIF1A #1은 서열 번호 48을 표적으로 한다; siHIF1A #3은 서열 번호 49를 표적으로 한다; siHIF1A #5는 서열 번호 50을 표적으로 한다; siHIF1A #6은 서열 번호 51을 표적으로 한다. 도에서 데이터로 나타낸 바와 같이, 각각의 4개의 HIF1A siRNA는 10 nM에서 대조 siRNA와 비교하여 HIF-1α 단백질 발현을 유의하게 감소시켰다. 그러나, siHIF1A #3 및 siHIF1A #6은 또한 0.1 nM에서 HIF-1α 단백질 발현을 유의하게 감소시켰고, 이는 HIF1A siRNA이 siHIF1A #1 및 siHIF1A #5에 대하여 특히 효과적임을 의미하는 것이다.

본원에 진술된 예시적인 절차 또는 다른 상세한 보충이 제공된다는 점에서 본 명세서에 인용된 참조는 특별히 참조에 의해 구체화된다.

당업자들은 본 명세서에 비추어볼 경우, 본원에 개시된 구체예의 명백한 변형은 본 발명의 의도 및 영역을 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것을 식별할 수 있을 것이다. 본원에서 개시된 모든 구체예는 본 명세서에 비추어볼 경우, 과도한 실험 없이 만들어질 수 있으며 실행될 수 있다. 본 발명의 모든 영역은 명세서 및 이와 동등한 구체예로 준비되었다. 명세서는 본 발명의 본 발명에 주어진 권리를 보호하기 위한 전체 관점에서 과도하게 좁게 해석되지 않아야 한다.

본원에서는 달리 특정되지 않으면 단수는 "하나", "적어도 하나" 또는 "하나 이상"의 의미를 갖는다.

SEQUENCE LISTING <110> Alcon Manufacturing, Ltd. <120> RNAi-Mediated Inhibition of HIF1A For Treatment of Ocular Angiogenesis <130> 45263-P015WO <150> 60/754,956 <151> 2005-12-29 <160> 56 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3958 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtgctgcctc gtctgagggg acaggaggat caccctcttc gtcgcttcgg ccagtgtgtc 60 gggctgggcc ctgacaagcc acctgaggag aggctcggag ccgggcccgg accccggcga 120 ttgccgcccg cttctctcta gtctcacgag gggtttcccg cctcgcaccc ccacctctgg 180 acttgccttt ccttctcttc tccgcgtgtg gagggagcca gcgcttaggc cggagcgagc 240 ctgggggccg cccgccgtga agacatcgcg gggaccgatt caccatggag ggcgccggcg 300 gcgcgaacga caagaaaaag ataagttctg aacgtcgaaa agaaaagtct cgagatgcag 360 ccagatctcg gcgaagtaaa gaatctgaag ttttttatga gcttgctcat cagttgccac 420 ttccacataa tgtgagttcg catcttgata aggcctctgt gatgaggctt accatcagct 480 atttgcgtgt gaggaaactt ctggatgctg gtgatttgga tattgaagat gacatgaaag 540 cacagatgaa ttgcttttat ttgaaagcct tggatggttt tgttatggtt ctcacagatg 600 atggtgacat gatttacatt 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gaaaaatttt tacacctttt ttttcacatt 3180 ttacataaat aataatgctt tgccagcagt acgtggtagc cacaattgca caatatattt 3240 tcttaaaaaa taccagcagt tactcatgga atatattctg cgtttataaa actagttttt 3300 aagaagaaat tttttttggc ctatgaaatt gttaaacctg gaacatgaca ttgttaatca 3360 tataataatg attcttaaat gctgtatggt ttattattta aatgggtaaa gccatttaca 3420 taatatagaa agatatgcat atatctagaa ggtatgtggc atttatttgg ataaaattct 3480 caattcagag aaatcatctg atgtttctat agtcactttg ccagctcaaa agaaaacaat 3540 accctatgta gttgtggaag tttatgctaa tattgtgtaa ctgatattaa acctaaatgt 3600 tctgcctacc ctgttggtat aaagatattt tgagcagact gtaaacaaga aaaaaaaaat 3660 catgcattct tagcaaaatt gcctagtatg ttaatttgct caaaatacaa tgtttgattt 3720 tatgcacttt gtcgctatta acatcctttt tttcatgtag atttcaataa ttgagtaatt 3780 ttagaagcat tattttagga atatatagtt gtcacagtaa atatcttgtt ttttctatgt 3840 acattgtaca aatttttcat tccttttgct ctttgtggtt ggatctaaca ctaactgtat 3900 tgttttgtta catcaaataa acatcttctg tggaccagga aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3958 <210> 2 <211> 3812 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtgctgcctc gtctgagggg acaggaggat caccctcttc gtcgcttcgg ccagtgtgtc 60 gggctgggcc ctgacaagcc acctgaggag aggctcggag ccgggcccgg accccggcga 120 ttgccgcccg cttctctcta gtctcacgag gggtttcccg cctcgcaccc ccacctctgg 180 acttgccttt ccttctcttc tccgcgtgtg gagggagcca gcgcttaggc cggagcgagc 240 ctgggggccg cccgccgtga agacatcgcg gggaccgatt caccatggag ggcgccggcg 300 gcgcgaacga caagaaaaag ataagttctg aacgtcgaaa agaaaagtct cgagatgcag 360 ccagatctcg gcgaagtaaa gaatctgaag ttttttatga gcttgctcat cagttgccac 420 ttccacataa tgtgagttcg catcttgata aggcctctgt gatgaggctt accatcagct 480 atttgcgtgt gaggaaactt ctggatgctg gtgatttgga tattgaagat gacatgaaag 540 cacagatgaa ttgcttttat ttgaaagcct tggatggttt tgttatggtt ctcacagatg 600 atggtgacat gatttacatt tctgataatg tgaacaaata catgggatta actcagtttg 660 aactaactgg acacagtgtg tttgatttta ctcatccatg tgaccatgag gaaatgagag 720 aaatgcttac acacagaaat ggccttgtga aaaagggtaa agaacaaaac acacagcgaa 780 gcttttttct cagaatgaag tgtaccctaa ctagccgagg aagaactatg aacataaagt 840 ctgcaacatg gaaggtattg cactgcacag gccacattca cgtatatgat accaacagta 900 accaacctca gtgtgggtat aagaaaccac ctatgacctg cttggtgctg atttgtgaac 960 ccattcctca cccatcaaat attgaaattc ctttagatag caagactttc ctcagtcgac 1020 acagcctgga tatgaaattt tcttattgtg atgaaagaat taccgaattg atgggatatg 1080 agccagaaga acttttaggc cgctcaattt atgaatatta tcatgctttg gactctgatc 1140 atctgaccaa aactcatcat gatatgttta ctaaaggaca agtcaccaca ggacagtaca 1200 ggatgcttgc caaaagaggt ggatatgtct gggttgaaac tcaagcaact gtcatatata 1260 acaccaagaa ttctcaacca cagtgcattg tatgtgtgaa ttacgttgtg agtggtatta 1320 ttcagcacga cttgattttc tcccttcaac aaacagaatg tgtccttaaa ccggttgaat 1380 cttcagatat gaaaatgact cagctattca ccaaagttga atcagaagat acaagtagcc 1440 tctttgacaa acttaagaag gaacctgatg ctttaacttt gctggcccca gccgctggag 1500 acacaatcat atctttagat tttggcagca acgacacaga aactgatgac cagcaacttg 1560 aggaagtacc attatataat gatgtaatgc tcccctcacc caacgaaaaa ttacagaata 1620 taaatttggc aatgtctcca ttacccaccg ctgaaacgcc aaagccactt cgaagtagtg 1680 ctgaccctgc actcaatcaa gaagttgcat taaaattaga accaaatcca gagtcactgg 1740 aactttcttt taccatgccc cagattcagg atcagacacc tagtccttcc gatggaagca 1800 ctagacaaag ttcacctgag cctaatagtc ccagtgaata ttgtttttat gtggatagtg 1860 atatggtcaa tgaattcaag ttggaattgg tagaaaaact ttttgctgaa gacacagaag 1920 caaagaaccc attttctact caggacacag atttagactt ggagatgtta gctccctata 1980 tcccaatgga tgatgacttc cagttacgtt ccttcgatca gttgtcacca ttagaaagca 2040 gttccgcaag ccctgaaagc gcaagtcctc aaagcacagt tacagtattc cagcagactc 2100 aaatacaaga acctactgct aatgccacca ctaccactgc caccactgat gaattaaaaa 2160 cagtgacaaa agaccgtatg gaagacatta aaatattgat tgcatctcca tctcctaccc 2220 acatacataa agaaactact agtgccacat catcaccata tagagatact caaagtcgga 2280 cagcctcacc aaacagagca ggaaaaggag tcatagaaca gacagaaaaa tctcatccaa 2340 gaagccctaa cgtgttatct gtcgctttga gtcaaagaac tacagttcct gaggaagaac 2400 taaatccaaa gatactagct ttgcagaatg ctcagagaaa gcgaaaaatg gaacatgatg 2460 gttcactttt tcaagcagta ggaattattt agcatgtaga ctgctggggc aatcaatgga 2520 tgaaagtgga ttaccacagc tgaccagtta tgattgtgaa gttaatgctc ctatacaagg 2580 cagcagaaac ctactgcagg gtgaagaatt actcagagct ttggatcaag ttaactgagc 2640 tttttcttaa tttcattcct ttttttggac actggtggct cactacctaa agcagtctat 2700 ttatattttc tacatctaat tttagaagcc tggctacaat actgcacaaa cttggttagt 2760 tcaatttttg atcccctttc tacttaattt acattaatgc tcttttttag tatgttcttt 2820 aatgctggat cacagacagc tcattttctc agttttttgg tatttaaacc attgcattgc 2880 agtagcatca ttttaaaaaa tgcacctttt tatttattta tttttggcta gggagtttat 2940 ccctttttcg aattattttt aagaagatgc caatataatt tttgtaagaa ggcagtaacc 3000 tttcatcatg atcataggca gttgaaaaat ttttacacct tttttttcac attttacata 3060 aataataatg ctttgccagc agtacgtggt agccacaatt gcacaatata ttttcttaaa 3120 aaataccagc agttactcat ggaatatatt ctgcgtttat aaaactagtt tttaagaaga 3180 aatttttttt ggcctatgaa attgttaaac ctggaacatg acattgttaa tcatataata 3240 atgattctta aatgctgtat ggtttattat ttaaatgggt aaagccattt acataatata 3300 gaaagatatg catatatcta gaaggtatgt ggcatttatt tggataaaat tctcaattca 3360 gagaaatcat ctgatgtttc tatagtcact ttgccagctc aaaagaaaac aataccctat 3420 gtagttgtgg aagtttatgc taatattgtg taactgatat taaacctaaa tgttctgcct 3480 accctgttgg tataaagata ttttgagcag actgtaaaca agaaaaaaaa aatcatgcat 3540 tcttagcaaa attgcctagt atgttaattt gctcaaaata caatgtttga ttttatgcac 3600 tttgtcgcta ttaacatcct ttttttcatg tagatttcaa taattgagta attttagaag 3660 cattatttta ggaatatata gttgtcacag taaatatctt gttttttcta tgtacattgt 3720 acaaattttt cattcctttt gctctttgtg gttggatcta acactaactg tattgttttg 3780 ttacatcaaa taaacatctt ctgtggacca gg 3812 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 3 cagttgccac ttccacata 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sense strand with 3'NN <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> any, A, T/U, C, G <400> 4 caguugccac uuccacauan n 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense strand with 3'NN <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> any, A, T/U, C, G <400> 5 uauguggaag uggcaacugn n 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Sense Strand <400> 6 caguugccac uuccacauau u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Strand <400> 7 uauguggaag uggcaacugu u 21 <210> 8 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Hairpin duplex with loop <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(27) <223> any, A, T/U, C, G <220> <221> misc_feature <222> (28)..(48) <223> ribonucleotides <400> 8 caguugccac uuccacauan nnnnnnnuau guggaagugg caacuguu 48 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 9 ttgttatggt tctcacaga 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 10 ttatggttct cacagatga 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 11 caggccacat tcacgtata 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 12 aggccacatt cacgtatat 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 13 gccgctcaat ttatgaata 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 14 ccgctcaatt tatgaatat 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 15 caagcaactg tcatatata 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 16 tacgttgtga gtggtatta 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 17 ccggttgaat cttcagata 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 18 tgactcagct attcaccaa 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 19 tgaggaagta ccattatat 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 20 gaggaagtac cattatata 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 21 agttcacctg agcctaata 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 22 gtattccagc agactcaaa 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 23 attccagcag actcaaata 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 24 acaagaacct actgctaat 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 25 tgccaccact gatgaatta 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 26 ccatatagag atactcaaa 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 27 tctgtcgctt tgagtcaaa 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 28 tgcagaatgc tcagagaaa 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 29 gcaatcaatg gatgaaagt 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 30 gctgaccagt tatgattgt 19 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 31 gagctttgga tcaagttaa 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 32 tggctacaat actgcacaa 19 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 33 ctacaatact gcacaaact 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 34 atgatcatag gcagttgaa 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 35 ctatgtagtt gtggaagtt 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 36 gtggaagttt atgctaata 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 37 tgtcgctttg agtcaaaga 19 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 38 gatactagct ttgcagaat 19 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 39 tttgcagaat gctcagaga 19 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 40 acagctgacc agttatgat 19 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 41 gctgaccagt tatgattgt 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 42 cagttatgat tgtgaagtt 19 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 43 gagctttgga tcaagttaa 19 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 44 tggctacaat actgcacaa 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 45 ctacaatact gcacaaact 19 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 46 atgatcatag gcagttgaa 19 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 47 gtggaagttt atgctaata 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 48 ggacacagat ttagacttg 19 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 49 gatggaagca ctagacaaa 19 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 50 cgtgttatct gtcgctttg 19 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 51 tcaccaaagt tgaatcaga 19 <210> 52 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Sense Strand <400> 52 caguugccac uuccacaua 19 <210> 53 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Strand <400> 53 uauguggaag uggcaacug 19 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Strand <400> 54 cagttgccac ttccacataa tgtga 25 <210> 55 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Sense Strand <400> 55 caguugccac uuccacauaa uguga 25 <210> 56 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Strand <400> 56 ucacauuaug uggaaguggc aacuguu 27

Claims

센스 뉴클레오티드 가닥, 생리적 조건 하에 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 부분에 혼성화되고 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함하며, 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하여 HIF1A mRNA의 발현을 약화시키는 것을 포함하는, 대상에서 HIF1A mRNA의 발현 약화 방법.
제 1항에 있어서, 대상은 안구의 혈관신생을 갖는 인간임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 대상은 안구의 혈관신생 진전의 위험이 있는 인간임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 조성물은 국소적, 유리체, 경공막(transcleral), 눈주변, 결막, 테논낭하, 전방, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 411, 580, 583, 868, 869, 1099, 1100, 1242, 1302, 1371, 1396, 1559, 1560, 1809, 2085, 2087, 2105, 2138, 2256, 2358, 2422, 2636, 2666, 2743, 2858, 2861, 3135, 3544, 3554, 1943, 1791, 2351 또는 1408을 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA를 표적으로 하도록 설계됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 2360, 2411, 2420, 2536, 2539, 2545, 2616, 2731, 2734, 3008 또는 3427을 포함하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA를 표적으로 하도록 설계됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 가닥, 생리적 조건 하에 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 제 2의 부분에 혼성화되고 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각에 상응하는 mRNA의 제 2의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함하며, 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 제 2의 간섭 RNA를 대상에 투여하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
센스 뉴클레오티드 가닥, 생리적 조건 하에 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 부분에 혼성화되고 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함하며, 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 눈에 투여하여 안구의 혈관신생을 치료하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 안구의 혈관신생의 치료 방법.
19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 단일 가닥 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하여 HIF1A mRNA의 발현을 약화시키는 것을 포함하는, 대상의 HIF1A mRNA의 발현 약화 방법으로서,

상기 단일 가닥 간섭 RNA는 생리적 조건하에 뉴클레오티드 411, 580, 583, 868, 869, 1099, 1100, 1242, 1302, 1371, 1396, 1559, 1560, 1809, 2085, 2087, 2105, 2138, 2256, 2358, 2422, 2636, 2666, 2743, 2858, 2861, 3135, 3544, 3554, 1943, 1791, 2351 또는 1408을 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화되고, 간섭 RNA는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖거나;

단일 가닥 간섭 RNA는 생리적 조건하에 뉴클레오티드 2360, 2411, 2420, 2536, 2539, 2545, 2616, 2731, 2734, 3008 또는 3427을 포함하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화되고, 간섭 RNA는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 혼 성화 부분을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 방법.
19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 51 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하여 HIF1A mRNA의 발현을 약화시키는 것을 포함하는, 대상에서 HIF1A mRNA의 발현 약화 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 36 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 번호 37 - 서열 번호 51 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 식별자로 확인되는 서열에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 14개의 뉴클레오티드와 적어도 85% 서열 상보성 또는 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 식별자로 확인되는 서열에 각각 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 15, 16, 17 또는 18개의 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 상보성 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 적어도 15, 16, 17 또는 18개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 51 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 제 2의 간섭 RNA를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 51 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 눈에 투여하여 안구의 혈관신생을 치료하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 안구의 혈관신생의 치료 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 36 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 번호 37 - 서열 번호 51 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 대상은 망막 부종, 망막 허혈 또는 당뇨병성 망막증을 가짐을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 가닥과 안티센스 뉴클레오티드 가닥은 헤어핀 루프에 의해 연결됨을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 가닥과 안티센스 뉴클레오티드 가닥은 헤어핀 루프에 의해 연결됨을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 shRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 shRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 siRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 siRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 조성물은 국소적, 유리체, 경공막, 눈주변, 결막, 테논낭하, 전방, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 조성물은 국소적, 유리체, 경공막, 눈주변, 결막, 테논낭하, 전방, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 경로를 통하여 투여됨을 특징으 로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 조성물은 간섭 RNA 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 조성물은 간섭 RNA 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 대상은 망막 부종, 망막 허혈 또는 당뇨병성 망막증을 가짐을 특징으로 하는 방법.
RNA 간섭을 통하여 HIF1A 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 안구의 혈관신생의 치료 방법으로서,

siRNA 분자의 각각의 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 27개의 뉴클레오티드 길이이고; siRNA 분자의 하나의 가닥은 HIF1A 유전자에 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 siRNA 분자가 RNA 간섭을 통하여 mRNA 절단을 지시하는 방법.
제 33항에 있어서, 조성물은 에어로졸, 구강, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복강내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 33항에 있어서, 간섭 RNA는 간섭 RNA의 발현이 가능한 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 33항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 33항에 있어서, siRNA 분자의 각 가닥은 독립적으로 약 19 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이임을 특징으로 하는 방법.
제 33항에 있어서, siRNA 분자의 각 가닥은 독립적으로 약 19 뉴클레오티드 내지 약 21개의 뉴클레오티드 길이임을 특징으로 하는 방법.
19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 51의 임의의 하나에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 간섭 RNA 또는 그의 상보물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
제 39항에 있어서, 간섭 RNA는 shRNA임을 특징으로 하는 조성물.
제 39항에 있어서, 간섭 RNA는 siRNA임을 특징으로 하는 조성물.
제 39항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 조성물.
RNA 간섭을 통하여 HIF1A 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물로서,

siRNA 분자의 각각의 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 27개의 뉴클레오티드 길이이고; siRNA 분자의 하나의 가닥은 HIF1A 유전자에 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 siRNA 분자가 RNA 간섭을 통하여 mRNA 절단을 지시하는 조성물.
제 43항에 있어서, siRNA 분자의 각 가닥은 독립적으로 약 19 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이임을 특징으로 하는 조성물.
제 43항에 있어서, siRNA 분자의 각 가닥은 독립적으로 약 19 뉴클레오티드 내지 약 21개의 뉴클레오티드 길이임을 특징으로 하는 조성물.
서열 번호 3, 서열 번호 9 - 서열 번호 51의 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하 고, 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체의, 대상의 HIF1A mRNA의 발현 약화를 위한 조성물을 제조하는데 있어서 용도.
서열 번호 3, 서열 번호 9 - 서열 번호 51의 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하고, 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의, 대상에서 안구의 혈관신생 치료용 의약을 제조하는데 있어서 용도.
제 46 또는 47항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 식별자로 확인되는 서열에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 14개의 뉴클레오티드와 적어도 85% 서열 상보성 또는 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 46 또는 47항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 식별자로 확인되는 서열에 각각 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 15, 16, 17 또는 18개의 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 상보성 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 적어도 15, 16, 17 또는 18개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 46 또는 47항에 있어서, 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 51 중 임의의 하나에 상응하는 제 2 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 제 2의 간섭 RNA를 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
센스 뉴클레오티드 가닥, 생리적 조건 하에 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 부분에 혼성화되고 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함하며, 19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의, 대상에서 안구의 혈관신생 치료용 의약을 제조하는데 있어서 용도.
19 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 단일 가닥 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체의, 대상의 HIF1A mRNA의 발현 약화를 위한 조성물을 제조하는데 있어서 용도로서,

단일 가닥 간섭 RNA는 생리적 조건 하에 뉴클레오티드 411, 580, 583, 868, 869, 1099, 1100, 1242, 1302, 1371, 1396, 1559, 1560, 1809, 2085, 2087, 2105, 2138, 2256, 2358, 2422, 2636, 2666, 2743, 2858, 2861, 3135, 3544, 3554, 1943, 1791, 2351 또는 1408을 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화되고 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖거나;

단일 가닥 간섭 RNA는 생리적 조건 하에 뉴클레오티드 2360, 2411, 2420, 2536, 2539, 2545, 2616, 2731, 2734, 3008 또는 3427을 포함하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화되고 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 용도.
제 51항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 가닥과 안티센스 뉴클레오티드 가닥은 헤어핀 루프에 의해 연결됨을 특징으로 하는 용도.
제 46, 47 또는 51항에 있어서, 간섭 RNA는 shRNA임을 특징으로 하는 용도.
제 46, 47 또는 51항에 있어서, 간섭 RNA는 siRNA임을 특징으로 하는 용도.
제 46, 47 또는 51항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 용도.
제 47 또는 51항에 있어서, 조성물은 국소적, 유리체, 경공막, 눈주변, 결 막, 테논낭하, 전방, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 투여용으로 제조됨을 특징으로 하는 용도.
제 47 또는 51항에 있어서, 조성물은 간섭 RNA의 발현이 가능한 발현 벡터를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 47 또는 51항에 있어서, 의약은 안구의 혈관신생 치료용임을 특징으로 하는 용도.
RNA 간섭을 통하여 HIF1A 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물의, 대상에서 안구의 혈관신생 치료용 의약을 제조하는데 있어서 용도로서,

siRNA 분자의 각각의 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 27개의 뉴클레오티드 길이이고; siRNA 분자의 하나의 가닥은 각각 HIF1A 유전자에 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 siRNA 분자가 RNA 간섭을 통하여 mRNA 절단을 지시하는 용도.
제 60항에 있어서, 조성물은 에어로졸, 구강, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복강내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 투여용으로 제조됨을 특징으로 하는 용도.
제 60항에 있어서, 조성물은 간섭 RNA의 발현이 가능한 발현 벡터를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 60항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 용도.