BRPI0620725A2

BRPI0620725A2 - inibição mediada por rnai de hif1a para tratamento de angiogênese ocular

Info

Publication number: BRPI0620725A2
Application number: BRPI0620725-1A
Authority: BR
Inventors: Jon E Chatterton; David P Bingaman
Original assignee: Alcon Res Ltd
Priority date: 2005-12-29
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2011-11-22
Also published as: US20200048637A1; US20200277608A1; US20220364097A1; US20190144866A1; JP2009522304A; US20190338287A1; US20150167002A1; KR20080091108A; US8940887B2; US20220042021A1; US20190071676A1; US20210230603A1; WO2007076351A2; US8471000B2; AR056852A1; UY30061A1; CN101326287A; US20100144844A1; US20190256854A1; US20120245217A1

Abstract

INIBIçãO MEDIADA POR RNAi DE HIF1A PARA TRATAMENTO DE ANGIOGENESE OCULAR. A presente invenção refere-se a interferência de RNA que é proporcionada para inibição da expressão de mRNA de HIF1A para tratar pacientes com angiogênese ocular, particularmente para tratar edema retiniano, retinopatia diabética, sequela associada à isquemia retiníana, neovascularização do segmento posterior (PSVN), e glaucoma neovascular, e para tratar pacientes em risco de desenvolver tais condições.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBIÇAO MEDIADA POR RNAi DE HIF1A PARA TRATAMENTO DE ANGIOGÊNE- SE OCULAR".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de composições de RNA de interferência para inibição da expressão de fator-1a induzível por hipoxia (HIF-1a), a proteína codificada por mRNA de HIF1A, em angiogêne- se ocular, incluindo aquelas alterações celulares resultantes da atividade do fator de transcrição de HIF-Ia que levam direta ou indiretamente à, por e- xemplo, neovascularização ocular, edema retiniano, retinopatia diabética, seqüela associada à isquemia retiniana, neovascularização de segmento posterior, e glaucoma neovascular.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Retinopatia diabética (RD) é uma doença ocular que se desen- volve no diabetes devido às alterações nas células revestem os vasos san- güíneos, isto é o endotélio microvascular retiniano. Durante o diabetes meli- to, hiperglicemia pode causar lesões de várias maneiras. Por exemplo, a glicose, ou um metabolito de glicose, se liga aos grupos amino das proteí- nas, levando à lesão tecidual. Além disso, glicose em excesso entra na via do poliol resultando em acúmulos de sorbitol. O sorbitol não pode ser meta- bolizado pelas células da retina e pode contribuir para a pressão osmótica intracelular alta, edema intracelular, difusão comprometida, hipoxia tecidual, lesão celular capilar, e enfraquecimento capilar. Retinopatia diabética envol- ve espessamento de membranas de base capilar, que pode, por sua vez, impedir que pericitos, o tipo de célula perivascular predominante nos capila- res retinianos, contraiam células endoteliais. A morte de pericito e de célula endotelial ocorre através de um mecanismo apoptótico durante a retinopatia diabética, onde a perda de pericitos provavelmente aumenta a permeabilida- de dos capilares e leva à ruptura da barreira sangue-retina e desregulação do fluxo sangüíneo. Capilares enfraquecidos levam à formação de aneuris- ma e ainda a vazamento. Esses efeitos de hiperglicemia comprometem tam- bém as funções neuronais na retina. RD está associada a microaneurismas retinianos, hemorragias, exsudados, e proliferação de retinite, isto é cresci- mento massivo de tecido neovascular e conjuntivo sobre a superfície interna da retina. A retinopatia diabética pode ser do tipo de fundo, progressivamen- te caracterizada por microaneurismas; hemorragias puntiformes intra- retinianas; exsudados cerosos amarelos; manchas algodonosas; e edema macular. Isso é um estágio precoce de retinopatia direta denominada retino- patia não proliferativa.

Conforme a patologia microvascular induzida por diabetes pro- gride, capilares retinianos se tornam eventualmente ocluídos e levam às á- reas multifocais de hipoxia isquêmica dentro da retina. Condições hipóxicas no tecido não perfundido provoca um aumento dos níveis de HIF-1a. As alte- rações resultantes na expressão de gene mediada por HIF-1 elicita a produ- ção de fatores de crescimento capazes de estimularem o crescimento anor- mal de novos vasos sangüíneos de vasos existentes (angiogênese). Esses novos vasos sangüíneos patológicos crescem no vítreo e podem causar perda da visão, uma condição chamada retinopatia diabética proliferativa (RDP), pois os novos vasos sangüíneos são frágeis e tendem a vazar san- gue para o olho. O tipo proliferativo de RD é caracterizado por neovasculari- zação da retina e do disco óptico, que pode se projetar no vítreo, prolifera- ção de tecido fibroso, hemorragia vítrea, e no descolamento da retina.

Neovascularização ocorre também em um tipo de glaucoma chamado de glaucoma neovascular no qual a pressão intra-ocular aumenta- da é causada por crescimento do tecido conjuntivo e novos vasos sangüí- neos sobre a rede trabecular. Glaucoma neovascular é uma forma de glau- coma secundário causado por neovascularização no ângulo da câmara.

Neovascularização de segmento posterior (PSNV) é uma pato- logia ameaçadora da visão responsável pelas duas causas mais comuns de cegueira adquirida em países desenvolvidos: degeneração macular exsuda- tiva relacionada à idade (AMD) e RDP. Até recentemente, os únicos trata- mentos aprovados para PSNV que ocorre durante a AMD exsudativa eram fotocoagulação a laser ou terapia fotodinâmica com VISUDYNE®. Ambas as terapias envolvem oclusão da vasculatura afetada, que resulta em dano, in- duzido por laser, permanente à retina, e não ataca a causa subjacente de neovascularização. Recorrência da neovascularização da mesma área é comum. Para pacientes com RDP1 intervenções cirúrgicas com vitrectomia e remoção das membranas pré-retinianas são as únicas opções correntemen- te disponíveis, bem como uma terapia laser denominada fotocoagulação panretiniana para impedir a produção de mais vasos novos.

Esforços farmacêuticos correntes têm focado na inibição dos efeitos dos fatores angiogênicos potentes tais como VEG F, um gene que é regulado por HIF-1. Recentemente, a injeção intravítrea LUCENTIS®, um fragmento de anticorpo anti-VEGF foi aprovado para tratamento de AMD. Esse fragmento de anticorpo foi desenhado para se ligar ao VEGF para inibir a formação de vasos sangüíneos novos. Lucentis está também em experi- ências clínicas para o tratamento de edema macular diabético. Outras abor- dagens incluem o uso de pequeno RNA de interferência direcionando VEGF ou seu receptor.

O rompimento da interação entre o fator de transcrição de HIF-1 e o elemento de reposta de hipoxia em promotores sensíveis ao oxigênio usando inibidores de molécula pequena, convencionais, é provavelmente muito difícil. Como o VEGF, HIF1A não é considerado como sendo "trans- formável em fármaco" no sentido clássico. Além disso, o silenciamento de efetores a jusante individuais de HIF-1, tal como VEGF ou RTP801, pode somente bloquear parcialmente a neovascularização.

A presente invenção ataca os problemas acima citados e pro- porciona RNAs que direcionam o HIF1A, o gene de controle transcricional para genes a jusante envolvidos na angiogênese e permeabilidade vascular (edema).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção é direcionada a RNAs de interferência que silenciam a expressão de mRNA de HIF1A, reduzindo, assim, a atividade transcricional de genes induzíveis por HIF-1 e ao tratamento de angiogênese ao efetuarem a redução da atividade celular pré-angiogênica e angiogênica.

O termo "angiogênese ocular", como usado aqui, inclui condi- ções pré-angiogênicas e condições angiogênicas oculares, e inclui aquelas alterações celulares resultantes da expressão de genes induzíveis por HIF1 que levam direta ou indiretamente à, por exemplo, angiogênese ocular, neo- vascularização ocular, edema retiniano, seqüela associada à isquemia reti- niana, PSNV, e glaucoma neovascular. Os RNAs de interferência da inven- ção são úteis para tratar pacientes com, por exemplo, angiogênese ocular, neovascularização ocular, edema retiniano, retinopatia diabética, seqüela associada à isquemia retiniana, neovascularização de segmento posterior (PSVN) e glaucoma neovascular, ou pacientes em risco de desenvolverem tais condições.

Uma modalidade da presente invenção proporciona um método para atenuar a expressão de um mRNA-alvo de HIF1A em um paciente. O método compreende administrar ao paciente uma composição que compre- ende uma quantidade eficaz de RNA de interferência que tem um compri- mento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a administração é para o olho do paciente para atenu- ar a expressão de um angiogênese ocular em um ser humano.

Em uma modalidade da invenção, o RNA de interferência com- preende um filamento de nucleotídeo sentido, um filamento de nucleotídeo anti-sentido e uma região de complementaridade contígua pelo menos qua- se perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos. Ainda, o filamento anti-sentido hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de um mRNA corres- pondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2, que são seqüências de cDNA que codificam a variante 1 e a variante 2 de HIF1A, respectivamente (Ns de Acesso no GenBank: NM_00153o, e NM_181054, respectivamente). O fila- mento anti-sentido tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibri- dização de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2, res- pectivamente. A administração de tal composição atenua a expressão de um alvo de HIF1A do paciente.

Em uma modalidade da invenção, um RNA de interferência é desenhado para direcionar um mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 que compreende o nucleotídeo 411, 580, 583, 868, 869, 1099, 1100, 1242, 1302, 1371, 1396, 1559, 1560, 1809, 2085, 2087, 2105, 2138, 2256, 2358, 2422, 2636, 2666, 2743, 2858, 2861, 3135, 3544, 3554, 1943, 1791, 2351, ou 1408.

Em uma outra modalidade da invenção, um RNA de interferência é desenhado para direcionar um mRNA correspondente à SEQ ID NO:2 que compreende o nucleotídeo 2360, 2411, 2420, 2536, 2539, 2545, 2616, 2731, 2734, 3008, ou 3427.

A presente invenção proporciona ainda a administração de um segundo RNA de interferência a um paciente além de um primeiro RNA de interferência. O método compreende administrar ao paciente um segundo RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e compreendendo um filamento de nucleotídeo sentido, um filamento de nu- cleotídeo anti-sentido, e uma região de complementaridade pelo menos qua- se perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; em que o filamento anti-sentido do segundo RNA de interferência hibridiza sob condições fisiológicas para uma segunda porção de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2 e o filamento anti-sentido tem uma região de complementaridade pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a segunda porção de hibridização de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2, respectivamente. Ainda, um terceiro, quarto, ou quinto, etc. RNA de interferência podem ser administrados de um modo similar.

Uma outra modalidade da invenção é um método para atenuar a expressão de HIF1A em um paciente, que compreende administrar ao paci- ente uma composição que compreende uma quantidade eficaz de RNA de interferência de filamento simples tendo de 19 a 49 nucleotídeos, e, um veí- culo farmaceuticamente aceitável.

Para atenuar a expressão de HIF1 A, o RNA de filamento simples hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de mRNA que corres- ponde à SEQ ID NO:1, que compreende o nucleotídeo 411, 580, 583, 868, 869, 1099, 1100, 1242, 1302, 1371, 1396, 1559, 1560, 1809, 2085, 2087, 2105, 2138, 2256, 2358, 2422, 2636, 2666, 2743, 2858, 2861, 3135, 3544, 3554, 1943, 1791, 2351, ou 1408, e o RNA de interferência em uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibridização de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, para atenuar a expressão de H1F1A, o RNA de interferência de filamento simples hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de mRNA correspondente à SEQ ID NO:2 que compreende o nucleotídeo 2360, 2411, 2420, 2536, 2539, 2545, 2616, 2731, 2734, 3008, ou 3427. A expressão de HIF1A é, assim, atenuada.

Uma outra modalidade da invenção refere-se a um método para tratar angiogênese ocular. O método compreende administrar ao olho do paciente uma composição que compreende uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veícu- lo farmaceuticamente aceitável, o RNA de interferência compreendendo um filamento de nucleotídeo sentido, um filamento de nucleotídeo anti-sentido, e uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos. O filamento anti-sentido hibridiza sob condi- ções fisiológicas para uma porção de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2 e tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibri- dização de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NOr2, res- pectivamente. A angiogênese ocular é assim tratada.

Uma outra modalidade da invenção refere-se a um método para tratar angiogênese ocular em um paciente que necessite deste, em que o método compreende administrar a um olho do paciente uma composição que compreende uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente acei- tável deste, em que o RNA de interferência compreende uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementari- dade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA corres- pondente a qualquer uma de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:9 - SEQ ID NO:51, em que a angiogênese ocular é assim tratada. Uma outra modalidade da invenção refere-se a um método para atenuar a expressão de um mRNA de alvo de HIF1A em um paciente, com- preendendo administrar ao paciente uma composição que compreende uma quantidade eficaz de RNA de interferência que tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável deste, onde o RNA de interferência compreende uma região de pelo menos 13 nucleotí- deos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente a qualquer uma de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:9 - SEQ ID NO:51.

Em uma outra modalidade da presente invenção, a região de nucleotídeos contíguos é uma região de pelo menos 14 nucleotídeos contí- guos tendo pelo menos 85% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 85% de identidade de seqüência com, os 14 penúltimos nucleo- tídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente à seqüência do iden- tificador de seqüência. Em ainda uma outra modalidade da invenção, a regi- ão de nucleotídeos contíguos é uma região de pelo menos 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 80% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência com, os penúltimos 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' de um mRNA correspondente à seqüência identificada pelo identificador de seqüência.

Uma outra modalidade da invenção refere-se a um método para tratar angiogênese ocular em um paciente que necessite deste, em que o método compreende administrar ao paciente uma composição que compre- ende uma molécula de siRNA de filamento duplo que infra-regula a expres- são de um gene de HIF1A via interferência de RNA1 em que cado filamento da molécula de siRNA é, independentemente, cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimento; e um filamento da molécula de siRNA com- preende uma seqüência de nucleotídeos tendo complementaridade substan- cial para um mRNA correspondente ao gene de HIF1A respectivamente, de modo que a molécula de siRNA direciona a clivagem do mRNA via interfe- rência de RNA.

Uma composição que compreende RNA de interferência que tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e que tem uma seqüência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ IND NO:3, e SEQ ID NO:9 - SEQ ID NO:51, ou um complemento destas, e um veículo farmaceuticamente aceitá- vel é uma modalidade da presente invenção. Em uma modalidade, o RNA de interferência pode ser isolado. O termo "isolado" significa que o RNA de in- terferência está livre de seu meio natural total.

Uma outra modalidade da invenção é uma composição que compreende uma molécula de siRNA de filamento duplo que infra-regula a expressão de um gene de HIF1A via interferência de RNA, em que cado fi- lamento da molécula de siRNA é independentemente de cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimento; e um filamento da molécula de siRNA compreende uma seqüência de nucleotídeos que tem substancial comple- mentaridade para um mRNA correspondente ao gene de HIF1A, respecti- vamente, de modo que a molécula de siRNA direciona a clivagem do mRNA via interferência de RNA.

O uso de qualquer dessas modalidades descritas aqui na prepa- ração de um medicamento para atenuar a expressão de mRNA de HIF1A é também uma modalidade da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura proporciona um Western blot de HIF-1α de células He- La transfectadas com siRNAS de HIF1A n° 1, n° 3, n° 5 e um siRNA de con- trole isento de RISC, cada em 10nM, 1nM, e 0,1 nM; um siRNA (NTC2) de controle de não direcionamento 10nM; e um controle de tampão (-siRNA). As setas indicam as posições das bandas da proteína HIF-1α de 93 kD e da proteína adiria de 42 kDa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Interferência de RNA (RNAi) é um processo pelo qual RNA de filamento duplo (dsRNA) é usado para silenciar expressão de gene. Embora não se deseje estar ligado a qualquer teoria, RNAi começa com a clivagem de dsRNAs mais longos para pequenos RNAs de interferência (siRNAs) por uma enzima similar à RNaselll, dicer. siRNAs são dsRNAs que são usual- mente de cerca de 19 a 28 nucleotídeos, ou 20 a 25 nucleotídeos, ou 21 a 22 nucleotídeos de comprimento e freqüentemente contêm pendentes de 2 nucleotídeos em 3', e nas terminações fosfato em 51 e hidroxila em 3'. Um filamento do siRNA é incorporada a um complexo de ribonucleoproteína co- nhecido como o complexo silenciador induzido por RNA (RISC). RISC usa esso filamento de siRNA para identificar moléculas de mRNA que são pelo menos parcialmente complementares ao filamento de siRNA incorporado, e então cliva esses mRNAs-alvo ou inibe a sua tradução. Portanto, o filamento de siRNA que é incorporado no RISC é conhecido como filamento guia ou filamento anti-sentido. O outro filamento de siRNA, conhecido como filamen- to passageiro ou o filamento sentido, é eliminada do siRNA e é pelo menos parcialmente homóloga ao mRNA-alvo. Aqueles versados na técnica reco- nhecerão que, em princípio, qualquer filamento de um siRNA pode ser incor- porada ao RISC e funcionar como um filamento guia. Contudo, o desenho de siRNA (por exemplo, estabilidade de dúplex de siRNA reduzida na extremi- dade 5' do filamento anti-sentido) pode favorecer a incorporação do filamen- to anti-sentido ao RISC.

Clivagem de mRNAs mediada por RISC tendo uma seqüência pelo menos parcialmente complementar ao filamento guia leva a um decrés- cimo no nível de estado constante daquele mRNA e da proteína correspon- dente codificada por este mRNA. Alternativamente, RISC pode também re- duzir a expressão da proteína correspondente via repressão traducional sem clivagem do mRNA-alvo. Outras moléculas de RNA e moléculas similares a RNA podem também interagir com RISC e silenciar expressão de gene. E- xemplos de outras moléculas de RNA que podem interagir com RISC inclu- em RNAs curtos de grampo de cabelo (shRNAs), siRNAs de filamento sim- ples, microRNAs (miRNAs), dúplices de 27 mer de substrato de dicer. O termo "siRNA", como usado aqui, refere-se a um RNA de interferência de filamento duplo, a menos que indicado de outro modo. Exemplos de molécu- las similares a RNA que podem interagir com RISC incluem moléculas de RNA contendo um ou mais nucleotídeos quimicamente modificados, um ou mais desoxirribonucleotídeos, e/ou uma ou mais ligações não-fosfodiéster. Para fins da presente discussão, todos os RNA ou moléculas similares a RNA que podem interagir com RISC e participar das alterações mediatas por RISC na expressão gênica serão referidas como "RNAs de interferência". siRNAs, shRNAs, miRNAs, e dúplices de 27 mer de substrato de dicer são, portanto, subconjuntos dos "RNAs de interferência".

RNA de interferência das modalidades da invenção parece agir de um modo catalítico para clivagem de mRNA-alvo, isto é, RNA de interfe- rência é capaz de efetuar a inibição do mRNA-alvo em quantidades subes- tequiométricas. Em comparação com terapias anti-sentido, é requerido signi- ficativamente menos RNA de interferência para proporcionar um efeito tera- pêutico sob tais condições de clivagem.

A presente invenção refere-se ao uso de RNA de interferência para inibir a expressão de fator 1A induzível por hipoxia (HIF1A), interferin- do, assim, na transcrição de vários genes que de outro modo seriam induzi- dos em resposta à tensão reduzida de oxigênio. De acordo com a presente invenção, RNAs de interferência conforme estabelecidos aqui, providos por expressão exógena ou endógena, são particularmente eficazes em silenciar mRNA de HIF1A.

Seqüências de ácidos nucléicos são aqui escritas em uma dire- ção de 5' para 3', a menos que indicado de outra forma. O termo "ácido nu- cléico", como usado aqui, refere-se ou ao DNA ou RNA ou a uma forma mo- dificada destes compreendendo as bases purina ou pirimidina em DNA (a- denina "A", citosina "C", guanina "G", timina "T") ou em RNA (adenina "A", citosina "C", guanina "G", uracil "G"). RNAs de interferência proporcionados aqui podem compreender bases "T", particularmente nas extremidades 3', embora as bases "T" não ocorram naturalmente em RNA. "Ácido nucléico" inclui os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" e pode se referir a uma molécula de filamento simples ou uma molécula de filamento duplo. Uma molécula de filamento duplo é formada pelo pareamento de bases de Watson-Crick entre as bases A e T, as bases C e G, e entre as bases A e U. Os filamentos de uma molécula de filamento duplo podem ter complementa- ridade parcial, substancial ou inteira uma com relação à outra, e formarão um híbrido dúplex, cuja resistência de ligação é dependente da natureza e grau de complementaridade da seqüência de bases.

Uma seqüência de mRNA é prontamente deduzida da seqüência da seqüência de DNA correspondente. Por exemplo, a SEQ ID NO:1 propor- ciona a seqüência de filamento sentido de DNA correspondente ao mRNA para a variante 1 de HIF1A. A seqüência de mRNA é idêntica à seqüência de filamento sentido de DNA com as bases "T" substituídas com bases "U". Portanto, a seqüência de mRNA de HIF1A é conhecida da SEQ ID NO:1 e a seqüência de mRNA da é conhecida da variante 2 de HIF1A é conhecida da SEQ ID NO:2.

mRNA de Fator-1 induzível por hipoxia (variante 1 e variante 2 de HIF1A): fator induzível por hipoxia (HIF-1) é um fator de transcrição que é responsável por alterações na expressão de vários genes em resposta à tensão reduzida de oxigênio. HIF-1 é um heterodímero composto de subuni- dades alfa e beta codificadas por HIF1A e ARNT, respectivamente. Pelo menos dois genes induzíveis por HIF-1 têm sido implicados na neovasculari- zação patológica na retina, incluindo VEGF e RTP801 (REDD1). Portanto, a inibição da expressão de HIF1A é proporcionada aqui para atenuar a trans- crição de tais genes e a atividade dos produtos gênicos.

A base de dados GenBank do National Center for Biotechnology Information em ncbi.nlm.nih.gov proporciona a seqüência de DNA para a variante 1 de HIF1A com o N0 de Acesso NM_001530, proporcionado na "Listagem de Seqüências" como SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 proporciona a seqüência de filamento sentido de DNA que corresponde ao mRNA que co- difica a variante 1 de HIF1A (com exceção das bases "T" para as bases "U"). A seqüência de codificação para a variante 1 de HIF1A é a partir de nucleo- tídeos 285-2765.

Equivalentes da seqüência de mRNA da variante 1 de HIF1A citada acima são formas de união alternativas, formas alélicas, isozimas, ou um cognato destas. Um cognato é um mRNA de HIF1A proveniente de uma outra espécie de mamífero que é homóloga à SEQ ID NO:1 (um ortólogo). A base de dados GeriBank do National Center for Biotechnology Information em ncvi.nlm.nih.gov proporciona a seqüência de DNA para a variante 2 de HIF1A como Ns de Acesso NM_181054, proporcionada na "Lis- tagem de Seqüências" como SEQ ID N0:2. A SEQ ID N0:2 proporciona a seqüência de filamento sentido de DNA que correspondente ao mRNA que codifica a variante 2 de HIF1A (com exceção das bases "T" para as bases "U"). A seqüência de codificação para a variante 2 de HIF1A é dos nucleotí- deos 285-2492.

Os equivalentes da seqüência de mRNA da variante 2 de HIF1A citada acima são formas de união alternativas, formas alélicas, isozimas, ou um cognato destas. Um cognato é um mRNA da variante 2 de HIF1A de uma outra espécie de mamífero que é homólogo à SEQ ID N0:2 (um ortólo- go).

Atenuar a expressão de um mRNA: A frase, "atenuar a expres- são de um mRNA", como usada aqui, significa administrar ou expressar uma quantidade de RNA de interferência (por exemplo, um siRNA) para reduzir a tradução de mRNA-alvo em proteína, tanto através da clivagem de mRNA como através da inibição direta de tradução. A redução da expressão do mRNA-alvo ou da proteína correspondente é comumente referida como "knock-down" e é reportada com relação aos níveis presentes seguintes à administração ou à expressão de um RNA de controle não-direcionado (por exemplo, um siRNA de controle não-direcionado). "Knock-down" de expres- são de uma quantidade que inclui entre 50% e 100% é contemplado pelas modalidades aqui. Contudo, não é necessário que tais níveis de "knock- down" sejam obtidos para fins da invenção. Em uma modalidade, um RNA de interferência simples que direciona o alvo de mRNA de HIF1A é adminis- trado para reduzir a produção de HIF1A. Em outras modalidades, dois ou mais RNAs de interferência que direcionam o alvo HIF1A são administrados para diminuir a expressão. Em ainda outras modalidades, um primeiro RNA de interferência que direciona o alvo de variante 1 de HIF1A e um segundo RNA de interferência que direciona o alvo de variante 2 de HIF1A são admi- nistrados para diminuir a expressão de HIF1A. "Knock-down" é comumente avaliado pela medição dos níveis de mRNA usando a ampliação da reação em cadeia de polimerase quantita- tiva (qPCR) ou por medição dos níveis de proteína por Western blot ou por ensaio de imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). A análise do nível de proteína proporciona uma avaliação tanto da clivagem de mRNA bem como da inibição de tradução. Outras técnicas para medir "knock-down" incluem hibridização de solução de RNA1 proteção de nuclease, hibridização nor- thern, monitoramente de expressão gênica com um microarranjo, ligação de anticorpo, radioimunoensaio, e análise de células ativadas por fluorescência.

A inibição dos alvos citados aqui é também deduzida em um ser humano ou mamífero por observação de um sintoma de angiogênese ocular tal como, por exemplo, aumento de edema retiniano, retinopatia diabética, isquemia retiniaria, ou na neovascularização de segmento posterior (PSVN).

RNA de interferência: em uma modalidade da invenção, RNA de interferência (por exemplo, siRNA) tem um filamento sentido e um filamento anti-sentido, e os filamentos sentido e anti-sentido compreendem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos. Em uma outra modalidade da invenção, o RNA de interfe- rência (por exemplo, siRNA) tem um filamento sentido e um filamento antí- sentido, e o filamento anti-sentido compreende uma região de complementa- ridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos para uma seqüência-alvo de mRNA de HIF1A, e o filamento sentido com- preende uma região de identidade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com uma seqüência-alvo de mRNA de HIF1A, respectivamente. Em uma outra modalidade da invenção, o RNA de interfe- rência compreende pelo menos 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos contí- guos tendo percentagens de complementaridade de seqüência para ou, ten- do percentagens de identidade de seqüência com, os 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 penúltimos nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' da seqüên- cia-alvo correspondente dentro de um mRNA.

O comprimento de cado filamento do RNA de interferência com- preende de 19 a 49 nucleotídeos, e pode compreender um comprimento de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, ou 49 nucleotídeos.

O filamento anti-sentido de um siRNA é o agente guia ativo do siRNA em que o filamento anti-sentido é incorporado ao RISC, permitindo assim que o RISC identifique os mRNAs-alvo com complementaridade pelo menos parcial para o filamento de siRNA anti-sentido para clivagem ou re- pressão traducional.

Em modalidades da presente invenção, as seqüências-alvo de RNA de interferência (por exemplo, seqüências-alvo de siRNA) dentro de uma seqüência de mRNA-alvo são selecionadas usando as ferramentas de desenhos disponíveis. RNAs de interferência correspondentes a uma se- qüência-alvo de HIF1A são então testadas por transfecção de células que expressam o mRNA-alvo seguido por avaliação de "knock-down" conforme descrição acima.

Técnicas para selecionar seqüências-alvo para siRNAs são pro- porcionadas por Tuschl, T. et al., "The siRNA User Guide", revisado em 6 de maio de 2004, disponível no site da Rockefeller University; pelo Technical Bulletin nQ 506, "siRNA Design Guide Lines", Ambion Inc. no site da Ambion; e por outras ferramentas de desenho com base na rede, por exemplo, na Invitrogen, Dharmacon, Integrated DNA Technologies, Genscript, ou sítios da Proligo. Os parâmetros de buscas iniciais incluem os teores de G/C entre 35% e 55% e comprimentos de siRNA entre 19 e 27 nucleotídeos. A se- qüência-alvo pode estar localizada na região de codificação ou nas regiões não traduzidas 5' ou 3' do mRNA.

Uma modalidade de uma seqüência-alvo de DNA de 19 nucleo- tídeos comum à variante 1 de HIF1A e à variante 2 de HIF1A está presente nos nucleotídeos 411 a 429 da SEQ ID NO:1 :

5'- CAGTTGCCACTTCCACATA -3' SEQ ID NO:3.

Um siRNA da invenção para direcionar uma seqüência de mR- NA correspondente da SEQ ID NO:3 e que tem filamentos de 21- nucleotídeos e um pendente de 2 nucleotídeos em 3' é: 5'- CAGUUGCCACUUCCACAUANN -3' SEQ ID NO:4 3'- NNGUCAACGGUGAAGGUGUAU -5' SEQ ID Ν0:5.

Cada resíduo "Ν" pode ser qualquer nucleotídeo (A, C, G, U1 T) ou nucleotídeo modificado. A extremidade 3' pode ter um número de resí- duos "N" entre e incluindo 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Os resíduos "N" em qualquer das filamentos podem ser o mesmo resíduo (por exemplo, UU, AA, CC, GG, ou TT) ou eles podem ser diferentes (por exemplo, AC, AG, AU, CA, CG, CU, GA, GC, GU, UA, UC, ou UG). Os pendentes em 3' podem ser iguais ou eles podem ser diferentes. Em uma modalidade, ambos os filamentos têm um pendente UU em 3'.

Um siRNA da invenção para direcionar uma seqüência de mR- NA correspondente de SEQ ID N0:3 e tendo filamentos de 21 nucleotídeos e um pendente UU em 3' em cado filamento é:

5'- CAGUUGCCACUUCCACAUAUU -3' SEQ ID N0:6 3- UUGUCAACGGUGAAGGUGUAU -5' SEQ ID N0:7.

O RNA de interferência pode ter também um pendente 5' de nu- cleotídeos ou pode ter extremidades cegas. Um siRNA da invenção para direcionar uma seqüência de mRNA correspondente de SEQ ID NO:3 e ten- do filamentos de 19 nucleotídeos e extremidades cegas é:

5'- CAGUUGCCACUUCCACAUA -3' SEQ ID NO:52 3'- GUCAACGGUGAAGGUGUAU -5' SEQ ID N0:§3.

As filamentos de um RNA de interferência de filamento dupla (por exemplo, um siRNA) pode ser conectado para formar uma estrutura de grampo de cabelo ou em alça-haste (por exemplo, um shRNA). Um shRNA da invenção que direciona uma seqüência de mRNA correspondente da SEQ ID N0:1 e tendo uma região em haste de filamento dupla de 19 bp e um pendente de UU em 3' é:

<formula>formula see original document page 16</formula>

SEQ ID N0:8.

N é um nucleotídeo A, T, C, G, U, ou uma forma modificada co- nhecida por aquele ordinariamente versado na técnica. O número de nucleo- tídeos N na alça é um número entre e incluindo 3 a 23, ou 5 a 15, ou 7 a 13, ou 4 a 9, ou 9 a 11, ou o número de nucleotídeos N é 9. Alguns dos nucleo- tídeos na alça podem estar envolvidos em interações de pares de base com outros nucleotídeos na alça. Exemplos de seqüências de oligonucleotídes que podem ser usados para formar a alça incluem 5'-UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296: 550) e 5'-UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D. et al. (2002) RNA 8:1454). Será reconhecido por aquele ver- sado na técnica que o oligonucleotídeo de cadeia simples resultante forma uma estrutura de alça-haste ou de grampo de cabelo que compreende uma região de filamento duplo capaz de interagir com o maquinário de RNAi.

A seqüência-alvo de siRNA identificada acima pode ser estendi- da na extremidade 3' para facilitar o desenho de dúplices de 27 mer de subs- trato de dicer. A extensão da seqüência-alvo de DNA de 19 nucleotídeos (SEQ ID NO:3) identificada na seqüência de DNA de HIF1A (SEQ ID NO:1) por 6 nucleotídeos rende uma seqüência-alvo de DNA de 25 nucleotídeos presentes nos nucleotídeos 411 a 435 da SEQ ID NO:1: 5'- CAGTTGCCACTTCCACATAATGTGA -3' SEQ ID NO:54.

Um dúplex de 27 mer de substrato de dicer da invenção para direcionar uma seqüência de mRNA correspondente de SEQ ID NO:54 é: 5'- CAGUUGCCACUUCCACAUAAUGUGA -3' SEQ ID NO:55 3'- UUGUCAACGGUGAAGGUGUAUUACACU -5' - SEQ ID NO:56.

Os dois nucleotídeos na extremidade 3' do filamento sentido (isto é, os nucleotídeos GA da SEQ ID NO:55) podem ser desoxinucleotídeos para processamento aperfeiçoado. O desenho dos dúplices de 27 mer do substrato de dicer de seqüências-alvo de 19-21 nucleotídeos, tal como pro- porcionado aqui, é ainda discutido no site da Integrated DNA Technologies (IDT) e por Kim, D.-H. et al., (fevereiro de 2005) Nature Biotechnology 23:2; 222-226.

Quando RNAs de interferência são produzidos por síntese quí- mica, fosforilação na posição 5' do nucleotídeo na extremidade 5' de um ou ambos os filamentos (quando presentes) pode aumentar a eficácia do siRNA e a especificidade do complexo de RISC ligado, mas não é requerida já que a fosforilação pode ocorrer intracelularmente. A Tabela 1 lista os exemplos de seqüências-alvo de DNA da va- riante 1 e da variante 2 de HIF1A da SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, respecti- vamente, das quais os siRNAs da presente invenção são desenhados de um modo conforme estabelecido acima. HIF1A codifica fator-1 alfa induzível por hipoxia, conforme citado acima.

Tabela 1. Seqüências-alvo de HIF1A para siRNAs

<table>table see original document page 18</column></row><table> <table>table see original document page 19</column></row><table>

Conforme citado nos exemplos acima, aquele versado na técni- ca é capaz de usar a informação da seqüência-alvo fornecida na Tabela 1 para desenhar RNAs de interferência tendo um comprimento mais curto ou mais longo que as seqüências fornecidas na tabela e por referência à posi- ção da seqüência em SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 e adição ou deleção de nucleotídeos complementares ou quase complementares à SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, respectivamente.

A reação de clivagem de RNA-alvo guiada por siRNAs e outras formas de RNA de interferência é altamente específica para seqüência. Em geral, siRNA contendo um filamento de nucleotídeo de sentido idêntica na seqüência a uma porção do mRNA-alvo e um filamento de nucleotídeo anti- sentido exatamente complementar a uma porção do mRNA-alvo são modali- dades de siRNA para inibição dos mRNAs citados aqui. Contudo, 100% de complementaridade de seqüência entre o filamento de siRNA anti-sentido e o mRNA-alvo, ou entre o filamento de siRNA anti-sentido e o filamento de siRNA sentido, não é requerido para a prática da invenção. Assim, por e- xemplo, a invenção permite que variações de seqüências sejam esperadas devido à mutação genética, polimorfismo de cepa, ou divergência evolucio- nária.

Em uma modalidade da invenção, o filamento anti-sentido do siRNA tem complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com o mRNA-alvo. "Quase perfeita", como usado aqui, significa qüe o filamento anti-sentido do siRNA é "substancialmente complementar a", e o filamento sentido do siRNA é "substancialmente idênti- ca a" pelo menos uma porção do mRNA-alvo. "Identidade", como conhecida daquele ordinariamente versado na técnica, é o grau de relacionamento en- tre seqüências de nucleotídeos conforme determinado por correspondência da ordem e identidade dos nucleotídeos entres as seqüências. Em uma mo- dalidade, o filamento anti-sentido de um siRNA tendo 80% e de 80% até 100% de complementaridade, por exemplo, 85%, 90% ou 95% de comple- mentaridade, à seqüência de mRNA-alvo é considerado de complementari- dade quase perfeita e pode ser usado na presente invenção. Complementa- ridade contígua "perfeita" é o pareamento de base de Watson-Crick-padrão de pares de base adjacentes. Complementaridade contígua "pelo menos quase perfeita" inclui complementaridade "perfeita" como usada aqui. Méto- dos computacionais para determinar a identidade ou complementaridade são desenhados para identificar o maior grau de correspondência de seqüências de nucleotídeos, por exemplo, BLASTN (Altschul, S.F., et al (1990) J. MoL Biol. 215:403-410).

O termo "identidade em percentagem" descreve a percentagem de nucleotídeos contíguos em uma primeira molécula de ácido nucléico que é a mesma que em um grupo de nucleotídeos contíguos do mesmo compri- mento em uma segunda molécula de ácido nucléico. O termo "complementa- ridade em percentagem" descreve a percentagem de nucleotídeos contíguos em uma primeira molécula de ácido nucléico que pode ser um par de bases no sentido de Watson-Crick com um grupo de nucleotídeos contíguos em uma segunda molécula de ácido nucléico.

A relação entre um mRNA-alvo (filamento sentido) e um filamen- to de um siRNA (o filamento sentido) é aquele da identidade. O filamento sentido de um siRNA é também chamada de filamento passageiro, se pre- sente. A relação entre um mRNA-alvo (filamento sentido) e o outro filamento de um siRNA (o filamento anti-sentido) é aquele de complementaridade. O filamento anti-sentido de um siRNA é também chamado de um filamento guia.

A penúltima base em uma seqüência de ácidos nucléicos que é escrita em uma direção de 5' a 3' é a seguinte para a última base, isto é, a seguinte base para a base 3'. As 13 penúltimas bases de uma seqüência de ácidos nucléicos escrita em uma direção de 5' para 3 são pelo menos as 13 últimas bases próximas à base 3' e não incluindo a base 3'. Similarmente, as 14, 15, 16, 17, ou 18 penúltimas bases de uma seqüência de ácidos nucléi- cos escrita em direção de 5' a 3' são as últimas 14, 15, 16, 17, ou 18 bases de uma seqüência, respectivamente, próximas à base 3' e não incluindo a base 3".

A frase "uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente a qualquer uma de (um i- dentificador de seqüência)" permite uma substituição de nucleotídeo. Duas substituições de nucleotídeos (isto é, 11/13 = 85% de identida- de/complementaridade) não estão incluídas em tal frase.

Em uma modalidade da invenção, a região de nucleotídeos con- tíguos é uma região de pelo menos 14 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 85% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 85% de identidade de seqüência com, os 14 penúltimos nucleotídeos da extremi- dade 3' de um mRNA correspondente à seqüência identificada por cada i- dentificador de seqüência. Duas substituições de nucleotídeo (isto é 12/14 = 86% de identidade/complementaridade) estão incluídas em tal frase.

Em uma outra modalidade da invenção, a região de nucleotídeos contíguos é uma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos contí- guos tendo pelo menos 80% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência com, os 14 penúltimos da ex- tremidade 3' de um mRNA correspondente à seqüência do identificador de seqüência. Três substituições de nucleotídeo são incluídas em tal frase.

A séqüência-alvo nos mRNAs correspondentes à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2 pode estar nas regiões não traduzidas 5' ou 3' do mRNA, bem como na região de codificação do mRNA.

Um õu ambos os filamentos do RNA de interferência de filamen- to dupla podem ter um pendente em 3' de 1 a 6 nucleotídeos, que podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma mistura destes. Os nu- cleotídeos do pendente não são pares de base. Em uma modalidade da in- venção, o RNA de interferência compreende um pendente em 3' de TT ou UU. Em uma outra modalidade da invenção, o RNA de interferência compre- ende pelo menos uma extremidade cega. As terminações têm usualmente um grupo fosfato em 5' ou um grupo hidroxila em 3'. Em outras modalidades, o filamento anti-sentido tem um grupo fosfato em 5', e o filamento sentido tem um grupo hidroxila em 5'. Em ainda outras modalidades, os terminais são ainda modificados por adição covalente de outras moléculas ou grupos funcionais.

Os filamentos sentido e anti-sentido do siRNA de filamento duplo podem estar em uma formação de dúplex de dois filamentos simples con- forme descrição acima ou podem estar em uma molécula simples onde as regiões de complementaridade são pares de base e são covalentemente ligadas por uma alça em grampo de cabelo de modo a formarem um filamen- to simples. Acredita-se que o grampo de cabelo seja clivado intracelularmen- te por uma proteína denominada dicer para formar um RNA de interferência de duas moléculas de RNA de pares de base. RNAs de interferência podem diferir de RNA que ocorre na natu- reza pela adição, deleção, substituição ou modificação de um ou mais nu- cleotídeos. Material não-nucleotídeo pode ser ligado ao RNA de interferên- cia, tanto na extremidade 5' como na extremidade 3', ou internamente. Tais modificações são comumente desenhadas para aumentar a resistência à nuclease dos RNAs de interferência, para aperfeiçoar a absorção celular, para intensificar o direcionamento celular, para auxiliar a traçar o RNA de interferência, para ainda aumentar a estabilidade, ou para reduzir o potencial para ativação da via de interferon. Por exemplo, RNAs de interferência po- dem compreender o nucleotídeo purina nas extremidades dos pendentes. A conjugação de colesterol à extremidade 3' do filamento sentido de uma mo- lécula de siRNA por meio de um Iigante de pirrolidina, por exemplo, propor- ciona também estabilidade para um siRNA. Outras modificações incluem uma molécula de biotina na terminação 3', um peptídeo conhecido como tendo propriedades penetrantes de célula, uma nanopartícula, um peptido- mimético, um corante fluorescente, ou um dendrímero, por exemplo.

Nucleotídeos podem ser modificados sobre sua porção de base, sobre sua porção de açúcar, ou sobre a porção de fosfato da molécula e da função nas modalidades da presente invenção. As modificações incluem, por exemplo, substituições com grupos alquila, alcóxi, amina, desaza, halo, hi- droxila, tiol, ou combinações destes. Nucleotídeos podem ser substituídos com análogos com maior estabilidade tais como substituir um ribonucleotí- deo com um desoxirribonucleotídeo, ou tendo modificações no açúcar tais como grupos 2' OH substituídos por grupos 2' amino, grupos 2' O-metila, grupos 2' metoxietila, ou uma ponte 2'-0, 4'-C metileno, por exemplo. Exem- plos de um análogo de purina ou de pirimidina de nucleotídeos incluem uma xantina, uma hipoxantina, uma azapurina, uma metiltioadenina, 7-desaza- adenosina e nucleotídeos modificados em O ou em Ν. O grupo fosfato do nucleotídeo pode ser modificado por substituição de um ou mais dos oxigê- nios do grupo fosfato com nitrogênio ou com enxofre (fosforotioatos). As mo- dificações são úteis, por exemplo, para intensificar a função, para aumentar a estabilidade ou a permeabilidade, ou para direcionar a localização ou dire- cionamento.

Pode existir uma região ou regiões do filamento de RNA de inter- ferência anti-sentido que é(são) não complementar(es) a uma porção da SEQ ID NO:1 ou da SEQ ID NO:2. As regiões de não-complementaridade podem estar em 3', 5' ou em ambas as extremidades de uma região com- plementar ou entre duas regiões complementares.

RNAs de interferência podem ser gerados de modo exógeno por síntese química, por transcrição in vitro, ou por clivagem de RNA de filamen- to duplo mais longo com dicer ou com uma outra nuclease apropriada com atividade similar. RNAs de interferência quimicamente sintetizados, produzi- dos de fosforamiditas de ribonucleosídeos protegidos usando um sintetiza- dor de DNA/RNA convencional, podem ser obtidos de fornecedores comer- ciais, tais como Ambion Inc. (Austin, TX), Invitrogen (Carlsbad, CA), ou Dharmacon (Lafayette, CO). RNAs de interferência são purificados por ex- tração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma combinação destes, por exemplo. Alternativamente, RNA de interfe- rência pode ser usado com pouco, se alguma purificação, para evitar perdas devidas ao processamento de amostra.

RNAs de interferência podem ser também expressos de modo endógeno a partir de vetores de expressão de plasmídeo ou virais ou de cassetes de expressão mínima, por exemplo, fragmentos gerados por PCR compreendendo um ou mais promotores e um modelo ou modelos apropria- dos para o RNA de interferência. Exemplos de vetores de expressão com base em plasmídeo para shRNA, comercialmente disponíveis, incluem membros da série pSilencer (Ambion, Austin, TX) e pCpG-siRNA (InvivoGen, San Diego, CA). Vetores virais para expressão de RNA de interferência po- dem ser derivados de uma variedade de vírus, incluindo adenovírus, vírus adeno-associado, lentivírus (por exemplo, HIV, FIV, e EIAV), e herpesvírus. Exemplos de vetores virais para expressão de shRNA, comercialmente dis- poníveis, incluem adeno pSilencer (Ambion, Austin, TX) e pLenti6/BL0CK-i®- DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA). Seleção de vetores virais, métodos para expressar o RNA de interferência do vetor e métodos para distribuir o vetor viral estão dentro do conhecimento 20 ordinariamente versado na técnica. Exemplos de kits para produção de cassetes de expressão de shRNA gera- dos por PCR incluem Silencer Express (Ambion, Austin, TX) e siXpress (Mi- rus, Madison, Wl). Um primeiro RNA de interferência pode ser administrado via expressão in vivo de um primeiro vetor de expressão capaz de expressar o primeiro RNA de interferência, e um segundo RNA de interferência pode ser administrado via expressão in vivo de um segundo vetor de expressão capaz de expressar o segundo RNA de interferência, ou ambos RNAs de interferência podem ser administrados via expressão in vivo de um vetor de expressão simples capaz de expressar ambos os RNAs de interferência.

RNAs de interferência podem ser expressos a partir de uma va- riedade de promotores eucarióticos conhecidos daqueles ordinariamente versado na técnica, incluindo promotores pol III, tais como os promotores U6 ou H1, ou promotores pol II, tal como o promotor citomegalovírus. Aqueles versados na técnica reconhecerão que esses promotores podem ser tam- bém adaptados para permitir a expressão induzível do RNA de interferência.

Hibridização sob Condições Fisiológicas: Em certas modalidades da presente invenção, um filamento anti-sentido de um RNA de interferência hibridiza com um mRNA in vivo como parte do complexo RISC.

"Hibridização" refere-se a um processo, no qual ácidos nucléicos de filamento simples com seqüências de bases complementares ou quase complementares interagem para formar complexos ligados a hidrogênio chamados híbridos. As reações de hibridização são sensíveis e seletivas. In vitro, a especificidade de hibridização (isto é estringência) é controlada pelas concentrações de sal ou formamida na pré-hibridização e soluções de hibri- dização, por exemplo, e pela temperatura de hibridização; tais procedimen- tos são bem-conhecidos da técnica. Em particular, estringência é aumentada pela redução da concentração de sal, aumento da concentração de forma- mida, ou elevação da temperatura de hibridização.

Por exemplo, condições de alta estringência poderiam ocorrer em cerca de 50% de formamida, a 37°C a 42°C. Condições de estringência reduzida poderiam ocorrer em cerca de 35% a 25% de formamida, a 30°C a 35°C. Exemplos de condições de estringência para hibridização são mostra- dos por Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring1 N.Y. Outros exemplos de con- dições de hibridização estringentes incluem NaCI a 400mM, PIPES a 40mM pH 6,4, EDTA a 1mM, 50°C ou 70°C, por 12 a 16 horas, seguido por lava- gem, ou hibridização a 70°C, a 70°C, em 1XSSC ou a 50°C em 1XSSC, for- mamida a 50% seguido por lavagem a 70°C em 0,3XSSC, ou hibridização a 70°C em 4XSSC ou a 50°C em 4XSSC, formamida a 50% seguido por lava- gem a 67°C em 1XSSC. A temperatura para hibridização é de cerca de 5- 10°C menor que a temperatura de fusão (Tm) do híbrido, em que Tm é de- terminada para híbridos entre 19 e 49 pares de base de comprimento usan- do o cálculo a seguir: Tm 0C = 81,5 + 16,6 (log10[Na+]) + 0,41 (% de G+G)- (600/N), onde Neo número de bases no híbrido, e [Na+] é a concentração de íons sódio no tampão de hibridização.

O ensaio de hibridização in vitro descrito acima proporciona um método para predizer se uma ligação entre um siRNA candidato e um alvo terá especificidade. Contudo, no contexto do complexo RISC, clivagem es- pecífica de um alvo pode ocorrer também com um filamento anti-sentido que não demonstra alta estringência para hibridização in vitro.

RNA de interferência de filamento simples: Como citado acima, RNAs de interferência funcionam, por fim, como filamentos simples. Verifi- cou-se que RNA de interferência de filamento simples (ss) efetua silencia- mento de mRNA, embora não menos eficazmente que siRNA de filamento duplo. Portanto, as modalidades da presente invenção também proporcio- nam a administração de um RNA de interferência ss que hibridiza sob condi- ções fisiológicas para uma porção de SEQ ID NO:1 ou de SEQ ID NO:2 e tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibridização de SEQ ID ΝΟ:1 ou de SEQ ID NO:2, respectivamente. O RNA de interferência ss tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos tal como para o siRNA ds citado acima. O RNA de interferência ss tem um 5' fosfato ou é fosforilado in situ ou in vivo na posição 5'. O termo "5' fosforilado" é usado para descrever, por exemplo, polinucleotídeos ou oligonucleotídeos tendo um grupo fosfato liga- do via ligação éster à hidroxila C5 do açúcar (por exemplo, ribose, desoxirri- bose, ou um análogo destes) na extremidade 5' do polinucleotídeo ou do oligonucleotídeo.

RNAs de interferência ss são sintetizados quimicamente ou por transcrição in vitro ou expressos de modo endógeno de vetores ou de casse- tes de expressão no que refere-se aos RNAs de interferência ds. Grupos 5' fosfato podem ser adicionados via uma quinase, ou um 5' fosfato pode ser o resultado da clivagem de nuclease de um RNA. Distribuição é quanto aos RNAs de interferência ds. Em uma modalidade, RNAs de interferência ss tendo extremidades protegidas e modificações resistentes à nuclease são administrados para silenciar. RNAs de interferência ss podem ser secados para armazenagem ou dissolvidos em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para inibir anelamento ou para estabilização.

RNA de interferência de grampo de cabelo: um RNA de interfe- rência de grampo de cabelo é uma molécula simples (por exemplo, uma ca- deia de oligonucleotídeo simples) que compreende tanto os filamentos senti- do como anti-sentido de uma RNA de interferência em uma estrutura de al- ça-haste ou de grampo de cabelo (por exemplo, um shRNA). Por exemplo, shRNAs podem ser expressos a partir de vetores de DNA em que os oligo- nucleotídeos de DNA que codificam um filamento de RNA de interferência sentido são ligados aos oligonucleotídeos de DNA que codificam o filamento de RNA de interferência anti-sentido, complementar, reversa, por um espa- çador curto. Se necessário para o vetor de expressão escolhido, os T da terminação 3' e os nucleotídeos que formam sítios de restrição podem ser adicionados. O transcrito de RNA resultante se dobra de volta para si mes- mo para formar uma estrutura de alça-haste.

Modo de administração: RNA de interferência pode ser distribuí- do, por exemplo, por administração via aerossol, bucal, dérmica, intradérmi- ca, inalação, intramuscular, intranasal, intra-ocular, intrapulmonar, intraveno- sa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, emplastro, subcutâ- nea, sublingual, tópica, ou transdérmica. RNA de interferência pode ser distribuído diretamente ao olho por injeção de tecido ocular tal como injeções perioculares, conjuntivais, sub- tenônicas, intracamerais, intravítreas, intra-oculares, sub-retinianas, subcon- juntivais, retrobulbares, ou intracanaliculares; por aplicação direta ao olho usando um cateter ou outro dispositivo de colocação tal como um pélete re- tiniano, inserção intra-ocular, supositório, ou um implante que compreende um material poroso, não poroso, ou gelatinoso; por gotas oculares tópicas ou ungüentos; ou por dispositivo de liberação lenta na cavidade ocular ou im- plantado adjacente à esclera (transescleral) ou dentro do olho. Injeção intra- cameral pode ser através da córnea para a câmara anterior para permitir que o agente atinja a rede trabecular. Injeção intracanalicular pode ser nos ca- nais coletores venosos drenando o canal de Schlemm ou para o canal de Schlemm.

Paciente: Um paciente que necessite de tratamento para angio- gênese ocular ou em risco de desenvolver angiogênese ocular é um ser hu- mano ou outro mamífero tendo angiogênese ocular ou em risco de ter angi- ogênese ocular associada à expressão ou atividade indesejada ou inapropri- ada de HIFIAs, como citado aqui. Outras estruturas oculares associadas a tais distúrbios podem incluir, por exemplo, o olho, retina, coróide, lentes, córnea, rede trabecular, íris, nervo óptico, cabeça do nervo óptico, esclera, segmentos anteriores ou posteriores, ou corpo ciliar. Um paciente pode tam- bém ser uma célula ocular, cultura de célula, órgão ou um órgão ou tecido ex vivo.

Formulações e Dosagem: Formulações farmacêuticas compre- endem RNAs de interferência, ou sais destes, da invenção até 99% em peso misturados com um meio de veículo fisiologicamente aceitável tais como água, tampão, solução salina, glicina, ácido hialurônico, manitol e similares.

RNAs de interferência da presente invenção são administrados como soluções, suspensões, ou emulsões. Os seguintes são exemplos de possíveis formulações englobadas por esta invenção. <table>table see original document page 29</column></row><table>

Em geral, uma quantidade eficaz dos RNAs de interferência de modalidades da invenção resulta em uma concentração extracelular na su- perfície da célula-alvo de IOOpM a 1μΜ, ou de 1nM a 100nM, ou de 5nM a cerca de 50nM, ou a cerca de 25nM. A dose requerida para obtenção dessa concentração local variará dependendo de vários fatores incluindo o método de distribuição, o sítio de distribuição, o número de camadas de células entre o sítio de distribuição e a célula ou tecido-alvo, se a distribuição é local ou sistêmica, etc. A concentração no sítio de distribuição pode ser considera- velmente maior que na superfície da célula ou tecido-alvo. As composições tópicas são distribuídas à superfície do órgão-alvo uma ou quatro vezes ao dia, ou em um programa de distribuição prolongada tal como diariamente, semanalmente, bi-semanalmente, mensalmente, ou mais longos, de acordo com o critério rotineiro de um clínico experiente. O pH da formulação é de cerca de pH 4-9, ou pH 4,5 a pH 7,4.

É esperado que o tratamento terapêutico de pacientes com RNAs de interferência direcionado contra mRNA de HIF1A seja benéfico pa- ra tratamentos com moléculas pequenas por aumento da duração de ação, possibilitando assim dosagem menos freqüente e complacência maior pelos pacientes.

Uma quantidade eficaz de uma formulação pode depender de fatores tais como, por exemplo, idade, raça, e sexo do paciente, da gravida- de da angiogênese ocular, da taxa de renovação do transcrito do gene- alvo/proteína, da potência do RNA de interferência, e da estabilidade do RNA de interferência. Em uma modalidade, o RNA de interferência é distri- buído topicamente para um órgão-alvo e atinge o tecido contendo HIF1A, tal como a retina ou a cabeça do nervo óptico em uma dose terapêutica, atenu- ando assim um processo de doença associada à angiogênese ocular.

Veículos aceitáveis: Um veículo aceitável refere-se àqueles veí- culos que causam no máximo pouca a nenhuma irritação ocular, proporcio- nam conservação adequada se necessária, e distribuem um ou mais RNAs de interferência da presente invenção em uma dosagem homogênea. Um veículo aceitável para administração de RNA de interferência de modalida- des da presente invenção incluem reagentes de transfecção com base em lipídios catiônicos TranslT®-TKO (Mirus Corporation, Madison, Wl), LIPO- FECTIN®, Lipofectamine, OLIGOFECTAMINE® (Invitrogen, Carlsbad, CA), ou DHARMAFECT® (Dharmacon, Lafayette, CO); policátions tal como polie- tilenoimina; peptídeos catiônicos tais como Tat1 poliarginina, ou Penetratina (peptídeo Antp); ou lipossomos. Lipossomos são formados de lipídios forma- dores de vesícula padrão e um esterol, tal como colesterol, e podem incluir molécula de marcação tal como um anticorpo monoclonal tendo afinidade de ligação para antígenos de superfície de células endoteliais, por exemplo. Ainda, os lipossomos podem ser lipossomos peguilados.

Os RNAs de interferência podem ser distribuídos em solução, em suspensão, ou em dispositivos de distribuição bioerodíveis ou não- bioerodíveis. Os RNA de interferência podem ser distribuídos sozinhos ou como componentes de conjugados covalentes, definidos. Os RNAs de inter- ferência podem ser também complexados com lipídios catiônicos, peptídeos catiônicos, ou polímeros catiônicos; complexados com proteínas, proteínas de fusão, ou domínios de proteína com propriedades de ligação de ácido nucléico (por exemplo, protamina); ou encapsulados em nanopartículas ou lipossomos. A distribuição específica de tecido ou célula pode ser obtida pe- la inclusão de uma fração de marcação tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Para distribuição oftálmica, um-RNA de interferência pode ser combinado com conservantes oftalmologicamente aceitáveis, co-solventes, tensoativos, intensificadores de viscosidade, intensificadores de penetração, tampões, cloreto de sódio, ou água para formar uma suspensão ou solução oftálmica, aquosa, estéril. As formulações em solução podem ser preparadas por dissolução do RNA de interferência em um tampão aquoso, isotônico, fisiologicamente aceitável. Ainda, a solução pode incluir um tensoativo acei- tável para auxiliar na dissolução do inibidor. Agentes de construção de vis- cosidade, tais como hidroximetil celulose, hidroxietil celulose, metilcelulose, polivinilpirrolidona, ou similares podem ser adicionados às composições da presente invenção para aperfeiçoar a retenção do composto.

De modo a preparar a formulação oftálmica em ungüento, estéril, o RNA de interferência é combinado com um conservante em um veículo apropriado, tal como óleo mineral, Ianolina líquida, ou vaselina branca. For- mulações oftálmicas estéreis em gel podem ser preparadas por suspensão do RNA de interferência em uma base hidrofílica preparada da combinação de, por exemplo, CARBOPOL®-940 (BF Goodrich, Charlotte, NC), ou simila- res, de acordo com métodos conhecidos da técnica. VISCOAT® (Alcon Labo- ratories, Inc., Fort Worth, TX), ou similar, de acordo com os métodos conhe- cidos da técnica. VISCOAT® (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX) pode ser usado, por exemplo, para injeção intra-ocular. Outras composições da presente invenção podem conter agentes intensificadores de penetração, tais como Cremephor e TWEEN® 80 (monolaurato de polioxietileno sorbita- nO, Sigma Aldrich, St. Louis, MO), no caso do RNA de interferência ser me- nos penetrante no olho.

Kits: Modalidades da presente invenção proporcionam um kit que inclui reagentes para atenuar a expressão de um mRNA, como aqui ci- tado, em uma célula. O kit contém um siRNA ou um vetor de expressão de shRNA. Para siRNAs e vetores de expressão de shRNA não-virais, o kit con- tém também um reagente de transfecção ou outro veículo de distribuição adequado. Para vetores de expressão de shRNA virais, o kit pode conter o vetor viral e/ou os componentes necessários para produção de vetor viral (por exemplo, uma linhagem de célula de empacotamento bem como um vetor que compreende o modelo de vetor viral e os vetores auxiliares adicio- nais para empacotamento). O kit pode conter também siRNAs de controle positivo e negativo ou vetores de expressão de shRNA (por exemplo, um siRNA de controle de não-direcionamento ou um siRNA que direciona um mRNA não relacionado). O kit pode conter também reagentes para avaliar o "knock-down" do gene-alvo pretendido (por exemplo, iniciadores e sondas para PCR quantitativa para detectar o mRNA-alvo e/ou anticorpos contra a proteína correspondente para Western blots). Alternativamente, o kit pode compreender uma seqüência de siRNA ou uma seqüência de shRNA e as instruções e os materiais necessários para gerar o siRNA por transcrição in vitro ou para construir um vetor de expressão de shRNA.

Uma combinação farmacêutica em forma de kit é ainda propor- cionada que inclui, em combinação embalada, um meio de veículo adaptado para receber um meio de recipiente em confinamento próximo com ele e um primeiro dispositivo que inclui uma composição de RNA de interferência e um veículo aceitável. Tais kits podem incluir ainda, se desejados, um ou mais de vários componentes convencionais de kit farmacêutico, tais como, por exemplo, recipientes com um ou mais veículos farmaceuticamente acei- táveis, recipientes adicionais, etc. como ficará prontamente aparente para aqueles versados na técnica. Instruções impressas, como bulas ou como rótulos, indicando as quantidades dos componentes a serem administradas, diretrizes para administração, e/ou diretrizes para misturar os componentes, podem também ser incluídas no kit.

A capacidade do RNA de interferência para "knock-down" os níveis de expressão de gene-alvo endógeno em, por exemplo, linhagem de célula ocular humana é avaliada in vitro como a seguir. Células humanas transformadas são plaqueadas 24 horas antes da transfecção para o meio de crescimento-padrão (por exemplo, DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal). A transfecção é realizada usando Dharmafect 1 (Dharma- con, Lafayette, CO) de acordo com as instruções do fabricante em concen- trações de RNA de interferência de 0,1nM a 100nM. siRNA de controle de não-direcionamento e siRNA A/C de lâmina (Dharmacon) são usados como controles. O níveis de mRNA-alvo são avaliados por qPCR 24 horas pós- transfecção usando, por exemplo, iniciadores de avanço e reversos TAQ- MAN® e um conjunto de sonda que engloba preferivelmente o sítio-alvo (Ap- plied Biosystems, Foster City, CA). Os níveis de proteína alvo podem ser avaliados aproximadamente 72 h pós-transfecção (tempo real dependente da taxa de renovação da proteína), por exemplo. Técnicas-padrão para iso- lamento de RNA e/ou de proteína de células cultivadas são bem-conhecidas daqueles versados na técnica. Para reduzir a chance de efeitos fora do alvo, não específicos, a concentração mais baixa possível de RNA de interferên- cia deve ser usada, a qual produzirá o nível desejado de "knock-down" em expressão de gene-alvo.

A capacidade dos RNAs de interferência da presente invenção de "knock-down" níveis de expressão de proteína HIF1A é ainda exemplifi- cada no Exemplo 1 como a seguir. Exemplo 1

RNA de Interferência para Silenciar Especificamente H1F1A

O presente estudo examina a capacidade de RNA de interferên- cia de HIF1A de "knock-down" os níveis de expressão endógena de proteína HIF1 -a em células HeLa cultivadas.

A transfecção de células HeLa foi obtida usando-se contrações in vitro padrão (0,1-1 OnM) de siRNAs de HIF1A, siRNA nQ 1 isento de RISC siCONTROL, ou siRNA nQ 2 de não direcionamento siCONTROL (NTC2) e reagente de transfecção nQ 1 DHARMAFECT® (Dharmacon, Lafayette, CO). Todos os siRNAs foram dissolvidos em 1X de tampão de siRNA, uma solu- ção aquosa de KCl a 20mM, HEPES a 6mM (pH 7,5), MgCI2 a 0,2mM. A- mostras de controle incluíram um controle de tampão no qual o volume de siRNA foi substituído com volume igual de 1X de tampão siRNA (-siRNA). Quarenta e oito horas depois da transfecção, as células foram tratadas com 100μΜ de C0CI2 por 4 h para induzir expressão da proteína HIF-loc, e Wes- tern blots foram realizados para avaliar o nível de HIF-1a. Os siRNAs de HIF1A são RNAs de interferência de filamento duplo tendo especificidade para os seguintes alvos: siHIFI A nQ 1 direciona SEQ ID NO:48; siHIFIA n2 3 direciona SEQ ID NO:49; siHIFIA ne 5 direciona SEQ ID N0:50; siHIFIA n9 6 direciona a SEQ ID NO:51. Como mostrado pelos dados da figura, cada um dos siRNAs de HIF1A reduziu a expressão da proteína HIFI-oc significan- temente em 10nM em relação aos siRNAs de controle. Contudo, siHIFIA n9 3 e siHIFIA ne 6 também silenciaram a expressão de proteína HIF1-oc signi- ficantemente em 0,1 nM, indicando que estes siRNAs de HIF1A são particu- larmente eficazes em relação à siHIFIA n5 1 e siHIFIA ns 5.

As referências citadas, até onde elas proporcionam detalhes procedimentais exemplares ou outros suplementares àqueles estabelecidos aqui, são especificamente incorporadas a título de referência.

Aqueles versados na técnica, à luz de presente descrição, apre- ciarão que modificações óbvias das modalidades descritas aqui podem ser efetuadas sem se desviar do escopo e espírito da invenção. Todas as moda- lidades descritas aqui podem ser feitas e executadas sem experimentação indevida à luz da presente exposição. O escopo integral da invenção é esta- belecido na descrição e modalidades equivalentes dela. O relatório descritivo não deve ser interpretado para restringir indevidamente o escopo integral de proteção ao qual a presente invenção tem direto.

Como usado aqui e a menos que indicado de outro modo, o ter- mo "um" tem o significado de "um", "pelo menos um" ou "um ou mais".

Claims

1. Método para atenuar a expressão de mRNA de HIF1A em um paciente, que compreende: administrar ao paciente uma composição que compreende uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a -49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferência compreende: um filamento de nucleotídeo sentido, um filamento de nucleotí- deo anti-sentido, e uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; em que o filamento anti-sentido hibridiza sob condições fisiológi- cas para uma porção de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2 e tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibridização de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2, respectivamente, em que a expressão de mRNA de HIF1A é assim atenuada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o paciente é um ser humano e o ser humano tem angiogênese ocular.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o paciente é um ser humano e o ser humano está em risco de desenvolver angiogênese ocular.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a composi- ção é administrada via tópica, intravítrea, transcleral, periocular, conjuntival, subtenônica, intracameral, subretiniana, subconjuntival, retrobulbar, ou inta- canalicular.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o filamento anti-sentido é desenhado para direcionar um mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 que compreende o nucleotídeo 411, 580, 583, 868, 869, 1099, -1100, 1242, 1302, 1371, 1396, 1559, 1560, 1809, 2085, 2087, 2105, 2138, -2256, 2358, 2422, 2636, 2666, 2743, 2858, 2861, 3135, 3544, 3554, 1943, -1791, 2351, ou 1408.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o filamento anti-sentido é desenhado para direcionar um mRNA correspondente à SEQ ID NO:2 que compreende ou nucleotídeo 2360, 2411, 2420, 2536, 2539, -2545, 2616, 2731, 2734, 3008, ou 3427.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda administrar ao paciente um segundo RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos, e que compreende: um filamento de nucleotídeo sentido, um filamento de nucleotí- deo anti-sentido, e uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; em que o filamento anti-sentido do segundo RNA de interferên- cia hibridiza sob condições fisiológicas para uma segunda porção de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2 e o filamento anti-sentido tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a segunda porção de hibridização de mRNA correspondente à SEQ ID No:1 ou à SEQ ID NO:2, respectivamente.

8. Método para tratar angiogênese ocular em um paciente que necessite do mesmo, que compreende: administrar a um olho do paciente uma composição que com- preende uma quantidade eficaz de RNA de interferência que tem um com- primento de 19 a-49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferência compreende: um filamento de nucleotídeo sentido, um filamento de nucleotí- deo anti-sentido, e uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; em que o filamento anti-sentido hibridiza sob condições fisiológi- cas para uma porção de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2, e tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibridização de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2, respectivamente, em que a angiogênese ocular é assim tratada.

9. Método para atenuar a expressão de mRNA de HIF1A de um paciente, que compreende: administrar ao paciente uma composição que compreende uma quantidade eficaz de RNA de interferência de filamento simples tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente acei- tável, em que o RNA de interferência de filamento simples hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de mRNA correspondente à SEQ IND NO:1 que compreende o nucleotídeo 411, 580, 583, 868, 869, -1099, 1100, 1242, 1302, 1371, 1396, 1559, 1560, 1809, 2085, 2087, 2105, -2138, 2256, 2358, 2422, 2636, 2666, 2743, 2858, 2861, 3135, 3544, 3554, -1943, 1791, 2351, ou 1408, e o RNA de interferência tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibridização de mRNA correspondente à SEQ IDNO.-1, ou em que o RNA de interferência de filamento simples hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de mRNA correspondente à SEQ ID NO:2 que compreende o nucleotídeo 2360, 2411, 2420, 2536, 2539, -2545, 2616, 2731, 2734, 3008, ou 3427 e o RNA de interferência tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibridização de mRNA correspon- dente à SEQ ID NO:2, em que a expressão de mRNA de HIF1A é assim atenuada.

10. Método para atenuar a expressão de um mRNA de HIF1A em um paciente, em que o método compreende: administrar ao paciente uma composição que compreende uma quantidade eficaz de RNA de interferência que tem um comprimento de 19 a -49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferência compreende: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremi- dade 3' de um mRNA correspondente a qualquer uma de SEQ ID NO:3, e SEQ ID Ν0:9 - SEQ ID Ν0:51, em que a expressão do mRNA de HIF1A ocular é assim atenua- da.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o RNA de interferência compreende: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremi- dade 3' de um mRNA correspondente à SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:9 - SEQ ID NO:36.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o RNA de interferência compreende: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremi- dade 3' de um mRNA correspondente à SEQ ID NO:37 - SEQ ID NO:51.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o RNA de interferência compreende uma região de pelo menos 14 nucleotídeos contí- guos tendo pelo menos 85% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 85% de identidade de seqüência com, os 14 penúltimos nucleo- tídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente à seqüência identifi- cada pelo identificador de seqüência.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o RNA de interferência compreende uma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18 nu- cleotídeos contíguos tendo pelo menos 80% de complementaridade de se- qüência para, ou pelo menos 80% identidade de seqüência com, os 15, 16, -17, ou 18 penúltimos nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' de um mRNA que corresponde à seqüência identificada pelo identificador de seqüência.

15. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a compo- sição compreende ainda um segundo RNA de interferência tendo um com- primento de 19 a 49 nucleotídeos e compreendendo uma região de pelo me- nos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementarida- de para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúl- timos nucleotídeos da extremidade 3' de um segundo mRNA correspondente a qualquer uma da SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:9 - SEQ ID NO:51.

16. Método para tratar angiogênese ocular em um paciente que necessite do mesmo, em que o método compreende: administrar a um olho do paciente uma composição que com- preende uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um compri- mento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferência compreende: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremi- dade 3' de um mRNA correspondente a qualquer uma de SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:51, em que a angiogênese ocular é assim tratada.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o RNA de interferência compreende: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremi- dade 3' de um mRNA correspondente à SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:9 - SEQ ID NO:36.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o RNA de interferência compreende: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremi- dade 3' de um mRNA correspondente à SEQ ID NO:37 - SEQ ID NO:51.

19. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o pacien- te tem edema retiniano, isquemia retiniana ou retinopatia diabética.

20. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o filamento de nucleotídeo sentido e o filamento de nucleotídeo anti-sentido são conec- tados por uma alça em grampo de cabelo.

21. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o filamento de nucleotídeo sentido e o filamento de nucleotídeo anti-sentido são conec- tados por uma alça em grampo de cabelo.

22. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o RNA de interferência é um shRNA.

23. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o RNA de interferência é um shRNA.

24. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o RNA de interferência é um siRNA.

25. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o RNA de interferência é um siRNA.

26. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o RNA de interferência é um siRNA.

27. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o RNA de interferência é um miRNA.

28. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a composi- ção é administrada via tópica, intravítrea, transcleral, periocular, conjuntival, subtenônica, intracameraH sub-retiniana, subconjuntival, retrobulbar, ou inta- canalicular.

29. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a compo- sição é administrada via tópica, intravítrea, transcleral, periocular, conjunti- val, subtenônica, intracameral, subretiniana, subconjuntival, retrobulbar, ou intacanalicular.

30. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a composi- ção é administrada via expressão in vivo de um vetor de expressão de mR- NA de interferência.

31. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a compo- sição é administrada via expressão in vivo de um vetor de expressão de mRNA de interferência.

32. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o paciente tem edema retiniano, isquemia retiniana ou retinopatia diabética.

33. Método para tratar angiogênese ocular em um paciente que necessite deste, que compreende: administrar ao paciente uma composição que compreende uma molécula de siRNA de filamento dupla que infra-regula a expressão de um gene de HIF1A via interferência de RNA. em que: cado filamento da molécula de siRNA é independentemente cer- ca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimento; e um filamento da molécula de siRNA compreende uma seqüência de nucleotídeos tendo complementaridade substancial para um mRNA cor- respondente ao gene de HIF1A, de modo que a molécula de siRNA direcio- na a clivagem dõ mRNA via interferência de RNA.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que a compo- sição é administrada via aerosol, bucal, dérmica, intradérmica, inalação, in- tramuscular, intranasal, intra-ocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperito- neal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, emplastro, subcutânea, sublingual, tópica, ou transdérmica.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o RNA de interferência é administrado via expressão in vivo de um vetor de expressão capaz de expressar o RNA de interferência.

36. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o RNA de interferência é um miRNA.

37. Método de acordo com a reivindicação 33, em que cado fi- lamento da molécula de siRNA é independentemente cerca de 19 nucleotí- deos a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento.

38. Método de acordo com a reivindicação 33, em que cado fi- lamento da molécula de siRNA é independentemente cerca de 19 nucleotí- deos a cerca de 21 nucleotídeos de comprimento.

39. Composição que compreende um RNA de interferência que tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e tendo uma seqüência de nucleotídeos que corresponde a qualquer uma de SEQ ID NO:3, e SEQ ID Ν0:9 - SEQ ID Ν0:51, ou um complemento destas, e um veículo farmaceu- ticamente aceitável.

40. Composição de acordo com a reivindicação 39, em que o RNA de interferência é um shRNA.

41. Composição de acordo com a reivindicação 39, em que o RNA de interferência é um siRNA.

42. Composição de acordo com a reivindicação 39, em que o RNA de interferência é um miRNA.

43. Composição que compreende uma molécula de siRNA de filamento dupla que infra-regula a expressão de um gene de HIF1A via inter- ferência de RNA, em que: cado filamento da molécula de siRNA é independentemente de cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimento; e um filamento da molécula de siRNA compreende uma seqüência de nucleotídeos que tem substancial complementaridade para um mRNA que corresponde ao gene de HIF1A, de modo que a molécula de siRNA di- reciona a clivagem do mRNA via interferência de RNA.

44. Composição de acordo com a reivindicação 43, em que cado filamento da molécula de siRNA é independentemente cerca de 19 nucleotí- deos a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento.

45. Composição de acordo com a reivindicação 43, em que cado filamento da molécula de siRNA é independentemente cerca de 19 nucleotí- deos a cerca de 21 nucleotídeos de comprimento.

46. Uso na preparação de uma composição para atenuar a ex- pressão de mRNA de HIF1A de um paciente, de uma quantidade eficaz de RNA de interferência que tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferência compreende: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremi- dade 3' de um mRNA correspondente à qualquer uma de SEQ ID NO:3, e SEQ ID Ν0:9 - SEQ ID Ν0:51.

47. Uso na preparação de um medicamento para o tratamento de angiogênese ocular em um paciente, de uma composição que compreen- de: uma quantidade eficaz de RNA de interferência que tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente acei- tável, em que o RNA de interferência compreende: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremi- dade 3' de um mRNA correspondente à qualquer uma de SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:9 - SEQ ID NO:51.

48. Uso de acordo com a reivindicação 46 ou 47, em que o RNA de interferência compreende uma região de pelo menos 14 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 85% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 85% de identidade de seqüência com, os 14 penúltimos nu- cleotídeos da extremidade 3' de um mRNA que corresponde à seqüência identificada pelo identificador de seqüência.

49. Uso de acordo com a reivindicação 46 ou 47, em que o RNA de interferência compreende uma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 80% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 80% identidade de seqüência com, os 15, -16, 17, ou 18 penúltimos nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' de um mRNA que corresponde à seqüência identificada pelo identificador de seqüência.

50. Uso de acordo com a reivindicação 46 ou 47, em que a com- posição que compreende ainda um segundo RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e compreendendo uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementari- dade para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 pe- núltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um segundo mRNA correspon- dente a qualquer uma da SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:9 - SEQ ID NO:51.

51. Uso na preparação de um medicamento para o tratamento de angiogênese ocular em um paciente, de uma composição que compreen- de: uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um com- primento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferência compreende: um filamento de nucleotídeo sentido, um filamento de nucleotí- deo anti-sentido, e uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; em que o filamento anti-sentido hibridiza sob condições fisiológi- cas para uma porção de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 ou à SEQ ID NO:2 e tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibridização de mRNA correspondente à SEQ ID No:1 ou SEQ ID NO:2, respectivamente.

52. Uso na preparação de uma composição para atenuar a ex- pressão de um mRNA de HIF1A de um paciente, de uma quantidade eficaz de RNA de interferência que tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferência de filamento simples hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1 que compreende o nucleotídeo 411, 580, 583, 868, 869, 1099, -1100, 1242, 1302, 1371, 1396, 1559, 1560, 1809, 2085, 2087, 2105, 2138, -2256, 2358, 2422, 2636, 2666, 2743, 2858, 2861, 3135, 3544, 3554, 1943, -1791, 2351, ou 1408, e o RNA de interferência tem uma região de comple- mentaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleo- tídeos com a porção de hibridização de mRNA correspondente à SEQ ID NO:1, em que o RNA de interferência de filamento simples hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de mRNA que corresponde à SEQ ID NO:2 que compreende o nucleotídeo 2360, 2411, 2420, 2536, 2539, -2545, 2616, 2731, 2734, 3008, ou 3427 e o RNA de interferência tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibridização de mRNA correspon- dente à SEQ ID NO:2.

53. Uso de acordo com a reivindicação 51, em que o filamento de nucleotídeo sentido e o filamento de nucleotídeo anti-sentido são conec- tadas por uma alça em grampo de cabelo.

54. Uso de acordo com a reivindicação 46, 47, ou 51, em que o RNA de interferência é um shRNA.

55. Uso de acordo com a reivindicação 46, 47, ou 51, em que o RNA de interferência é um siRNA.

56. Uso de acordo com a reivindicação 46, 47 ou 51, em que o RNA de interferência é um miRNA.

57. Uso de acordo com a reivindicação 47 ou 51, em que a com- posição é preparada para administração via tópica, intravítrea, transcleral, periocular, conjuntival, subtenônica, intracameral, subretiniana, subconjunti- vai, retrobulbar, ou intracanalicular.

58. Uso de acordo com a reivindicação 47 ou 51 em que a com- posição compreende um vetor de expressão capaz de expressar o RNA de interferência.

59. Uso de acordo com a reivindicação 47 ou 51, em que o me- dicamento é para o tratamento de angiogênese ocular.

60. Uso na preparação de um medicamento para o tratamento de angiogênese ocular em um paciente, de uma composição que compreen- de: uma molécula de siRNA de filamento dupla que infra-regula a expressão de um gene de HIF1A via interferência de RNA, em que: cado filamento da molécula de siRNA é independentemente cer- ca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimento; e um filamento da molécula de siRNA compreende uma seqüência de nucleotídeos tendo complementaridade substancial para um mRNA cor- respondente ao gene de HIF1A, respectivamente, de modo que a molécula de siRNA direciona a clivagem do mRNA via RNA de interferência.

61. Uso de acordo com a reivindicação 60, em que a composi- ção é preparada para administração via aerossol, bucal, dérmica, intradérmi- ca, inalação, intramuscular, intranasal, intra-ocular, intrapulmonar, intraveno- sa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, emplastro, subcutâ- nea, sublingual, tópica, ou transdérmica.

62. Uso de acordo com a reivindicação 60, em que a composi- ção compreende um vetor de expressão capaz de expressar o RNA de inter- ferência.

63. Uso de acordo com a reivindicação 60, em que o RNA de interferência é um miRNA.