JP2009522304A - 眼の障害の治療のためのＨＩＦ１ＡのＲＮＡｉ媒介抑制 - Google Patents

Abstract

眼に血管形成のある患者の治療、特に網膜浮腫、糖尿病性網膜症、網膜虚血関連続発症、後眼部血管新生（ＰＳＮＶ）、および血管新生緑内障の治療、ならびにそのような状態を発症する危険性のある患者の治療を目的として、ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡ発現を抑制するためにＲＮＡ干渉が提供される。本発明は、被験体のＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの発現を弱める方法を提供し、この方法は、長さが１９〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を前記被験体へ投与することを含む。

Description

（技術分野）
本発明は、ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡがコードするタンパク質である、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）の発現を眼血管形成において抑制するための干渉性ＲＮＡ組成物の分野に関し、該血管形成が、ＨＩＦ−１αの転写因子活性から生じ、例えば、眼血管新生、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、網膜虚血関連続発症、後眼部血管新生および血管新生緑内障を直接的または間接的に起こす細胞変化を含む。

（発明の背景）
糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、血管内側を覆う細胞、即ち網膜微小血管内皮の変化により糖尿病で発症する眼疾患である。糖尿病の間に、高血糖症はいくつもの方法で障害を起こし得る。例えば、グルコースまたはグルコース代謝産物は、タンパク質のアミノ基に結合し、組織障害を起こす。その上、過剰のグルコースがポリオール経路に入り、ソルビトールの蓄積を起こす。ソルビトールは網膜細胞により代謝できず、高い細胞内浸透圧、細胞内浮腫、拡散障害、組織低酸素症、毛細血管細胞障害および毛細血管弱化の一因となり得る。糖尿病性網膜症は、毛細血管基底膜の肥厚を伴い、そのために、網膜毛細血管における主要な血管周囲細胞型の周皮細胞が、内皮細胞と接触することを妨げられる。糖尿病性網膜症の間に、周皮細胞および内皮細胞の細胞死がアポトーシス機構を介して起こり、周皮細胞の減少が毛細血管の透過性を恐らく高め、血管網膜関門の破壊および血流の調節不全を起こす。弱化した毛細血管は、動脈瘤の形成およびさらなる漏出を起こす。高血糖症のこうした作用は、網膜内の神経機能にも障害を与え得る。ＤＲは、網膜微小動脈瘤、出血、滲出液、および増殖性網膜炎、即ち網膜の内表面上での新血管および結合組織の大規模増殖と関係している。糖尿病性網膜症は、微小動脈瘤、網膜内点状出血、黄蝋性滲出液、綿状白斑および黄斑浮腫を次第に特徴とする、バックグランド型の場合がある。これは、非増殖性糖尿病性網膜症と称する糖尿病性網膜症の初期段階である。

糖尿病誘発微小血管病状が進行するにつれ、網膜毛細血管は最終的に閉塞し、網膜内に虚血性低酸素症の多発域を生じる。非浸潤組織における低酸素状態は、ＨＩＦ−１α量の増加をもたらす。ＨＩＦ−１媒介性の遺伝子発現における結果として生じる変化は、既存の血管からの新血管の異常成長（血管形成）を刺激できる増殖因子の産生を誘発する。病的なこうした新血管は、硝子体中に成長し、新血管が脆く、眼内に血液を漏出しがちなため、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）と称する状態の失明を起こす恐れがある。増殖型ＤＲは、網膜および視神経円板の硝子体中に突出し得る新血管形成、線維組織の増殖、硝子体出血、ならびに網膜剥離を特徴とする。

新血管形成は、結合組織および新血管の小柱網上での成長により眼圧が増加する、血管新生緑内障と称する型の緑内障でも起こる。血管新生緑内障は、眼房角における新血管形成を原因とする一種の続発性緑内障である。

後眼部血管新生（ＰＳＮＶ）は、先進国における後天性失明の二大原因である、滲出性の加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）およびＰＤＲの原因となる失明誘発性の病状である。最近まで、滲出性ＡＭＤ中に起こるＰＳＮＶに対する唯一の認可治療は、レーザー光凝固またはＶＩＳＵＤＹＮＥ^ＴＭを用いる光線力学療法であった。いずれの療法でも患部血管系が閉塞し、その結果、網膜に対する恒久的なレーザー誘発損傷を起こし、新血管形成の根本原因には対処していない。同区域から新血管形成を再発することが一般的である。ＰＤＲの患者にとっては、硝子体切除および網膜前膜除去を用いる外科的介入が、より多くの新血管の産生を予防するための広範囲網膜光凝固と称するレーザー療法と並んで、現在利用できる唯一の選択肢である。

現在の医薬研究は、ＶＥＧＦなどの強力な血管新生因子の作用を抑制することに専心してきた。最近では、抗ＶＥＧＦ抗体フラグメントであるＬＵＣＥＮＴＩＳ^ＴＭの硝子体内注入が、ＡＭＤの治療に対して認可された。この抗体フラグメントは、新血管の形成を抑制するために、ＶＥＧＦに結合し、それを阻害するように設計された。Ｌｕｃｅｎｔｉｓは、糖尿病性黄斑浮腫の治療のためにも臨床試験中である。他の手法には、ＶＥＧＦまたはその受容体を標的とした短分子干渉性ＲＮＡの使用が含まれる。

従来の低分子阻害剤を用いたＨＩＦ−１転写因子と酸素感受性プロモーターにおける低酸素応答エレメントとの相互作用の中断は、非常に困難であるようである。ＶＥＧＦ同様、ＨＩＦ１Ａは、古典的な意味において「薬物になり得る（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」とは考えられていない。さらに、ＨＩＦ−１の個々の下流のエフェクター（例えば、ＶＥＧＦまたはＲＴＰ８０１）のサイレンシングは、血管新生を部分的にブロックするのみであり得る。

本発明は、上記問題に対処し、そして、血管形成および血管透過性（浮腫）に関与する下流の遺伝子についての転写制御遺伝子である、ＨＩＦ１Ａを標的とする干渉性ＲＮＡを提供する。

（発明の要旨）
本発明は、ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの発現を沈黙させ、従って、血管形成前および血管形成中の眼の細胞活性の低下をなし遂げることによって、ＨＩＦ−１誘導遺伝子の転写活性を低下させ、そして、眼の血管形成を処置する干渉性ＲＮＡに関する。

本明細書で使用する場合の用語「眼血管形成」は、眼血管形成前の状態および眼血管形成時の状態を包含し、ＨＩＦ１誘導性遺伝子の発現から生じ、例えば、眼血管形成、眼血管新生、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、網膜虚血関連続発症、ＰＳＮＶ、血管透過性および血管新生緑内障を直接的または間接的に起こす細胞変化を含む。本発明の干渉性ＲＮＡは、例えば、眼血管形成、眼血管新生、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、網膜虚血関連続発症、後眼部血管新生（ＰＳＮＶ）、および血管新生緑内障の患者、またはそのような状態を発症する危険性のある患者の治療に有用である。

本発明の一実施形態は、被験体におけるＨＩＦ１Ａ標的ｍＲＮＡの発現を弱める方法を提供する。この方法は、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡなどの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物をその被験体へ投与することを含む。一実施形態では、投与は、ヒトにおける眼血管形成の標的の発現を弱めるために、その被験体の眼に対してなされる。

本発明の一実施形態では、該干渉性ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む。さらに、該アンチセンス鎖は、ＨＩＦ１Ａ改変体１をコードするセンスｃＤＮＡ配列である配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１５３０）またはＨＩＦ１Ａ改変体２をコードするセンスｃＤＮＡ配列である配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１８１０５４）に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、それぞれ配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの該ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。このような組成物の投与は、該被験体のＨＩＦ１Ａ標的の発現を弱める。

本発明の一実施形態では、干渉性ＲＮＡは、４１１、５８０、５８３、８６８、８６９、１０９９、１１００、１２４２、１３０２、１３７１、１３９６、１５５９、１５６０、１８０９、２０８５、２０８７、２１０５、２１３８、２２５６、２３５８、２４２２、２６３６、２６６６、２７４３、２８５８、２８６１、３１３５、３５４４、３５５４、１９４３、１７９１、２３５１または１４０８のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される。

本発明の別の実施形態では、干渉性ＲＮＡは、２３６０、２４１１、２４２０、２５３６、２５３９、２５４５、２６１６、２７３１、２７３４、３００８または３４２７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される。

本発明は、第１の干渉性ＲＮＡに加えて、第２の干渉性ＲＮＡを被験体にさらに投与する方法を提供する。この方法は、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む第２の干渉性ＲＮＡをその被験体に投与することを含み、第２の干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの第２の部分に生理条件下でハイブリッド形成し、該アンチセンス鎖は、それぞれ配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの該第２のハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。さらに、第３、第４または第５などの干渉性ＲＮＡを同様に投与してもよい。

本発明の別の実施形態は、被験体におけるＨＩＦ１Ａの発現を弱める方法であって、この方法は、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの１本鎖干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物をその被験体へ投与することを含む。

ＨＩＦ１Ａの発現を弱めるために、該１本鎖干渉性ＲＮＡは、４１１、５８０、５８３、８６８、８６９、１０９９、１１００、１２４２、１３０２、１３７１、１３９６、１５５９、１５６０、１８０９、２０８５、２０８７、２１０５、２１３８、２２５６、２３５８、２４２２、２６３６、２６６６、２７４３、２８５８、２８６１、３１３５、３５４４、３５５４、１９４３、１７９１、２３５１または１４０８のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、該干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの該ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。別の実施形態では、ＨＩＦ１Ａの発現を弱めるために、該１本鎖干渉性ＲＮＡは、２３６０、２４１１、２４２０、２５３６、２５３９、２５４５、２６１６、２７３１、２７３４、３００８または３４２７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成する。ＨＩＦ１Ａの発現は、それにより弱められる。

本発明のさらなる実施形態は、眼血管形成の治療をその治療が必要な被験体において行う方法である。この方法は、センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物をその被験体の眼に投与することを含む。該アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、それぞれ配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの該ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。眼血管形成は、それにより治療される。

本発明の別の実施形態は、眼血管形成の治療をその治療が必要な被験体において行う方法であって、この方法は、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物をその被験体の眼に投与することを含み、該干渉性ＲＮＡが、配列番号３および配列番号９〜配列番号５１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含み、眼血管形成がそれにより治療される。

本発明の別の実施形態は、被験体におけるＨＩＦ１Ａ標的ｍＲＮＡの発現を弱める方法であって、この方法は、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物をその被験体へ投与することを含み、該干渉性ＲＮＡが、以下のような配列番号３および配列番号９〜配列番号５１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む。

本発明のさらなる実施形態では、連続ヌクレオチドの該領域は、当該配列識別子の配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチド領域である。本発明のさらに別の実施形態では、連続ヌクレオチドの該領域は、当該配列識別子で識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からのそれぞれ１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチド領域である。

本発明のさらなる実施形態は、眼血管形成の治療をその治療が必要な被験体において行う方法であって、この方法は、ＲＮＡ干渉を介してＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現をダウンレギュレートする、２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物をその被験体へ投与することを含み、該ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、該ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、ＨＩＦ１Ａ遺伝子に対応するｍＲＮＡに対してそれぞれ実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、該ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してｍＲＮＡの切断を誘導する。

１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号５１のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補体を有する干渉性ＲＮＡと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物は、本発明の一実施形態である。一実施形態では、該干渉性ＲＮＡが単離されている。「単離されている」という用語は、該干渉性ＲＮＡがその全自然環境から解放されていることを意味する。

本発明の別の実施形態は、ＲＮＡ干渉を介してＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現をダウンレギュレートする、２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物であって、この組成物において、該ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、該ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、ＨＩＦ１Ａ遺伝子に対応するｍＲＮＡに対してそれぞれ実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、該ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してｍＲＮＡの切断を誘導する。

ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの発現を弱める医薬の調製における本明細書記載の実施形態のいずれかの使用も、本発明の一実施形態である。

（発明の詳細な説明）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して遺伝子発現を沈黙させる方法である。理論に拘ることは望まないが、ＲＮＡｉは、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）による、より長いｄｓＲＮＡの短分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）への切断から始まる。ｓｉＲＮＡは、長さが普通約１９ヌクレオチド〜２８ヌクレオチド、または２０ヌクレオチド〜２５ヌクレオチド、または２１ヌクレオチド〜２２ヌクレオチドであり、ヌクレオチド２個の３’オーバーハングならびに５’リン酸末端および３’ヒドロキシル末端をしばしば含有するｄｓＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているリボ核タンパク質複合体中に組み込まれる。ＲＩＳＣは、このｓｉＲＮＡ鎖を使用して、組み込まれたそのｓｉＲＮＡ鎖に少なくとも部分的に相補的なｍＲＮＡ分子を特定し、次いでこうした標的ｍＲＮＡを切断するか、またはその翻訳を抑制する。したがって、ＲＩＳＣ中に組み込まれるｓｉＲＮＡ鎖は、ガイド鎖またはアンチセンス鎖の名で知られている。パッセンジャー鎖またはセンス鎖の名で知られている他方のｓｉＲＮＡ鎖は、ｓｉＲＮＡから除かれ、標的ｍＲＮＡに少なくとも部分的に相同的である。当業者であれば、原理的には、ｓｉＲＮＡのいずれの鎖もＲＩＳＣ中に組み込まれ、ガイド鎖として機能できることを認識されよう。しかし、ｓｉＲＮＡの設計（例えば、アンチセンス鎖の５’末端におけるｓｉＲＮＡ二重鎖安定性の減少）により、アンチセンス鎖のＲＩＳＣ中への組込みを促進し得る。

ガイド鎖に少なくとも部分的に相補的な配列を有するｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介切断は、そのｍＲＮＡおよびこのｍＲＮＡがコードする対応タンパク質の定常状態量を減少させる。あるいは、ＲＩＳＣは、標的ｍＲＮＡを切断せずに、翻訳抑制を介して対応タンパク質の発現を減少させることもできる。他のＲＮＡ分子およびＲＮＡ様分子も、ＲＩＳＣと相互作用し、遺伝子発現を沈黙させ得る。ＲＩＳＣと相互作用できる他のＲＮＡ分子の例には、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、１本鎖ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびダイサー−基質２７マーの二重鎖が含まれる。本明細書で使用する場合の用語「ｓｉＲＮＡ」とは、別途注記しない限り２本鎖干渉性ＲＮＡを指す。ＲＩＳＣと相互作用できるＲＮＡ様分子の例には、１個もしくは複数の化学修飾ヌクレオチド、１個もしくは複数のデオキシリボヌクレオチド、および／または１個もしくは複数の非ホスホジエステル結合を含有するＲＮＡ分子が含まれる。本考察のために、ＲＩＳＣと相互作用し、遺伝子発現のＲＩＳＣ媒介変化に関与できるすべてのＲＮＡまたはＲＮＡ様分子を、「干渉性ＲＮＡ」と呼称することとする。したがって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびダイサー−基質２７マーの二重鎖は、「干渉性ＲＮＡ」のサブセットである。

本発明の実施形態の干渉性ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの切断のために触媒的に作用するようである、即ち、干渉性ＲＮＡは、化学量論的量未満で標的ｍＲＮＡの阻害を起こし得る。アンチセンス療法と比較して、有意に少ない干渉性ＲＮＡで、このような切断条件下で治療効果を得るのに十分である。

本発明は、低酸素誘導因子１Ａ（ＨＩＦ１Ａ）の発現を抑制し、従って、酸素圧の低下に応答して誘導される多数の遺伝子の転写を干渉するための干渉性ＲＮＡの使用に関連する。本発明によれば、内因性に提供されるか、または、外因性に発現される本明細書中に記載の干渉性ＲＮＡは、ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡを沈黙させることにおいて特に効果的である。

本明細書で引用した核酸配列は、別途指示しない限り、５’から３’の方向に書かれる。本明細書で使用する場合の用語「核酸」とは、ＤＮＡ中（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）もしくはＲＮＡ中（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」）に存在するプリンもしくはピリミジン塩基を含む、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはその改変形を指す。本明細書に示す干渉性ＲＮＡは、「Ｔ」塩基が天然にはＲＮＡ中に存在しないとしても、特に３’末端に「Ｔ」塩基を含んでもよい。「核酸」は、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含し、１本鎖分子または２本鎖分子を指すことができる。２本鎖分子は、Ａ塩基とＴ塩基、Ｃ塩基とＧ塩基、およびＡ塩基とＵ塩基とのワトソン−クリック塩基対形成により形成される。２本鎖分子の各鎖は、相互に部分的、実質的または完全な相補性を有してもよく、塩基配列の相補性の性質および程度にその結合強度が依存する、二重鎖ハイブリッドを形成することになろう。

ｍＲＮＡ配列は、対応するＤＮＡ配列の配列から容易に導かれる。例えば、配列番号１は、ＨＩＦ１Ａ改変体１のｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する。このｍＲＮＡ配列は、「Ｔ」塩基を「Ｕ」塩基で置き換えたＤＮＡセンス鎖配列と同一である。したがって、ＨＩＦ１Ａ改変体１のｍＲＮＡ配列は配列番号１から分かり、ＨＩＦ１Ａ改変体２のｍＲＮＡ配列は配列番号２から分かる。

低酸素誘導因子−１ ｍＲＮＡ（ＨＩＦ１Ａ改変体１および改変体２）：低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）は、酸素圧の低下に応答する、多数の遺伝子における発現の変化を担う転写因子である。ＨＩＦ−１は、それぞれ、ＨＩＦ１ＡおよびＡＲＮＴによりコードされるαサブユニットおよびβサブユニットから構成されるヘテロ二量体である。ＶＥＧＦおよびＲＴＰ８０１（ＲＥＤＤ１）を含む少なくとも２つのＨＩＦ−１誘導遺伝子が、網膜における病理的な血管新生に関与している。従って、このような遺伝子の転写および遺伝子産物の活性を弱めるために、本明細書においてＨＩＦ１Ａの発現抑制が提供される。

ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにあるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎＢａｎｋデータベースは、「配列表」に配列番号１で示したＨＩＦ１Ａ改変体１のＤＮＡ配列を受入番号ＮＭ＿００１５３０として示している。配列番号１は、ＨＩＦ１Ａ改変体１をコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を示す（「Ｕ」塩基の代わりに「Ｔ」塩基であることを別として）。ＨＩＦ１Ａ改変体１のコード配列は２８５番〜２７６５番のヌクレオチドである。

前記のＨＩＦ１Ａ改変体１ ｍＲＮＡ配列の同等配列は、スプライシング型、対立遺伝子型、アイソザイムまたはその同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）である。同族体とは、別の哺乳動物種由来で、配列番号１に相同のＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡ（オーソロガス体）である。

ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにあるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎＢａｎｋデータベースは、「配列表」に配列番号１で示したＨＩＦ１Ａ改変体２のＤＮＡ配列を受入番号ＮＭ＿１８１０５４として示している。配列番号１は、ＨＩＦ１Ａ改変体２をコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を示す（「Ｕ」塩基の代わりに「Ｔ」塩基であることを別として）。ＨＩＦ１Ａ改変体２のコード配列は２８５番〜２４９２番のヌクレオチドである。

前記のＨＩＦ１Ａ改変体２ ｍＲＮＡ配列の同等配列は、スプライシング型、対立遺伝子型、アイソザイムまたはその同族体である。同族体とは、別の哺乳動物種由来で、配列番号２に相同のＨＩＦ１Ａ改変体２ ｍＲＮＡ（オーソロガス体）である。

ｍＲＮＡ発現の弱化：本明細書で使用する場合の語句「ｍＲＮＡ発現の弱化」とは、ある量の干渉性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）を投与または発現することにより、ｍＲＮＡ切断または翻訳の直接抑制のいずれかを介して、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を低減することを意味する。標的ｍＲＮＡまたは対応タンパク質の発現の低減は、通常「ノックダウン」と称し、非標的指向性コントロールＲＮＡ（例えば、非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡ）の投与または発現後の存在量に比して報告されている。５０％以上１００％以下の発現量のノックダウンが、本発明における実施形態で想定されている。しかし、本発明の目的のためにこのようなノックダウン量を実現することは、必要ではない。一実施形態では、ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡを標的とする単一の干渉性ＲＮＡを投与することにより、ＨＩＦ１Ａの産生量を低下させる。他の実施形態では、ＨＩＦ１Ａ標的を標的とする２種以上の干渉性ＲＮＡを投与することにより、ＨＩＦ１Ａの発現を低下させる。さらに他の実施形態では、ＨＩＦ１Ａ改変体１を標的とする第１の干渉性ＲＮＡとＨＩＦ１Ａ改変体２を標的とする第２の干渉性ＲＮＡとを投与することにより、ＨＩＦ１Ａの発現を低下させる。

ノックダウンは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）の増幅を用いたｍＲＮＡ量の測定、またはウェスタンブロットもしくは酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるタンパク質量の測定により、通常評価される。タンパク質量の分析により、ｍＲＮＡ切断、翻訳抑制双方の評価がなされる。ノックダウンを測定するさらなる技法には、ＲＮＡ溶液ハイブリッド形成、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリッド形成、マイクロアレイを用いる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、放射免疫アッセイおよび蛍光活性化細胞分析が含まれる。

本明細書で言及した標的の阻害は、例えば、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、網膜虚血または後眼部血管新生（ＰＳＮＶ）の改善などの眼血管形成の改善を観察することにより、ヒトまたは哺乳動物においても推測される。

干渉性ＲＮＡ：本発明の一実施形態では、干渉性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、該センスおよびアンチセンス鎖は、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む。本発明のさらなる実施形態では、干渉性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、それぞれについて、該アンチセンス鎖は、ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの標的配列に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、該センス鎖は、それぞれＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの標的配列に対して、少なくともほぼ完全に連続して同一の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む。本発明のさらなる実施形態では、該干渉性ＲＮＡは、連続ヌクレオチドが少なくとも１３個、１４個、１５個、１６個、１７個または１８個の領域であって、あるｍＲＮＡ内の対応標的配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からのそれぞれ１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、配列相補性比率（％）を有するか、または配列同一性比率（％）を有する該領域を含む。

該干渉性ＲＮＡの各鎖の長さは、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドを含み、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチドまたは４９ヌクレオチドの長さを含んでもよい。

ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、該アンチセンス鎖がＲＩＳＣ中に組み込まれ、従って、該ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的な標的ｍＲＮＡを、切断または翻訳抑制のためにＲＩＳＣが特定できるので、ｓｉＲＮＡの活性なガイド剤である。

本発明の実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列内の干渉性ＲＮＡ標的配列（例えばｓｉＲＮＡ標的配列）は、利用可能な設計ツールを用いて選択される。次いで、ＨＩＦ１Ａの標的配列に対応する干渉性ＲＮＡを、該標的配列を発現する細胞のトランスフェクションで試験し、その後、前記の通りノックダウンの評価を行う。

ｓｉＲＮＡ用に標的配列を選択する技法は、ロックフェラー大学のウェブサイト上で入手できるＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら、「Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ」、２００４年５月６日改訂；ＡｍｂｉｏｎのウェブサイトにあるＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃５０６、「ｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ」、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．；および例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＧｅｎｓｃｒｉｐｔまたはＰｒｏｌｉｇｏのウェブサイトにある他のウェブ準拠設計ツールによって提供されている。最初のサーチパラメーターには、３５％と５５％との間のＧ／Ｃ含量および１９ヌクレオチドと２７ヌクレオチドとの間のｓｉＲＮＡ鎖長を含み得る。標的配列は、ｍＲＮＡのコード領域または５’もしくは３’非翻訳領域中に位置してもよい。

ＨＩＦ１Ａ改変体１およびＨＩＦ１Ａ改変体２に共通する１９ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列の一実施形態は、配列番号１の４１１番〜４２９番のヌクレオチドに次のように存在する。

配列番号３の対応ｍＲＮＡ配列を標的とし、２１ヌクレオチド鎖およびヌクレオチド２個の３’オーバーハングを有する本発明のｓｉＲＮＡは、次の通りである。

各「Ｎ」残基は、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｔ）または修飾ヌクレオチドでもよい。その３’末端は、個数１、２、３、４、５および６を含むいくつかの「Ｎ」残基を有し得る。各鎖上の「Ｎ」残基は、同一残基でも（例えば、ＵＵ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧもしくはＴＴ）、または異なってもよい（例えば、ＡＣ、ＡＧ、ＡＵ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＵ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＵ、ＵＡ、ＵＣもしくはＵＧ）。３’オーバーハングは同じでもよく、異なってもよい。一実施形態では、両鎖は３’ＵＵオーバーハングを有する。

配列番号３の対応ｍＲＮＡ配列を標的とし、２１ヌクレオチド鎖および各鎖上に３’ＵＵオーバーハングを有する本発明のｓｉＲＮＡは、次の通りである。

該干渉性ＲＮＡは、ヌクレオチドの５’オーバーハングを有してもよく、または平滑末端を有してもよい。配列番号２の対応ｍＲＮＡ配列を標的とし、１９ヌクレオチド鎖および平滑末端を有する本発明のｓｉＲＮＡは、次の通りである。

２本鎖干渉性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）の鎖同士は、連結してヘアピン即ちステム−ループ構造（例えばｓｈＲＮＡ）を形成してもよい。配列番号２の対応ｍＲＮＡ配列を標的とし、１９ｂｐ２本鎖ステム領域および３’ＵＵオーバーハングを有する本発明のｓｈＲＮＡは、次の通りである。

Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、または当業者に公知の修飾形である。ループ中のヌクレオチドＮの個数は、３以上２３以下、もしくは５以上１５以下、もしくは７以上１３以下、もしくは４以上９以下、もしくは９以上１１以下であるか、またはヌクレオチドＮの個数は９である。ループ中のヌクレオチドの一部は、ループ中の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。このループの形成に使用できるオリゴヌクレオチドの例には、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ら（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６巻、５５０頁）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．ら（２００２年）ＲＮＡ、８巻、１４５４頁）が挙げられる。生成する単鎖オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ機構部と相互作用できる２本鎖領域を含むステム−ループ即ちヘアピン構造を形成することは、当業者により認識されよう。

前記に特定したｓｉＲＮＡ標的配列は、３’末端を伸長することによりダイサー−基質２７マーの二重鎖の設計を促進し得る。ＨＩＦ１Ａ ＤＮＡ配列（配列番号１）中に特定した１９ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列（配列番号３）をヌクレオチド６個伸長すると、配列番号１の４１１番〜４３５番のヌクレオチドに存在する２５ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列が次の通り得られる。

配列番号５４の対応ｍＲＮＡ配列を標的とする本発明のダイサー−基質２７マーの二重鎖は、次の通りである。

センス鎖の３’末端にあるヌクレオチド２個（即ち、配列番号５５のＧＡヌクレオチド）は、プロセシングを促進するためにデオキシヌクレオチドでもよい。ここに示すような１９ヌクレオチド〜２１ヌクレオチドの標的配列からのダイサー−基質２７マーの二重鎖の設計は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のウェブサイト、およびＫｉｍ，Ｄ．−Ｈ．ら、（２００５年２月）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３巻、２号、２２２〜２２６頁によりさらに考察されている。

化学合成により干渉性ＲＮＡを作製する際、一方または両方の鎖（存在する場合）の５’末端にあるヌクレオチドの５’位でリン酸化すると、結合型ＲＩＳＣ複合体のｓｉＲＮＡとしての効果および特異性を増強できるが、リン酸化は細胞内で起こり得るので必要ではない。

表１は、上記のようにして本発明のｓｉＲＮＡがそれから設計される、配列番号１および配列番号２のＨＩＦ１Ａ改変体１および改変体２のＤＮＡ標的配列の例を列挙している。ＨＩＦ１Ａは、上記の通り低酸素誘導因子１αをコードする。

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上記の例で言及したように、当業者は、表１に示した標的配列情報を使用して、配列番号１または配列番号２における配列位置を参照し、それぞれ配列番号１または配列番号２に相補的またはほぼ相補的なヌクレオチドを付加または削除することにより、表１に示した配列より長いか短い長さを有する干渉性ＲＮＡを設計することができる。

ｓｉＲＮＡおよび他種の干渉性ＲＮＡにより導かれる標的ＲＮＡ切断反応は、非常に配列特異的である。一般に、標的ｍＲＮＡの一部分と配列が同一のセンスヌクレオチド鎖、および標的ｍＲＮＡの一部分に厳密に相補的なアンチセンスヌクレオチド鎖を含有するｓｉＲＮＡは、本明細書に言及するｍＲＮＡ阻害のためのｓｉＲＮＡの具体化である。しかし、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖と標的ｍＲＮＡとの間、またはアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖とセンスｓｉＲＮＡ鎖との間の１００％配列相補性は、本発明の実施に必要ではない。したがって、例えば、本発明は、遺伝子変異、系統多型または進化的分岐により予想し得る配列変異を受け容れる。

本発明の一実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡと少なくとも１９ヌクレオチドのほぼ完全な連続した相補性を有している。本明細書で使用する場合の「ほぼ完全な」とは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分と「実質的に相補的」であり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖が同部分と「実質的に同一」であることを意味している。当業者に知られている「同一性」とは、配列同士間のヌクレオチドの順序および同一性を一致させることにより決定した際の、ヌクレオチド配列同士間の配列関連性の程度である。一実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列に対して、８０％の相補性および８０％から１００％までの相補性、例えば８５％の相補性、９０％の相補性または９５％の相補性を有するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ほぼ完全な相補性と見なされ、本発明に使用し得る。「完全な」連続した相補性は、連続する塩基対の標準的ワトソン−クリック塩基対形成である。「少なくともほぼ完全な」連続した相補性は、本明細書で使用する場合「完全な」相補性を包含する。同一性または相補性を決定するコンピュータ法が、ヌクレオチド配列同士の最大の一致度を特定するために設計されており、ＢＬＡＳＴＮが一例である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻、４０３〜４１０頁）。

用語「一致率（％）」とは、第１の核酸分子中にある連続ヌクレオチドが、第２の核酸分子中にある同じ長さの１組の連続ヌクレオチドに対して同じである比率（％）について示す。用語「相補率（％）」とは、第１の核酸分子中にある連続ヌクレオチドが、第２の核酸分子中にある１組の連続ヌクレオチドとワトソン−クリック式に塩基対を形成できる比率（％）について示す。

標的ｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの一方の鎖（そのセンス鎖）との関係は、同一性の関係である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、存在する場合、パッセンジャー鎖とも称する。標的ｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの他方の鎖（そのアンチセンス鎖）との関係は、相補性の関係である。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、存在する場合、ガイド鎖とも称する。

５’から３’の方向に書かれる核酸配列中の最後から２番目の塩基は、最後の塩基の次、即ち３’塩基の次の塩基である。５’から３’の方向に書かれる核酸配列の最後から２番目からの１３塩基は、３’塩基の次にあって３’塩基を含まない、最後の１３塩基配列である。同様に、５’から３’の方向に書かれる核酸配列の最後から２番目からの１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基または１８塩基は、３’塩基の次にあって３’塩基を含まない、最後のそれぞれ１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基または１８塩基の配列である。

「（配列識別子）のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドと、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド」という語句は、１つのヌクレオチド置換を受け容れる。２つのヌクレオチド置換（即ち、１１／１３＝８５％の同一性／相補性）は、このような語句に含まれない。

本発明の一実施形態では、連続ヌクレオチドの領域は、各配列識別子で特定される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドと、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチドの領域である。２つのヌクレオチド置換（即ち、１２／１４＝８６％の同一性／相補性）が、このような語句に含まれる。

本発明のさらなる実施形態では、連続ヌクレオチドの領域は、各配列識別子の配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドと、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチドの領域である。３つのヌクレオチド置換がこのような語句に含まれる。

配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡ中の標的配列は、そのｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域、ならびにそのｍＲＮＡのコード領域にあってもよい。

２本鎖干渉性ＲＮＡの鎖の一方または両方は、ヌクレオチド１〜６個の３’オーバーハングを有してもよく、そのヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはその混合物でもよい。オーバーハングのヌクレオチドは、塩基対を形成していない。本発明の一実施形態では、該干渉性ＲＮＡはＴＴまたはＵＵのオーバーハングを含む。本発明の別の実施形態では、該干渉性ＲＮＡは少なくとも１つの平滑末端を含む。末端は普通、５’リン酸基または３’ヒドロキシル基を有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖が５’リン酸基を有し、センス鎖が５’ヒドロキシル基を有する。さらに他の実施形態では、末端は、他の分子または官能基の共有結合的付加によりさらに修飾される。

２本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、前記のように２本の単鎖で二重鎖を形成してもよく、または相補性の領域が、塩基対を形成し、ヘアピンループで共有結合的に連結することにより、１本鎖を形成する単一分子でもよい。ヘアピンはダイサーという名称のタンパク質により細胞内で切断され、塩基対をなす２個の個別分子からなる干渉性ＲＮＡを形成すると考えられている。

干渉性ＲＮＡは、ヌクレオチド１個または複数個の付加、欠失、置換または修飾により、天然ＲＮＡとは異なり得る。非ヌクレオチド性物質が、５’末端、３’末端、内部のいずれかで干渉性ＲＮＡと結合してもよい。このような修飾は、干渉性ＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を高め、細胞取込を改善し、細胞標的の設定を増強し、干渉性ＲＮＡの追跡を補助し、安定性をさらに改善し、またはインターフェロン経路が活性化する可能性を低下させるために、通常設計される。例えば、干渉性ＲＮＡは、オーバーハングの末端にプリンヌクレオチドを含んでもよい。例えば、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端へピロリジンリンカーによりコレステロールを結合体することも、ｓｉＲＮＡに安定性を付与する。

さらなる修飾には、例えば、細胞浸透性を有することが知られている３’末端ビオチン分子、ナノ粒子、ペプチド模倣物質、蛍光色素、またはデンドリマーが挙げられる。

ヌクレオチドは、分子の塩基部分、糖部分またはリン酸部分上で修飾を受け、本発明の実施形態において機能し得る。修飾には、例えば、アルキル、アルコキシ、アミノ、デアザ、ハロ、ヒドロキシル、チオールの各基、またはその組合せによる置換が含まれる。ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで代替すること、または２’アミノ基、２’Ｏ−メチル基、２’メトキシエチル基もしくは２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋で代替した２’ＯＨ基などの糖修飾を有することなどの、安定性が増加するアナログで代用してもよい。ヌクレオチドのプリンまたはピリミジンアナログの例には、キサンチン、ヒポキサンチン、アザプリン、メチルチオアデニン、７−デアザ−アデノシン、Ｏ修飾およびＮ修飾ヌクレオチドなどが挙げられる。ヌクレオチドのリン酸基は、リン酸基の１個または複数の酸素を窒素または硫黄（ホスホロチオエート）で置換することにより、修飾してもよい。修飾は、例えば、機能の強化、安定性もしくは透過性の改善、または局在化もしくは標的誘導の指向に有用である。

干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖には、配列番号１または配列番号２の一部に相補的でない１つまたは複数の領域があってもよい。非相補領域は、相補領域の３’末端、５’末端もしくは両末端、または２つの相補領域の間にあってもよい。

干渉性ＲＮＡは、化学合成、インビトロ転写、またはダイサーもしくは類似活性の別の適当なヌクレアーゼによる、より長い２本鎖ＲＮＡの切断によって、外因的に生成してもよい。保護したリボヌクレオシドホスホロアミダイトから、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて作製される化学合成干渉性ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）などの商業的供給業者から入手することもできる。干渉性ＲＮＡは、例えば、溶媒もしくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはその組合せによって、精製してもよい。あるいは、干渉性ＲＮＡは、試料処理による損失を避けるために、ほとんど精製せずに使用してもよい。

干渉性ＲＮＡは、例えば、プラスミドもしくはウイルス発現ベクターから、または１個もしくは複数のプロモーターおよび該干渉性ＲＮＡに対する１個もしくは複数の適当な鋳型を含むＰＣＲ生成フラグメントである、最小発現カセットから、内因的に生成することもできる。ｓｈＲＮＡ用の市販プラスミド系発現ベクターの例には、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒシリーズのもの（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、およびｐＣｐＧ−ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が含まれる。干渉性ＲＮＡの発現用ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＡＶ）ならびにヘルペスウイルスを含めた、多様なウイルスから誘導し得る。ｓｈＲＮＡ発現用の市販ウイルスベクターの例には、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒアデノ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、およびｐＬｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴ^ＴＭ−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。ウイルスベクターの選択、該ベクターから干渉性ＲＮＡを発現させる方法、およびウイルスベクターを送達する方法は、当業者の通常の技術内に入る。ＰＣＲ生成ｓｈＲＮＡ発現カセットを作製するキットの例には、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、およびｓｉＸｐｒｅｓｓ（Ｍｉｒｕｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が含まれる。第１の干渉性ＲＮＡは、第１の干渉性ＲＮＡを発現できる第１の発現ベクターからインビボで発現させることを介して投与してもよく、第２の干渉性ＲＮＡは、第２の干渉性ＲＮＡを発現できる第２の発現ベクターからインビボで発現させることを介して投与してもよく、または両方の干渉性ＲＮＡを発現できる単一の発現ベクターからインビボで発現させることを介して、両方の干渉性ＲＮＡを投与してもよい。

干渉性ＲＮＡは、Ｕ６プロモーターもしくはＨ１プロモーターなどのｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、またはサイトメガロウイルスプロモーターなどのｐｏｌ ＩＩプロモーターを含めた、当業者に公知の様々な真核プロモーターから発現し得る。当業者であれば、こうしたプロモーターも、干渉性ＲＮＡの誘導発現を可能とするように適合できることを認識されよう。

生理条件下でのハイブリッド形成：本発明のある種の実施形態では、干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体の一部としてインビボでｍＲＮＡとハイブリッド形成をする。

「ハイブリッド形成」とは、相補的またはほぼ相補的な塩基配列を有する１本鎖核酸同士が、相互作用してハイブリッドと称する水素結合複合体を形成する過程を指す。ハイブリッド形成反応は、感度良く選択的である。インビトロでのハイブリッド形成の特異性（即ち、ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ））は、例えば、予備ハイブリッド形成およびハイブリッド形成各溶液中の塩またはホルムアミドの濃度、ならびにハイブリッド形成温度で制御されるが、このような操作は当技術分野で周知のことである。詳細には、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増加、またはハイブリッド形成温度の上昇により、ストリンジェンシーが増加する。

例えば、高ストリンジェンシーの条件は、約５０％のホルムアミド、３７℃〜４２℃で起こることができよう。低ストリンジェンシーの条件は、約３５％〜２５％のホルムアミド、３０℃〜３５℃で起こることができよう。ハイブリッド形成に対するストリンジェンシー条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に示されている。ストリンジェントなハイブリッド形成条件のさらなる例には、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃もしくは７０℃、１２〜１６時間の後、洗浄、または１ＸＳＳＣ中７０℃もしくは１ＸＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでハイブリッド形成の後、０．３ＸＳＳＣ中７０℃で洗浄、または４ＸＳＳＣ中７０℃もしくは４ＸＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでハイブリッド形成の後、１ＸＳＳＣ中６７℃で洗浄が含まれる。ハイブリッド形成の温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔ_ｍ）より約５℃〜１０℃低く、Ｔ_ｍは、次式の計算を用いて長さ１９塩基対と４９塩基対との間のハイブリッドについて決定され、Ｔ_ｍ℃＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である。

上記のインビトロハイブリッド形成アッセイは、候補ｓｉＲＮＡと標的との結合が特異性を有するか否かを予測する方法を提供する。しかし、ＲＩＳＣ複合体に関しては、標的の特異的切断が、インビトロのハイブリッド形成で高ストリンジェンシーを示さないアンチセンス鎖でも起こり得る。

１本鎖干渉性ＲＮＡ：上記のように、干渉性ＲＮＡは最終的に１本鎖として機能する。１本鎖（ｓｓ）干渉性ＲＮＡは、２本鎖ｓｉＲＮＡほどに有効ではないが、ｍＲＮＡの沈黙を起こすことが判明した。したがって、本発明の実施形態は、生理条件下で配列番号１または配列番号２の一部分とハイブリッドを形成し、配列番号１または配列番号２のそのハイブリッド形成部分と少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、ｓｓ干渉性ＲＮＡの投与も提供する。該ｓｓ干渉性ＲＮＡは、上記のｄｓ ｓｉＲＮＡについては１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有する。該ｓｓ干渉性ＲＮＡは、５’リン酸を有するか、または５’位でインサイチュもしくはインビボでリン酸化される。「５’リン酸化」という用語は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端に、糖（例えば、リボース、デオキシリボースまたはそのアナログ）のＣ５ヒドロキシルへエステル結合を介して結合するリン酸基を有する、該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドについて述べるために使用される。

ｓｓ干渉性ＲＮＡは、化学的に、もしくはインビトロ転写により合成され、またはｄｓ干渉性ＲＮＡについてはベクターもしくは発現カセットから内因的に発現される。５’リン酸基はキナーゼにより付加してもよいし、または５’リン酸はＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果でもよい。送達は、ｄｓ干渉性ＲＮＡの場合と同じである。一実施形態では、保護末端およびヌクレアーゼ耐性修飾を有するｓｓ干渉性ＲＮＡが、沈黙のために投与される。ｓｓ干渉性ＲＮＡは、保存のために乾燥し、または水溶液中に溶解してもよい。該溶液は、アニーリング抑制または安定化のために緩衝剤または塩を含有してもよい。

ヘアピン干渉性ＲＮＡ：ヘアピン干渉性ＲＮＡは、ステム−ループ即ちヘアピン構造中に干渉性ＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖双方を含む単分子である（例えばｓｈＲＮＡ）。例えば、ｓｈＲＮＡは、センス干渉性ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドが、その逆方向相補的なアンチセンス干渉性ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドと、短いスペーサーにより連結されているＤＮＡベクターから発現させることができる。選定した発現ベクターに必要であれば、３’末端Ｔおよび制限酵素部位を形成するヌクレオチドを付加してもよい。生成するＲＮＡ転写物は、折り返されてステム−ループ構造を形成する。

投与方式：干渉性ＲＮＡは、例えば、エアロゾル、口腔、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮投与で送達してもよい。

干渉性ＲＮＡは、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼房内、硝子体内、眼内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内への注入などの眼組織注入；カテーテル、もしくは網膜ペレット、眼内インサート、坐剤などの他の留置用具、または多孔質、非多孔質もしくはゼラチン質材料から構成されるインプラントを用いた眼への直接施用；局所的な点眼用液滴または軟膏；あるいは盲管内の、または強膜に隣接して（経強膜）もしくは眼内に埋植した徐放用具により、眼に直接送達してもよい。眼房内注入は、角膜から前眼房内に薬剤が小柱網に到達できるように行い得る。涙管内注入は、シュレム管に排液する静脈集涙道またはシュレム管内に行い得る。

被験体：眼血管形成の治療が必要であるか、または眼血管形成を発現する危険性のある被験体は、本明細書で言及するようなＨＩＦ１Ａの不要もしくは不適当な発現もしくは活性に関連する眼血管形成を有する、または眼血管形成を有する危険性のあるヒトまたは他の哺乳動物である。このような障害に関係する眼の構造には、例えば、眼、網膜、脈絡膜、水晶体、角膜、小柱網、虹彩、視神経、視神経乳頭、強膜、前眼部もしくは後眼部、または毛様体を包含し得る。被験体は、眼の細胞、細胞培養物、器官、またはエクスビボでの器官もしくは組織でもよい。

処方物および投薬量：医薬処方物は、本発明の干渉性ＲＮＡまたはその塩９９重量％までを、水、緩衝液、塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなどの生理的に受容可能なキャリアとの混合物として含む。

本発明の干渉性ＲＮＡは、溶液、懸濁液または乳濁液として投与される。以下の表は、本発明により具体化される考えられ得る処方物の例である。

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一般的に、本発明の実施形態の干渉性ＲＮＡの有効量は、標的細胞表面において１００ｐＭ〜１μＭ、または１ｎＭ〜１００ｎＭ、または５ｎＭ〜５０ｎＭ、または約２５ｎＭまでの細胞外濃度を生じる。この局所濃度の実現に必要な用量は、送達法、送達部位、送達部位と標的細胞または組織との間の細胞層数、送達の局所性または全身性如何などのいくつもの要因に依存して変化することになろう。送達部位における濃度は、標的細胞または組織の表面における濃度よりかなり高くなり得る。局所用組成物は、熟練臨床医の裁量に従って、毎日１〜４回、または毎日、毎週、隔週、毎月もしくはそれより長い頻度などの長期送達日程で標的器官の表面に送達される。処方物のｐＨは、約ｐＨ４〜９またはｐＨ４．５〜ｐＨ７．４である。

ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡに対する干渉性ＲＮＡを用いた患者の治療的処置は、作用の持続期間を増加させ、したがって投薬頻度の減少および患者コンプライアンスの増大を可能とすることによって、小分子処置より有益であると予想される。

処方物の有効量は、例えば、被験体の年齢、人種および性別、眼血管形成の重度、標的遺伝子転写物／タンパク質代謝回転の速度、干渉性ＲＮＡの効力、干渉性ＲＮＡの安定性などの要因に依存し得る。一実施形態では、干渉性ＲＮＡは、局所の標的器官に送達され、網膜や視神経乳頭などのＨＩＦ１Ａ含有組織に治療用量で到達することにより、眼血管形成に関連する疾患過程を軽減する。

受容可能なキャリア：受容可能なキャリアとは、ひどくてもほとんどないしまったく眼の刺激を起こさず、必要であれば適切な保護をもたらし、本発明の１種または複数の干渉性ＲＮＡを均一な用量で送達するようなキャリアを指す。本発明の実施形態の干渉性ＲＮＡを投与するための受容可能なキャリアには、カチオン性脂質系トランスフェクション試薬のＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、もしくはＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ^ＴＭ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）；ポリエチレンイミンなどのポリカチオン；Ｔａｔ、ポリアルギニン、もしくはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ａｎｔｐペプチド）などのカチオン性ペプチド；またはリポソームが含まれる。リポソームは、標準的な小胞形成脂質およびコレステロールなどのステロールから形成され、例えば、内皮細胞表面抗原に結合親和性を有するモノクローナル抗体などの標的指向分子を含み得る。さらに、リポソームはＰＥＧ化リポソームでもよい。

干渉性ＲＮＡは、溶液中、懸濁液中、または非生体浸食性送達用具中で送達してもよい。干渉性ＲＮＡは、単独で、または所定の共役結合性結合体の成分として送達することができる。干渉性ＲＮＡは、カチオン性脂質、カチオン性ペプチドもしくはカチオン性ポリマーと複合することもでき、タンパク質、融合タンパク質、もしくは核酸結合性のタンパク質ドメイン（例えば、プロタミン）と複合することもでき、またはナノ粒子もしくはリポソーム中に封入することもできる。組織特異的または細胞特異的送達は、抗体や抗体フラグメントなどの適当な標的指向性構成成分を含めることにより、実現させることができる。

眼への送達については、干渉性ＲＮＡは、眼科的に許容できる防腐剤、共溶媒、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、緩衝剤、塩化ナトリウムまたは水を併用することにより、眼科用滅菌水性懸濁液または溶液を形成してもよい。溶液処方物は、生理的に受容可能な等張水性緩衝液中に干渉性ＲＮＡを溶解することにより、調製し得る。さらに、該溶液は、該阻害剤の溶解を補助するために、受容可能な界面活性剤を含んでもよい。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの増粘剤を本発明の組成物に添加することにより、当該化合物の保持力を改善してもよい。

眼科用滅菌軟膏処方物を調製するために、干渉性ＲＮＡは、鉱油、液体ラノリン、白色ワセリンなどの適当な媒体中の防腐剤と併用される。眼科用滅菌ゲル処方物は、例えばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）などの組合せから調製される親水性基剤中に、当技術分野で公知の方法に従って干渉性ＲＮＡを懸濁することにより、調製し得る。眼内注入のために、例えばＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）を使用してもよい。本発明の他の組成物は、干渉性ＲＮＡの眼内浸透性が不十分な場合、クレモフォア、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの浸透促進剤を含有してもよい。

キット：本発明の実施形態は、本明細書に記載のようなｍＲＮＡの細胞内発現を弱めるために、そのための試薬を含むキットを提供する。該キットは、ｓｉＲＮＡか、またはｓｈＲＮＡ発現ベクターを含有する。ｓｉＲＮＡ、および非ウイルス性のｓｈＲＮＡ発現ベクターについては、該キットは、トランスフェクション試薬または他の適切な送達媒体も含有する。ウイルス性のｓｈＲＮＡ発現ベクターについては、該キットは、ウイルスベクター、および／またはウイルスベクター産生用の必要成分を含有し得る（例えば、パッケージング細胞株、ならびにパッケージング用のウイルスベクター鋳型および追加のヘルパーベクターを含むベクター）。該キットは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクターのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールも含有する（例えば、非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡ、または無関係ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ）。該キットは、狙った標的遺伝子のノックダウンを評価する試薬を含有してもよい（例えば、標的ｍＲＮＡを検出する定量的ＰＣＲ用のプライマーとプローブ、および／または対応タンパク質に対するウェスタンブロット用の抗体）。あるいは、該キットは、ｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列と、インビトロ転写によるｓｉＲＮＡの生成またはｓｈＲＮＡ発現ベクターの構築に必要な使用説明書および材料とを含んでもよい。

包装式組合せで、収容手段を密接に詰めて受け容れるようになされた搬送手段と、干渉性ＲＮＡ組成物および受容可能なキャリアを含む第１の収容手段とを含んだ、キット形式の医薬用組合せもさらに提供される。このようなキットは、当業者であれば容易に明らかであろうが、例えば、薬学的に受容可能なキャリアを１種または複数有する容器、追加の容器などの従来からの多様な医薬キット構成要素を１種または複数、所望であればさらに含むこともできる。投与すべき成分の量、投与指針、および／または成分混合の指針を示す、折込みあるいはラベルいずれかの使用説明書も、該キットの中に含み得る。

例えばヒト眼細胞株における内因的標的遺伝子の発現量をノックダウンする、干渉性ＲＮＡの能力は、インビトロで以下のように評価される。ヒト形質転換細胞をトランスフェクションの２４時間前に標準増殖培地（例えば、１０％ウシ胎児血清補充ＤＭＥＭ）中に播種する。０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の干渉性ＲＮＡ濃度で、製造業者の教示に従ってＤｈａｒｍａｆｅｃｔ １（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を用いてトランスフェクションを行う。非標的指向性コントロールのｓｉＲＮＡおよびラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）をコントロールとして使用する。標的ｍＲＮＡ量は、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）順方向および逆方向プラマーと、標的部位を包含するプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）とを用いて、トランスフェクションの２４時間後にｑＰＣＲによって評価される。標的タンパク質量は、例えばウェスタンブロットにより、トランスフェクションのおよそ７２時間後（実際の時間はタンパク質の代謝回転速度に依存する）に評価し得る。培養細胞からのＲＮＡおよび／またはタンパク質の標準的分離技法は、当業者に周知である。非特異的な標的外効果を減ずるために、標的遺伝子発現における所望のノックダウン量を生成するできる限り低濃度の干渉性ＲＮＡが使用される。

ＨＩＦ１Ａタンパク質の発現量をノックダウンする、本発明の干渉性ＲＮＡの能力は、以下のように実施例１でさらに例示される。

（実施例１）
ＨＩＦ１Ａを特異的に沈黙させるための干渉性ＲＮＡ
本試験では、培養ＨｅＬａ細胞における内因性ＨＩＦ−１αタンパク質の発現量に対するＨＩＦ１Ａ干渉性ＲＮＡのノックダウン能を調べる。

ＨｅＬａ細胞のトランスフェクションは、各ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡの標準的インビトロ濃度（０．１ｎＭ〜１０ｎＭ）、ｓｉＣＯＮＴＲＯＬのＲＩＳＣ非含有ｓｉＲＮＡ＃１、またはｓｉＣＯＮＴＲＯＬの非標的指向性ｓｉＲＮＡ＃２（ＮＴＣ２）、およびＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（登録商標）＃１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を用いて行った。すべてのｓｉＲＮＡを、１ＸｓｉＲＮＡ緩衝液としての２０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ_２の水溶液中に溶解した。コントロール試料には、ｓｉＲＮＡの容量を１ＸｓｉＲＮＡ緩衝液の等容量で代用した緩衝液コントロールを含めた（−ｓｉＲＮＡ）。ＨＩＦ−１αタンパク質の発現を評価するために、抗ＨＩＦ−１α抗体を用いたウェスタンブロットを行った。各ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡは、以下の標的に対して特異性を有する２本鎖干渉性ＲＮＡである。即ち、ｓｉＨＩＦ１Ａ＃１は配列番号４８を標的とし、ｓｉＨＩＦ１Ａ＃３は配列番号４９を標的とし、ｓｉＨＩＦ１Ａ＃５は配列番号５０を標的とし、ｓｉＨＩＦ１Ａ＃６は配列番号５１を標的とする。図のデータが示すように、４つのＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡの各々は、コントロールｓｉＲＮＡに比して、濃度１０ｎＭでＨＩＦ−１αタンパク質の発現を有意に低下させた。しかし、ｓｉＨＩＦ１Ａ＃３およびｓｉＨＩＦ１Ａ＃６もまた、０．１ｎＭではＨＩＦ−１αタンパク質の発現を有意に沈黙させ、これらのＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡが、ｓｉＨＩＦ１Ａ＃１およびｓｉＨＩＦ１Ａ＃５に比して特に有効であることを示している。

本明細書で引用した参考文献は、本明細書に提示した例示的な手順上または他の詳細を補足する程度に、明確に参考として援用される。

本開示に鑑みると、当業者であれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本明細書に開示した実施形態の明白な改変をなし得ることを理解されよう。本明細書に開示した実施形態はすべて、本開示に鑑みると、過度の実験をせずになし、実行することができる。本発明の全範囲は、この開示およびその等価な実施形態において明示されている。本明細書は、本発明がその資格を有する保護の全範囲を過度に狭めるものと見なすべきではない。

本明細書に使用する場合で別途指示しない限り、用語「ａ」および「ａｎ」は、「１」、「少なくとも１」または「１もしくは複数」を意味するものとする。

この図は、ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡの＃１、＃３、＃５および＃６、ならびにＲＩＳＣ非含有コントロールｓｉＲＮＡを各々１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭと、非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ２）１０ｎＭと、緩衝液コントロール（−ｓｉＲＮＡ）とでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞に関するＨＩＦ−１αウェスタンブロットを提供する。矢印は、９３ｋＤａのＨＩＦ−１αおよび４２ｋＤａのアクチンタンパク質の各バンドの位置を示す。

Claims (63)

1. 被験体のＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの発現を弱める方法であって、前記方法は、
   長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を前記被験体へ投与すること
   を含み、前記干渉性ＲＮＡは、
   センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、
   前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しており、
   それによりＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの前記発現が弱められる、方法。
2. 前記被験体がヒトであり、該ヒトが眼血管形成を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記被験体がヒトであり、該ヒトが、眼血管形成を発症する危険性がある、請求項１に記載の方法。
4. 前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の経路を介して投与される、請求項１に記載の方法。
5. 前記アンチセンス鎖が、４１１、５８０、５８３、８６８、８６９、１０９９、１１００、１２４２、１３０２、１３７１、１３９６、１５５９、１５６０、１８０９、２０８５、２０８７、２１０５、２１３８、２２５６、２３５８、２４２２、２６３６、２６６６、２７４３、２８５８、２８６１、３１３５、３５４４、３５５４、１９４３、１７９１、２３５１または１４０８のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される、請求項１に記載の方法。
6. 前記アンチセンス鎖が、２３６０、２４１１、２４２０、２５３６、２５３９、２５４５、２６１６、２７３１、２７３４、３００８または３４２７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される、請求項１に記載の方法。
7. １９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、
   センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域
   を含む第２の干渉性ＲＮＡを前記被験体に投与することをさらに含み、
   前記第２の干渉性ＲＮＡの前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの第２の部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記アンチセンス鎖は、それぞれ、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記第２のハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、
   請求項１に記載の方法。
8. 眼血管形成の治療を必要とする被験体において眼血管形成を治療する方法であって、前記方法は、
   長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を前記被験体の眼へ投与すること
   を含み、前記干渉性ＲＮＡは、
   センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、
   前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しており、
   それにより前記眼血管形成が治療される、方法。
9. 被験体のＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの発現を弱める方法であって、前記方法は、
   長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの１本鎖干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を前記発現系へ投与すること
   を含み、
   前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、４１１、５８０、５８３、８６８、８６９、１０９９、１１００、１２４２、１３０２、１３７１、１３９６、１５５９、１５６０、１８０９、２０８５、２０８７、２１０５、２１３８、２２５６、２３５８、２４２２、２６３６、２６６６、２７４３、２８５８、２８６１、３１３５、３５４４、３５５４、１９４３、１７９１、２３５１または１４０８のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しているか、あるいは
   前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、２３６０、２４１１、２４２０、２５３６、２５３９、２５４５、２６１６、２７３１、２７３４、３００８または３４２７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しており、
   それによりＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの前記発現が弱められる、方法。
10. 被験体におけるＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの発現を弱める方法であって、前記方法は、
    長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を前記発現系へ投与すること
    を含み、前記干渉性ＲＮＡは、
    配列番号３および配列番号９〜配列番号５１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含んでおり、
    それにより前記ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの前記発現が弱められる、方法。
11. 前記干渉性ＲＮＡは、
    配列番号３および配列番号９〜配列番号３６のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
    を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記干渉性ＲＮＡは、
    配列番号３７〜配列番号５１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
    を含む、請求項１０に記載の方法。
13. 前記干渉性ＲＮＡが、配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１０に記載の方法。
14. 前記干渉性ＲＮＡが、前記配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１０に記載の方法。
15. 前記組成物がさらに、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号５１のいずれか１つに対応する第２のｍＲＮＡの３’末端から２番目からの少なくとも１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、第２の干渉性ＲＮＡを含む、請求項１０に記載の方法。
16. 眼血管形成の治療を必要とする被験体における眼血管形成を治療する方法であって、前記方法は、
    長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を前記被験体の眼へ投与すること
    を含み、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号３および配列番号９〜配列番号５１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含み、
    それにより前記眼血管形成が治療される、方法。
17. 前記干渉性ＲＮＡは、
    配列番号３および配列番号９〜配列番号３６のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
    を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記干渉性ＲＮＡは、
    配列番号３７〜配列番号５１のいずれかに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
    を含む、請求項１６に記載の方法。
19. 前記被験体が網膜浮腫、網膜虚血または糖尿病性網膜症を有する、請求項１６に記載の方法。
20. 前記センスヌクレオチド鎖および前記アンチセンスヌクレオチド鎖がヘアピンループにより連結される、請求項１に記載の方法。
21. 前記センスヌクレオチド鎖および前記アンチセンスヌクレオチド鎖がヘアピンループにより連結される、請求項８に記載の方法。
22. 前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
23. 前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
24. 前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
25. 前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
26. 前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
27. 前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
28. 前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の経路を介して投与される、請求項８に記載の方法。
29. 前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の経路を介して投与される、請求項１６に記載の方法。
30. 前記組成物が、干渉性ＲＮＡ発現ベクターからインビボ発現を介して投与される、請求項８に記載の方法。
31. 前記組成物が、干渉性ＲＮＡ発現ベクターからインビボ発現を介して投与される、請求項１６に記載の方法。
32. 前記被験体が網膜浮腫、網膜虚血または糖尿病性網膜症を有する、請求項８に記載の方法。
33. 眼血管形成の治療を必要とする被験体において眼血管形成を治療する方法であって、前記方法は、
    ＲＮＡ干渉を介してＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現をダウンレギュレートする、２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を前記被験体へ投与すること
    を含み、前記ｓｉＲＮＡの各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、
    前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、それぞれ前記ＨＩＦ１Ａ遺伝子に対応するｍＲＮＡに対して実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、前記ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して前記ｍＲＮＡの切断を誘導する、
    方法。
34. 前記組成物が、エアロゾル、口腔、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮の投与を介して投与される、請求項３３に記載の方法。
35. 前記干渉性ＲＮＡが、前記干渉性ＲＮＡを発現し得る発現ベクターからインビボ発現を介して投与される、請求項３３に記載の方法。
36. 前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項３３に記載の方法。
37. 前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドである、請求項３３に記載の方法。
38. 前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドである、請求項３３に記載の方法。
39. １９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号５１のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列、またはその相補体を含む干渉性ＲＮＡと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物。
40. 前記干渉性ＲＮＡはｓｈＲＮＡである、請求項３９に記載の組成物。
41. 前記干渉性ＲＮＡはｓｉＲＮＡである、請求項３９に記載の組成物。
42. 前記干渉性ＲＮＡはｍｉＲＮＡである、請求項３９に記載の組成物。
43. ＲＮＡ干渉を介してＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現をダウンレギュレートする、２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物であって、
    前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、
    前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、それぞれ前記ＨＩＦ１Ａ遺伝子に対応するｍＲＮＡに対して実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、前記ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して前記ｍＲＮＡの切断を誘導する、組成物。
44. 前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドである、請求項４３に記載の組成物。
45. 前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドである、請求項４３に記載の組成物。
46. 被験体のＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの発現を弱める組成物の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物の使用であって、前記干渉性ＲＮＡは、
    配列番号３および配列番号９〜配列番号５１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、使用。
47. 被験体における眼血管形成を治療する医薬の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物の使用であって、前記干渉性ＲＮＡは、
    配列番号３および配列番号９〜配列番号５１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、
    使用。
48. 前記干渉性ＲＮＡが、配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項４６または４７に記載の使用。
49. 前記干渉性ＲＮＡが、前記配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項４６または４７に記載の使用。
50. 前記組成物がさらに、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号５１のいずれか１つに対応する第２のｍＲＮＡの３’末端から２番目からの少なくとも１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、第２の干渉性ＲＮＡを含む、請求項４６または４７に記載の使用。
51. 被験体における眼血管形成を治療するための医薬の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物の使用であって、前記干渉性ＲＮＡは、
    センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、
    前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有している、使用。
52. 被験体のＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの発現を弱める組成物の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの１本鎖干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとの使用であって、
    前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、４１１、５８０、５８３、８６８、８６９、１０９９、１１００、１２４２、１３０２、１３７１、１３９６、１５５９、１５６０、１８０９、２０８５、２０８７、２１０５、２１３８、２２５６、２３５８、２４２２、２６３６、２６６６、２７４３、２８５８、２８６１、３１３５、３５４４、３５５４、１９４３、１７９１、２３５１または１４０８のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しているか、あるいは
    前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、２３６０、２４１１、２４２０、２５３６、２５３９、２５４５、２６１６、２７３１、２７３４、３００８または３４２７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有している、
    使用。
53. 前記センスヌクレオチド鎖および前記アンチセンスヌクレオチド鎖がヘアピンループにより連結される、請求項５１に記載の使用。
54. 前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項４６、４７または５１に記載の使用。
55. 前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項４６、４７または５１に記載の使用。
56. 前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項４６、４７または５１に記載の使用。
57. 前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の投与のために調製される、請求項４７または５１に記載の使用。
58. 前記組成物が前記干渉性ＲＮＡを発現し得る発現ベクターを含む、請求項４７または５１に記載の使用。
59. 前記医薬が眼血管形成の治療のためのものである、請求項４７または５１に記載の使用。
60. 被験体において眼血管形成を治療する医薬の調製における、ＲＮＡ干渉を介してＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現をダウンレギュレートする２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物の使用であって、
    前記ｓｉＲＮＡの各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、
    前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、前記ＨＩＦ１Ａ遺伝子に対応するｍＲＮＡに対して実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、前記ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して前記ｍＲＮＡの切断を誘導する、
    使用。
61. 前記組成物が、エアロゾル、口腔、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮の投与のために調製される、請求項６０に記載の使用。
62. 前記組成物が前記干渉性ＲＮＡを発現し得る発現ベクターを含む、請求項６０に記載の使用。
63. 前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項６０に記載の使用。

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