CN111150726B - 4-羟基-2-亚甲基丁酸（5-甲酰基呋喃-2-甲）酯在制备肝癌治疗药物中的应用 - Google Patents

4-羟基-2-亚甲基丁酸（5-甲酰基呋喃-2-甲）酯在制备肝癌治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明研究发现过表达RPS3能够促进肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、及上皮细胞向间充质细胞转化能力；反之亦然。将敲低RPS3的肝癌细胞株皮下注射裸鼠后，成瘤性降低。在裸鼠肝癌模型中，给予RPS3抑制剂，可以抑制肿瘤的生长。在此基础上，本发明提供了RPS3基因或其mRNA或所述基因编码的蛋白或蛋白片段用作筛选肝癌药物的药物靶点，以及RPS3抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的用途，所述抑制剂优选是4‑羟基‑2‑亚甲基丁酸‑(5‑甲酰基呋喃‑2‑甲)酯。

Description

4-羟基-2-亚甲基丁酸（5-甲酰基呋喃-2-甲）酯在制备肝癌治 疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及肝癌治疗的生物医药技术，特别是涉及RPS3基因或其编码的蛋白的抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用，尤其是化合物4-羟基-2-亚甲基丁酸-(5-甲酰基呋喃-2-甲)酯在制备治疗肝癌的药物中的应用。
背景技术
原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是一种死亡率极高的原发性肝疾病，是全球范围最常见的恶性肿瘤之一。据不完全统计，全世界肝癌年增加超过60万人，新患肝癌55％发生在中国。原发性肝癌从病理形态上可分为块状型肝癌、结节型肝癌、弥漫型肝癌；从组织病理学上可分为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarecinoma，ICC)、混合型肝癌(combined hepatocellular andcholangiocarecinoma)；根据癌细胞的分化程度，可分为高分化、中分化和低分化3个等级。临床中原发性肝癌中95％以上的细胞病理学分型为肝细胞癌。HCC的高度侵袭性和高复发率导致了HCC 的高死亡率。
肝癌起病隐匿，缺乏有效可靠的筛查手段，大多数患者被诊断时已处于肝癌晚期或终末期，错过了治疗的最佳时期，可用的治疗选择有限且无效。肝癌的发生发展是一种多基因参与，多种环境因素协同作用的过程。正常的肝细胞演变成肝癌细胞需要经历多个病理阶段，涉及多种分子事件，然而肝癌发生发展的详细分子机制尚不清楚。目前研究认为，肝癌发病的相关因素与乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒感染、黄曲霉素、水污染等因素高度密切相关。其发病机制与癌基因、抑癌基因、使DNA氧化损伤的生物和环境因素等有关。此外，肿瘤的浸润和转移也是肝癌发生发展的一个重要环节，其涉及到肿瘤细胞与宿主细胞间复杂的相互作用过程，参与的相关基因众多，有钙黏蛋白、免疫球蛋白超基因家族成员、整合素、基质金属蛋白激酶、金属蛋白激酶组织抑制蛋白等。因此，更深入的了解肝癌发病的分子机制，预测特定药物对于肝癌患者的有效性，寻找肝癌诊断和预后标志物，对肝癌做到早期诊断和早期治疗是当今医学科学工作者们的重要任务之一。
RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)是一类可以在体内结合单链或双链RNA的蛋白分子，通过特定的RNA结构域识别mRNA的特异元件，介导RNA 的剪接、多聚腺苷化作用、序列编辑、RNA转运、RNA稳定性维持及细胞内定位和翻译等众多生理进程。研究表明，RBPs能够在多个水平上调节RNA转录本的丰度和功能，促进肿瘤的发生。此外，RBPs在调节细胞发育，稳态和疾病的基因表达中极为重要，RNA结合蛋白的表达失调与多种人类疾病相关，包括肌肉萎缩，神经疾病和癌症等。
发明内容
核糖体蛋白S3(ribosomal protein S3，RPS3)，是核糖体40S亚基的组成部分之一，形成翻译起始区域的一部分。该蛋白属于核糖体蛋白S3P家族，由基因RPS3编码。对该基因已发现编码不同亚型的多个可变的剪接转录变体。
本发明的发明人在肝癌的各细胞系中对基因RPS3的功能进行研究，发现过表达RPS3能够促进肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、及上皮细胞向间充质细胞转化能力；反之，敲低RPS3能够抑制细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、及上皮细胞向间充质细胞转化能力。将敲低RPS3的肝癌细胞株皮下注射裸鼠，与非敲低的肝癌细胞株相比，前者的成瘤性降低，无论是肿瘤的重量还是体积都低于后者。以上研究结果显示，RPS3在肝癌进展中发挥着重要的作用，其表达水平增高会促进肝癌发展、浸润和转移，而抑制其表达可以治疗肝癌。RPS3 可能成为治疗肝癌的新靶点，并可用作筛选肝癌药物的药物靶点。
本发明的发明人还发现了一种新的RPS3抑制剂——4-羟基-2-亚甲基丁酸 (5-甲酰基呋喃-2-甲)酯(缩写为FMHM)，该化合物能够抑制肝癌的进展，用作肝癌治疗药物。发明人对肝癌细胞给药FMHM后，发现所述细胞的RPS3的表达降低，细胞增殖、克隆形成、细胞周期和伤口愈合能力均降低。而FMHM 的抗肝癌活性能被RPS3过表达所逆转。由此证明FMHM抑制肝癌的作用机制之一可能是抑制了RPS3的表达或功能。
在此基础上，发明人完成了本发明，并提出以下技术方案：
RPS3抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的用途。
所述抑制剂抑制基因RPS3的表达或抑制基因RPS3编码的蛋白。
所述抑制基因RPS3表达的抑制剂可以是抑制基因RPS3mRNA的抑制剂，包括但不限于：其反义核酸序列、siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA，或者抑制基因RPS3mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、小分子化合物(例如天然化合物、合成化合物等)。
所述抑制基因RPS3编码的蛋白的抑制剂可以是抑制基因RPS3编码的蛋白质的活性或蛋白质水平的化学物质，包括但不限于所述蛋白质的抗体、抑制所述蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、小分子化合物(例如天然化合物、合成化合物等)。
优选，所述抑制剂是式I化合物，
Figure BDA0001859091880000031
其化学名称为4-羟基-2-亚甲基丁酸(5-甲酰基呋喃-2-甲)酯，缩写为FMHM。
FMHM可以从密花远志中分离得到，外观呈棕色油状物。其提取分离方法可参考专利文献CN103304522A。
在本发明的一个实施方式中，FMHM的提取方法为：1)将密花远志根粉碎后，用体积分数为50～100％的乙醇水溶液进行回流提取，收集提取液并回收乙醇，得到浸膏；2)将所述浸膏通过大孔吸附树脂色谱柱，水洗后用不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集体积分数为20～60％的乙醇洗脱液并浓缩，得浓缩物；将浓缩物通过硅胶柱色谱纯化，以氯仿-甲醇-水体积比为7∶(1-3)∶0.1 的混合溶液进行洗脱，得到FMHM。
优选，所述抑制剂是基因RPS3的mRNA的shRNA，其干扰的靶向序列为：GTGGAACCCAAAGATGAGAT。
在本发明的一个具体实施方式中，所述shRNA序列为： GTGGAACCCAAAGATGAGAT。
作为优选方案之一，本发明提供FMHM在制备治疗肝癌的药物中的用途。
根据本发明，所述药物中含有药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体是制药领域中常用或已知的各种辅料，包括但不限于：稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、pH调节剂、防腐剂、润滑剂、崩解剂等。
所述稀释剂例如：乳糖、淀粉、纤维素衍生物、无机钙盐、山梨醇等。所述粘合剂例如：淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。所述抗氧化剂例如：维生素E、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、丁羟基茴香醚等。所述pH调节剂例如：盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、酒石酸、Tris、乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等。所述防腐剂例如：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、间甲酚、苯扎氯铵等。所述润滑剂例如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉等。所述崩解剂例如：淀粉、甲基纤维素、黄原胶、交联羧甲基纤维素钠等。
单位剂量的所述药物中含有RPS3抑制剂的量为0.1-1000mg，优选1-500mg，更优选为5-100mg。
所述药物中RPS3抑制剂占药物的质量百分比为10％-90％，优选为20％-80％，更优选为30％-70％。
本发明药物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径注射给药。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。
所述药物的施用途径包括但不限于：口服的；含服的；舌下的；透皮的；经黏膜的；鼻内的；眼用的；肺的；直肠的；阴道的；肠胃外的，例如，通过注射，包括皮下的、真皮内的、肌内的、静脉内的、动脉内的、心内的、鞘内的、脊柱内的、囊内的、囊下的、眼眶内的、腹膜内的、气管内的、表皮下的、关节内的、蛛网膜下的和胸骨内的；通过植入储库或储液器。
施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，每天给药一次、每两天给药一次、每三天给药一次、每四天给药一次，或者总日剂量以每天两次、三次或四次的分开剂量施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。RPS3抑制剂的用药量为0.01‐1000mg/kg/天，优选为0.1‐100mg/kg/天，例如为0.5mg/kg/天，1mg/kg/天、2mg/kg/天、5mg/kg/天等等。
当治疗肝癌时，FMHM的用药量为0.01‐100mg/kg/天，优选为0.1‐10mg/kg/ 天，更优选为0.5‐5mg/kg/天，例如1mg/kg/天、1.65mg/kg/天、2mg/kg/天等。可以每天给药一次、每两天给药一次、每三天给药一次、每四天给药一次。
所述药物可以和其他治疗肝癌的药物或治疗手段联合应用。
所述其他的治疗肝癌的药物包括但不限于：三氧化二砷、5-FU、氟尿嘧啶脱氧核苷、去氧氟尿苷、替加氟、阿霉素、表柔比星、吡柔比星、顺铂、卡铂、草酸铂、奥沙利铂、贝伐单抗、西妥昔单抗、索拉菲尼、厄洛替尼、舒尼替尼、拉帕替尼。
所述其他治疗手段包括但不限于：放疗、手术切除。
所述肝癌是块状型肝癌、结节型肝癌、或弥漫型肝癌。
所述肝癌是肝细胞癌、肝内胆管细胞癌、或混合型肝癌。
所述肝癌是高分化、中分化、或低分化的肝癌。
所述肝癌是TNM分期为I期、II期、IIIa期、IIIb期、IIIc期或IV期的肝癌。
所述药物治疗肝癌的效果表现为：缩小肿瘤体积，和/或抑制肿瘤的浸润和/ 或转移，和/或延长患者的生存期，和/或提高患者的生存率。
治疗肝癌的方法，其特征在于，给有需要的患者治疗有效量的RPS3抑制剂。
所述抑制剂抑制基因RPS3的表达或抑制基因RPS3编码的蛋白。
所述抑制基因RPS3表达的抑制剂可以是抑制基因RPS3 mRNA的抑制剂，包括但不限于：其反义核酸序列、siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA，或者抑制基因RPS3 mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、小分子化合物(例如天然化合物、合成化合物等)。
所述抑制基因RPS3编码的蛋白的抑制剂可以是抑制基因RPS3编码的蛋白质的活性或蛋白质水平的化学物质，包括但不限于所述蛋白质的抗体、抑制所述蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、小分子化合物(例如天然化合物、合成化合物等)。
在本发明的一个实施方式中，所述抑制剂是式I化合物，
Figure BDA0001859091880000051
其化学名称为4-羟基-2-亚甲基丁酸(5-甲酰基呋喃-2-甲)酯，缩写为FMHM。
在本发明的一个实施方式中，所述抑制剂是基因RPS3的mRNA的shRNA，其干扰的靶向序列为：GTGGAACCCAAAGATGAGAT。
在本发明的一个具体实施方式中，所述shRNA序列为： GTGGAACCCAAAGATGAGAT。
RPS3抑制剂的施用剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，每天给药一次、每两天给药一次、每三天给药一次、每四天给药一次，或者总日剂量以每天两次、三次或四次的分开剂量施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。RPS3抑制剂的用药量为0.01‐1000mg/kg/天，优选为 0.1‐100mg/kg/天，例如为0.5mg/kg/天，1mg/kg/天、2mg/kg/天、5mg/kg/天等等。
当治疗肝癌时，FMHM的用药量为0.01‐100mg/kg/天，优选为0.1‐10mg/kg/ 天，更优选为0.5‐5mg/kg/天，例如1mg/kg/天、1.65mg/kg/天、2mg/kg/天等。可以每天给药一次、每两天给药一次、每三天给药一次、每四天给药一次。
根据本发明，所述肝癌治疗方法，进一步包括给有需要的患者治疗肝癌的其他药物，或者联合应用其他治疗手段。
所述治疗肝癌的其他药物包括但不限于：三氧化二砷、5-FU、氟尿嘧啶脱氧核苷、去氧氟尿苷、替加氟、阿霉素、表柔比星、吡柔比星、顺铂、卡铂、草酸铂、奥沙利铂、贝伐单抗、西妥昔单抗、索拉菲尼、厄洛替尼、舒尼替尼、拉帕替尼。
所述其他治疗手段包括但不限于：放疗、手术切除。
筛选肝癌治疗药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将受试化学物质与基因RPS3或其编码的蛋白或蛋白片段接触，或者将受试化学物质与表达基因RPS3的细胞接触；
2)检测RPS3蛋白的活性或稳定性变化、或者受试化学物质是否与RPS3的基因或其编码的蛋白或蛋白片段结合、或者所述细胞的RPS3基因表达量的变化。
根据本发明，所述筛选药物的方法是在体外进行的。该药物筛选方法可以在医药工业的新药研发过程中使用。
一种用于肝癌预后判断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物是基因RPS3或其mRNA或所述基因编码的蛋白或蛋白片段。
能够检测基因RPS3或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的检测试剂在制备肝癌患者预后判断的诊断试剂或诊断试剂盒中的用途。
在本发明的一些实施方式中，所述诊断试剂或诊断试剂盒具有本发明如下描述的组成。
一种肝癌预后判断的诊断试剂，其特征在于，包含能检测基因RPS3或其 mRNA或其所编码的蛋白质或蛋白片段的检测试剂。
在本发明的一种实施方式中，所述检测试剂能够通过聚合酶链式反应定量或定性检测所述基因RPS3或其mRNA。在本发明的一个具体实施例中，所述检测试剂包含能特异性扩增基因RPS3的引物。在本发明的另一个实施例中，所述检测试剂包含能反转录基因RPS3的mRNA的引物，例如所述引物为：RPS3-RT-F: GCCAAAGGCTGCGAGGTTGTGGTGTCTG；RPS3-RT-R:GCGGCTCTGG CTTCCCACCC TTCTGTTC。
优选，所述检测试剂中还包含DNA聚合酶，例如：Tag聚合酶。
优选，所述检测试剂中还包含dNTP。
优选，所述检测试剂中还包含反应用缓冲液。
优选，所述检测试剂中还包含报告探针或者指示分子。
在本发明的一个实施例中，所述报告探针是荧光标记的与基因RPS3的DNA 链部分互补的寡核苷酸。优选，所述报告探针的5’端有荧光标签，3’端相应具有荧光淬灭标签；或者，所述报告探针的5’端有荧光淬灭标签，3’端相应具有荧光标签。
在本发明的一个实施例中，所述指示分子是可以结合双链DNA的荧光物质，例如SYBR Green I。
在本发明的一种实施方式中，所述检测试剂能够通过碱基互补反应定量或定性检测基因RPS3或其mRNA。在本发明的一个具体实施例中，所述检测试剂包含能与基因RPS3发生杂交反应的核酸探针。在本发明的一个具体实施例中，所述检测试剂包含能与基因RPS3的mRNA发生杂交反应的核酸探针。
优选，所述核酸探针上进一步结合指示分子。
在本发明的又一种实施方式中，所述检测试剂能够通过抗原-抗体结合反应定量或定性检测基因RPS3编码的蛋白或蛋白片段，其含有能够特异性结合基因 RPS3编码的蛋白或蛋白片段的抗体，优选所述抗体为单克隆抗体。
在本发明中，能检测抗原-抗体结合反应的方法，包括但不限于：酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法、夹心法、免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫组织化学染色法、荧光免疫分析法、酶基质着色法、抗原抗体聚集法。根据所采用的方法，所述检测试剂中还可以进一步包括其他化学物质。
在本发明的一个实施例中，所述通过抗原-抗体结合反应定量或定性检测的试剂是ELISA试剂，其中包含能够特异性结合基因RPS3编码的蛋白或蛋白片段的第一抗体。
所述第一抗体吸附在固相载体表面。所述固相载体可选用本领域常规使用的固相载体材料，包括但不限于：聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺或纤维素等。固相载体的形式，包括但不限于：多孔板、试管、珠粒等。
所述ELISA试剂中进一步包含结合有指示分子的第二抗体，所述第二抗体可特异性结合RPS3编码的蛋白或蛋白片段，第二抗体和第一抗体所结合的抗原决定簇不同。
优选，所述第一抗体为单克隆抗体。进一步优选，所述第二抗体为单克隆抗体。
当所述指示分子为酶时，所述ELISA试剂中进一步包含酶的底物。优选，所述ELISA试剂中进一步包含酶反应终止液。
所述ELISA试剂中进一步包含稀释液和/或洗涤液。
在本发明的一个实施例中，所述通过抗原-抗体结合反应定量或定性检测的试剂是免疫印迹试剂，其中包含能够特异性结合基因RPS3编码的蛋白或蛋白片段的第一抗体。
所述第一抗体可进一步结合指示分子。
当所述第一抗体未结合指示分子时，所述免疫印迹试剂可进一步包含结合有指示分子的第二抗体，所述第二抗体可以结合所述第一抗体；或者，所述免疫印迹试剂可进一步包含结合有指示分子的IgG结合蛋白，例如蛋白A。
优选，所述第一抗体为单克隆抗体。进一步优选，所述第二抗体为单克隆抗体。
所述免疫印迹试剂中进一步包含用于电泳分离蛋白的试剂。
所述免疫印迹试剂中进一步包含用于蛋白印迹(或称为蛋白转膜)的试剂。
在本发明中，所述指示分子可以是例如：荧光物质、放射性物质和/或酶等。
所述酶可选用本领域常用的酶，包括但不限于：过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。可采用本领域已知的交联法，将酶标记到抗体上，包括但不限于：戊二醛法和过碘酸盐氧化法等。
所述荧光物质可选用本领域已知和常用的各类荧光物质，包括但不限于：异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、Cy3，Cy5、 DyLight 405、DyLight 488、DyLight 550、DyLight594、DyLight 633、DyLight650、 DyLight 680、DyLight755、DyLight800、SYBR Green I等。
在本发明中，可以采用本领域已知的核酸探针和引物序列的设计方法，根据基因RPS3的序列或者其mRNA的序列，设计并合成所述的核酸探针或引物序列，例如采用本领域已知的设计软件包括但不限于Oligo、PrimerPremier、DNA man等。
在本发明中，可以采用本领域中已知的各种方法进行抗体(例如单克隆抗体)的设计和制备，包括但不限于，抗原免疫法、杂交瘤技术、噬菌体展示库技术等。
根据本发明，所述诊断试剂可以试剂盒的形式提供。所述试剂盒中包括盛装所述检测试剂的一个容器或多个容器。
根据本发明，所述试剂盒还包含使用所述试剂盒的指导材料，例如说明书。
一种肝癌预后判断的诊断试剂盒，其特征在于，包含能检测基因RPS3或其 mRNA或其所编码的蛋白质或蛋白片段的检测试剂。
优选，所述诊断试剂盒中包括盛装所述检测试剂的一个容器或多个容器。
优选，所述诊断试剂盒还包含使用所述诊断试剂盒的指导材料，例如说明书。
在本发明的一种实施方式中，所述检测试剂能够通过聚合酶链式反应定量或定性检测所述基因RPS3或其mRNA。在本发明的一个具体实施例中，所述检测试剂包含能特异性扩增基因RPS3的引物。在本发明的另一个实施例中，所述检测试剂包含能反转录基因RPS3的mRNA的引物，例如所述引物为：RPS3-RT-F: GCCAAAGGCTGCGAGGTTGTGGTGTCTG；RPS3-RT-R:GCGGCTCTGG CTTCCCACCC TTCTGTTC。
优选，所述检测试剂中还包含DNA聚合酶，例如：Tag聚合酶。
优选，所述检测试剂中还包含dNTP。
优选，所述检测试剂中还包含反应用缓冲液。
优选，所述检测试剂中还包含报告探针或者指示分子。
在本发明的一个实施例中，所述报告探针是荧光标记的与基因RPS3的DNA 链部分互补的寡核苷酸。优选，所述报告探针的5’端有荧光标签，3’端相应具有荧光淬灭标签；或者，所述报告探针的5’端有荧光淬灭标签，3’端相应具有荧光标签。
在本发明的一个实施例中，所述指示分子是可以结合双链DNA的荧光物质，例如SYBR Green I。
在本发明的一种实施方式中，所述检测试剂能够通过碱基互补反应定量或定性检测基因RPS3或其mRNA。在本发明的一个具体实施例中，所述检测试剂包含能与基因RPS3发生杂交反应的核酸探针。在本发明的一个具体实施例中，所述检测试剂包含能与基因RPS3的mRNA发生杂交反应的核酸探针。
优选，所述核酸探针上进一步结合指示分子。
在本发明的又一种实施方式中，所述检测试剂能够通过抗原-抗体结合反应定量或定性检测基因RPS3编码的蛋白或蛋白片段，其含有能够特异性结合基因 RPS3编码的蛋白或蛋白片段的抗体，优选所述抗体为单克隆抗体。
在本发明的一个实施例中，所述能够通过抗原-抗体结合反应定量或定性检测的试剂是ELISA试剂，其中包含能够特异性结合基因RPS3编码的蛋白或蛋白片段的第一抗体。
所述第一抗体吸附在固相载体表面。
所述ELISA试剂中进一步包含结合有指示分子的第二抗体，所述第二抗体可特异性结合RPS3编码的蛋白或蛋白片段，第二抗体和第一抗体所结合的抗原决定簇不同。
优选，所述第一抗体为单克隆抗体。进一步优选，所述第二抗体为单克隆抗体。
当所述指示分子为酶时，所述ELISA试剂中进一步包含酶的底物。优选，所述ELISA试剂中进一步包含酶反应终止液。
所述ELISA试剂中进一步包含稀释液和/或洗涤液。
在本发明的一个实施例中，所述能够通过抗原-抗体结合反应定量或定性检测的试剂是免疫印迹试剂，其中包含能够特异性结合基因RPS3编码的蛋白或蛋白片段的第一抗体。
所述第一抗体可进一步结合指示分子。
当所述第一抗体未结合指示分子时，所述免疫印迹试剂可进一步包含结合有指示分子的第二抗体，所述第二抗体可以结合所述第一抗体；或者，所述免疫印迹试剂可进一步包含结合有指示分子的IgG结合蛋白，例如蛋白A。
优选，所述第一抗体为单克隆抗体。进一步优选，所述第二抗体为单克隆抗体。
所述免疫印迹试剂中进一步包含用于电泳分离蛋白的试剂。
所述免疫印迹试剂中进一步包含用于蛋白印迹(或称为蛋白转膜)的试剂。
本发明中的术语说明：
在本发明中，由于基因RPS3具有多个可变的剪接转录变体，因此其mRNA 包含所述不同的剪接转录变体的序列，基因RPS3编码的蛋白也包括该蛋白的不同亚型。
术语“结合剂”、“结合分子”和“结合实体”是同义的，可以互换使用。在本发明的上下文中，结合剂结合、识别所述的基因、蛋白或蛋白片段，与之相互作用、反应或以别的方式发生关联。示例性结合剂可以包括但不限于抗体或其片段、抗原、适配体、核酸(例如DNA和RNA)、蛋白质(例如受体、酶、酶抑制剂、酶底物、配体)、肽、凝集素、脂肪酸或脂质和多糖。例如，在本发明的一些实施例中，结合剂包括抗体或其片段、核酸(例如DNA和RNA)。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核酸”是指由两个或更多个，优选地超过三个并且通常超过十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子。精确的大小将取决于许多因素，其继而取决于寡核苷酸最终的功能或用途。寡核苷酸可以以多种方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。本发明中的核酸含有2-100个核苷酸。
本文中术语“核苷酸”和“碱基”可以互换使用，是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以及任何其他经修饰的/未经修饰的嘌呤/嘧啶碱基的N-糖苷。所述嘌呤或嘧啶可以是但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或尿嘧啶，以及其他经修饰的、非标准或衍生的碱基。
术语“抗体”以最宽泛的意义使用，具体地涵盖合成抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、灵长类化抗体、Fab片段、F(ab') 片段、单链FvFc(scFvFc)、单链Fv(scFv)、抗独特型(抗Id)抗体和任何其他免疫活性抗体片段，只要它们展示出所希望的生物活性(即，标记相关或结合)即可。在更广的意义上，本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子(即，含有抗原结合部位的分子)的免疫活性片段，其中这些片段可以或可以不与另一个免疫球蛋白结构域(包括但不限于Fc区或其片段)融合。此外，如在此更详细地概述的，术语抗体和多种抗体具体地包括Fc变体或其片段，包括全长抗体和包含Fc区的变体Fc-融合物，其任选地包含至少一个氨基酸残基修饰并且与免疫球蛋白的免疫活性片段融合。
分子的“片段”意思是指分子的任何连续多肽或核苷酸子集。例如跨膜蛋白的片段可以包括仅包含胞外结构域或其某个部分的构建体。
术语“受试者”或“患者”可互换使用，包括但不限于人、非人类动物，例如非人灵长类如黑猩猩和其他猿类和猴种类；农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养受试者如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠，等等。该术语不指示具体的年龄或性别。
术语“诊断剂”和“诊断试剂”的含义相同，是指用于诊断疾病或失调目的的任何分子、化合物、和/或物质。在优选的实施例中，诊断试剂应当包含与报告分子结合的结合剂。诊断试剂的其他非限制性实例包括抗体、抗体片段、或其他蛋白质。术语“指示分子”或“报告分子”是指通过本领域技术人员可获得的任何方法学可检测的任何分子、化合物、和/或物质，非限制性实例包括酶、染料、荧光标记、气体、金属、或放射性同位素。
术语“受试化学物质”是指被测定活性的化学物质，包括但不限于小分子化合物，核酸(DNA或RNA)，蛋白质或多肽(例如配体、抗体、融合蛋白等)，多糖等。
术语“抑制”是指与没有抑制剂的情况相比，基因的表达量下降，或者蛋白质或细胞的活性或功能降低。在一些实施方式中，术语“抑制”是指基因的表达量下降或蛋白质或细胞的活性或功能降低至少约25％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。在其它实施方式中，抑制是指基因的表达量下降或蛋白质或细胞的活性或功能降低约25％至约 50％、约50％至约75％、或约75％至100％。在一些实施方式中，抑制是指基因的表达量下降或蛋白质或细胞的活性或功能降低约95％至100％，例如活性降低 95％、96％、97％、98％、99％、或100％。在本发明中，细胞的活性或功能，包括但不限于：细胞的增殖能力，细胞的克隆形成能力，细胞的迁移能力等。可使用多种本领域技术人员公知的技术来测量这样的降低。
术语“表达”和“基因表达”含义相同，是指细胞在生命过程中，把储存在DNA 顺序中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
术语“表达增高”和“高表达”、“过表达”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数增高，和/或翻译增高。根据本发明，基因转录的拷贝数增高，和/或翻译增高是超过正常水平至少1.3倍，例如，至少2、3、4、5、10、20或更多倍。
附图说明
图1：HepG2细胞的450nm处吸光值图。与对照组相比，RPS3低表达的细胞培养后450nm处吸光值明显降低，说明其增殖能力降低。其中*表示：p<0.05；** 表示：P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
图2：HepG2细胞的克隆形成数统计图。与对照组相比，RPS3低表达的细胞培养后，克隆形成数明显降低，说明其克隆形成能力降低。其中*表示：p<0.05； **表示：P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
图3：HepG2细胞的侵袭细胞数统计图。与对照组相比，RPS3低表达的细胞培养后，侵袭细胞数明显降低，说明其迁移能力降低。其中*表示：p<0.05；** 表示：P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
图4：HepG2细胞中EMT标志基因的相对表达量统计图。其中*表示：p<0.05； **表示：P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
图5：SMMC-7721细胞和敲低RPS3后的SMMC-7721细胞在裸鼠体内种植后肿瘤生长结果图。上图为4周后，对照组和敲低RPS3组的肿瘤照片；左下图为4 周后，对照组和敲低RPS3组的肿瘤重量统计图；右下图为对照组和敲低RPS3组的肿瘤体积随时间变化的统计图。其中*表示：p<0.05；**表示：P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
图6：HepG2细胞和SMMC-7721细胞用FMHM处理或未处理的RPS3相对表达量。其中*表示：p<0.05；**表示：P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
图7：HepG2细胞用FMHM处理或未处理的450nm处吸光值、细胞周期分布、克隆形成数和伤口开放率统计图。其中*表示：p<0.05；**表示：P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
图8：SMMC-7721细胞用FMHM处理或未处理的450nm处吸光值、细胞周期分布、克隆形成数和伤口开放率统计图。其中*表示：p<0.05；**表示：P<0.01； ***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
图9：成瘤裸鼠用FMHM处理或未处理后，肿瘤重量和肿瘤体积统计图。其中*表示：p<0.05；**表示：P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
图10：HepG2细胞和SMMC-7721细胞，过表达RPS3，用FMHM处理后，细胞在450nm处吸光值、克隆形成数和伤口开放率统计图。其中*表示：p<0.05；** 表示：P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。需要说明的是，实施例不能作为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在本发明的保护范围之内。
以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。所用细胞均来自于中国科学院上海细胞库。
1、Q-PCR实验方法：
将100毫克组织或细胞加入1毫升的TRIzol(Invitrogen)试剂，反复研磨；颠倒混匀后，室温静置5分钟；上层水相转移到新管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时；12000rpm离心15分钟；轻轻倒掉上清，留取沉淀，加入预冷的75％的乙醇振荡洗涤RNA沉淀一次；7500rpm离心5分钟；小心倒掉上清，取沉淀置于超净工作台开风机吹干约30分钟；加入20μL的DEPC水溶解，在 55-60℃孵育10分钟助溶。
按照Takara反转录试剂盒的方法将RNA转录出cDNA；反转录的cDNA采用 Bio-Rad的IQTM SYBRR Green Supermix的试剂盒，按照其说明，配制PCR反应液，在ABI-7500上分析；用2-ΔΔCt法计算基因相对表达值。
所用的引物：
RPS3-RT-F:GCCAAAGGCTGCGAGGTTGTGGTGTCTG
RPS3-RT-R:GCGGCTCTGG CTTCCCACCC TTCTGTTC
GAPDH-RT-F:AAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTG
GAPDH-RT-R:CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGGATT
2、Western blotting方法
100mg组织或细胞加入RIPA裂解液(10×cocktail)，匀浆后置于冰上30分钟，中间振荡几次；12000rpm离心5分钟，取上清，测蛋白浓度；将含有等量蛋白的样品加入10％的SDS-PAGE胶上，进行电泳1.5小时；电泳结束后，转膜2小时；转膜结束，将膜置于含5％脱脂牛奶的TBST中室温封闭1小时；TBST洗膜3 次，每次10分钟，加入RPS3的抗体4℃孵育过夜。
第二天，TBST洗膜3次，每次10分钟；加入荧光标记的DylightTM二抗室温避光孵育1小时；将膜置于奥德赛的近红外扫描仪成像。
3、慢病毒的包装及感染方法
参考第四版的Molecular Cloning。
转染前一天进行293T细胞铺板，密度大约为2～2.5×106细胞/10cm皿；转染前，细胞密度达到80％～90％。脂质体法转染293T细胞，将构建好的携带目的片段(过表达或者敲低目的基因的序列)的慢病毒载体PHBLV和辅助质粒(pSPAX2 和pMD2G)按照3：2：1比例进行共同转染，转染后6h更换新鲜培养基。转染24h 后对293T进行再次换液，富集病毒。48h后收集上清(含病毒)，0.45μm滤膜过滤至目的细胞中，加入polybrene促进病毒感染。感染24h后更换新鲜培养基。细胞长满时进行正常传代培养，用0.5-1μg/ml puromycin进行持续筛药，构建病毒稳定株，用于后续细胞功能实验及裸鼠皮下成瘤实验。
所用的过表达序列为:NCBI Reference Sequence:NM_001256802.1
所用敲低目的基因的shRNA序列为：GTGGAACCCAAAGATGAGAT。
4、细胞活性检测方法
采用CCK-8(东仁化学科技(上海)有限公司)试剂盒，按照试剂盒说明书操作。细胞接种在96孔板上，1×103个细胞/孔，37℃孵育。转染后0h，24h，48h， 72h和96h测增殖曲线，使用Genetix的CloneSelect成像系统进行定量分析。每个点设4个复孔，用均值±S.D表示，每个实验重复三次。
5、检测克隆形成的方法
参考以下文献中记载的方法：Luan F,Liu H,Gao L,Liu J,Sun Z,Ju Y,et al.Hepatitis B virus protein preS2 potentially promotes HCC development via itstranscriptional activation of hTERT.Gut 2009；58:1528-1537。
将约1.5×104个细胞接种在六孔板中并培养2周。将菌落用龙胆紫染色并在显微镜下计数。每个实验分析三到五个孔。
6、检测细胞周期的方法
胰酶消化收取不同处理的细胞，用PBS洗三遍，75％的乙醇-20℃固定过夜。然后，用2.5μL10mg/ml的RNase A(Fermentas)37℃孵育30分钟，300μLPBS重悬后，暗处PI染色30分钟，上BD公司的FACSan的流式细胞仪检测。所有的实验至少进行三次以上。
7、检测伤口愈合的方法
参考以下文献中记载的方法：Saxena NK,Sharma D,Ding X,Lin S,Marra F,Merlin D,et al.Concomitant activation of the JAK/STAT,PI3K/AKT,and ERKsignaling is involved in leptin-mediated promotion of invasion and migrationof hepatocellular carcinoma cells.Cancer Res 2007；67:2497-2507。
以合适的密度把细胞接种在6孔板的培养皿中，当细胞生长到95％密度时。使用无菌移液管尖端在细胞层上进行1mm宽的划痕后，1×PBS清洗3～5遍，显微镜下拍照，依次记录0h，24h，48h及96h细胞划痕的闭合的程度。所有实验至少进行三次以上。
8、检测小孔迁移率(transwell迁移率)的方法
参考以下文献中记载的方法：Tanaka S,Pero SC,Taguchi K,Shimada M, MoriM,Krag DN,et al.Specific peptide ligand for Grb7 signal transduction proteinand pancreatic cancer metastasis.J Natl Cancer Inst 2006；98:491-498。
我们使用改良的Boyden小室和24孔板，其含有涂覆有纤连蛋白 (CollaborativeBiomedical Products，Bedford，MA)的聚对苯二甲酸乙二醇酯滤器插入物(8-μm孔)。首先，将1×104细胞悬浮在无血清培养基中并置于上室中，然后下室加入含10％FBS的完全培养基。孵育24小时后，取出小室，用枪头吸取并弃除小室中的培养液，PBS轻柔洗涤两次后用棉签擦去小室内未迁移的细胞，4％多聚甲醛固定10min，0.1％结晶紫染色15min，清水洗掉多余染色液后风干。取小室底部，用中性树胶固定切片后显微镜下拍照随机选取五个视野，计算穿过小室底膜的细胞数目，以此来评估细胞的迁移率。
实施例1RPS3过表达或敲低对肝癌细胞功能的影响
采用HepG2和SMMC7721两种肝癌细胞系，从细胞系水平上将RPS3敲低，验证RPS3在肝癌细胞增殖、迁移、侵袭、EMT及克隆形成能力等方面的作用。
结果描述：
我们将RPS3的腺病毒sh-RNA转到了HepG2细胞里，敲低效果经Q-PCR和 Westernblot方法验证，证明在相应的细胞中实现了对RPS3表达的敲低。
以正常的HepG2细胞为对照组，以敲低RPS3的HepG2细胞为试验组，对两组细胞进行培养后，进行细胞增殖、克隆形成、细胞周期、伤口愈合、小孔迁移率的检测。
细胞增殖能力和克隆形成的结果见图1和图2。从图1可见，培养24小时后，敲低RPS3的HepG2相比正常细胞，450nm处的吸光度降低，并具有显著差异，这种差异随着培养时间的延长而增大。说明敲低RPS3的HepG2细胞的增殖能力降低。从图2的统计结果可见，敲低RPS3的HepG2的克隆数约为正常细胞的克隆数的一半，说明敲低RPS3后，细胞的克隆形成能力降低。
流式检测发现敲低细胞的40％处于G1期、30％处于G2/M期，30％处于S期，而非敲低细胞的对应数据分别为39％、19％、42％，说明敲低细胞的细胞周期阻止在G1期。
用细胞划痕方法检测细胞的伤口愈合能力，发现细胞培养24小时后，敲低细胞的伤口愈合能力就低于非敲低细胞，且具有显著性差异。随着细胞培养时间的延长，伤口愈合能力差异越来越明显。
细胞迁移能力的实验结果见图3，RPS3敲低的HepG2细胞的小孔迁移细胞数约为正常细胞的三分之二，表明RPS3敲低后抑制了HepG2细胞的细胞迁移能力。
EMT(上皮细胞-间充质转化)是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，其相关代表性的蛋白为E-cadherin、β-catenins、 Fibronectin、N-cadherin、Vimentin、ZEB1和ZEB2，指示着肿瘤进展。Q-PCR检测结果见图4，RPS3敲低的HepG2细胞，其上皮细胞标志基因E-cadherin和β -catenins表达增高，而间充质细胞标志基因Fibronectin、N-cadherin、Vimentin、 ZEB1和ZEB2表达降低，说明RPS3的敲低能够影响肝癌的进展。
在SMMC7721细胞系中，采用同样的实验方法敲低RPS3，并进行细胞增殖、克隆形成、细胞周期、伤口愈合、小孔迁移率的检测。与在HepG2细胞系中观察到的现象一致，与未敲低RPS3的SMMC7721相比，敲低RPS3后SMMC7721细胞的增殖能力、克隆形成能力、伤口愈合能力、细胞迁移能力都明显降低，细胞周期被阻止在G1期。
实施例2裸鼠模型中敲低RPS3对肿瘤生长的影响
每组实验使用6只BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄)，分别进行敲低RPS3的 SMMC-7721细胞和正常SMMC-7721细胞的皮下注射，从动物层面上观察RPS3 对成瘤性的影响，并将成瘤组织进行免疫组化分析，检测RPS3的表达。
收集RPS3敲低病毒稳定株细胞，以3×106细胞/老鼠/天的量，皮下注射，持续2周，观察肿瘤的大小，并用卡钳测量。4周后，处死老鼠，取出肿瘤进行免疫组化分析。
裸鼠的肿瘤组织经过62℃2小时脱蜡和脱水后，在柠檬酸盐缓冲液97℃20分钟，进行抗原修复，3％H2O2室温10分钟阻断内源性的过氧化物酶，含5％正常山羊血清的PBST中室温孵育1小时阻断非特异性蛋白结合位点，加入相应的一抗 RPS3和Ki-67孵育4℃过夜；清洗片子后，加入HRP标记的二抗，然后DAB显色，用image Pro-Plus(IPP)分析处理染色密度。
结果显示：敲低RPS3的SMMC-7721细胞组的裸鼠，肿瘤生长明显低于对照组(正常SMMC-7721细胞的皮下注射)，大约22天后，敲低组的肿瘤重量和肿瘤体积均约为对照组的三分之一，说明敲低RPS3显著抑制了SMMC-7721在裸鼠内的肿瘤发生(图5)。
Ki-67是一种增殖细胞相关的抗原，它是判断肿瘤细胞增殖情况的一个指标，其在肿瘤组织中的含量越高表示肿瘤细胞增殖多，恶性程度越高。免疫组化结果显示，敲低RPS3后，与对照组比较，肿瘤组织的Ki-67着色率下降，提示肿瘤的增殖力下降。
实施例3FMHM对RPS3的表达及肝癌细胞功能的影响
将SMMC-7721细胞和HepG2细胞分别以1×104细胞/孔进行铺板，待细胞贴壁后，梯度给药处理。DMSO配置FMHM的储液，之后用单纯培养基进行逐步稀释。FMHM的药物浓度梯度依次为1000μM、250μM、62.5μM、15.625 μM、3.906μM、0.977μM、0.244μM、0.061μM、0.0152μM、0.0038 μM、0.000954μM。48小时后，绘制细胞生长曲线。根据浓度和细胞存活率计算FMHM的IC50(half maximal inhibitory concentration，半抑制浓度)，得到不同细胞系FMHM的最适使用浓度：SMMC-7721细胞为32.42μM，HepG2细胞为 15.8μM，以该浓度作为后续的实验剂量。
用不同浓度的FMHM处理不同的肝癌细胞，48小时后，用培养基清洗掉 FMHM，并更换培养基继续培养，按照前述方法，检测细胞中RPS3的表达水平、细胞增殖、克隆形成、细胞周期、伤口愈合、小孔迁移率。
结果显示，FMHM处理后，肝癌细胞中RPS3的基因表达被抑制，与对照组相比有显著性差异(图6)。同时，FMHM在SMMC-7721细胞和HepG2细胞中，均抑制了细胞增殖、克隆形成、伤口愈合能力、细胞迁移能力，并有显著的细胞周期阻滞性(图7和图8)。
实施例4FMHM对裸鼠皮下成瘤能力的影响
在动物层面上，在RPS3过表达形成肿瘤的基础上，给药FMHM一定时间后，肿瘤的体积明显缩小。
如前实验方法，每组实验使用6只BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄)，先将稳定过表达RPS3的SMMC-7721细胞皮下注射，待肿瘤长到100-200mm3后分组， FMHM处理组行FMHM腹腔注射(15mg/kg)，对照组使用溶剂，按照相等体积进行同样的皮下注射操作，2次/周，持续3-4周。观察两组的肿瘤大小，并用卡钳测量。
4周后，测量肿瘤体积和重量，结果显示，FMHM处理组的肿瘤体积和重量约为对照组的二分之一。说明FMHM处理后可明显降低肿瘤的重量和体积(图 9)。
实施例5FMHM的抗肿瘤效应可被RPS3过表达所逆转
采用前述相同方法，建立过表达PRS3的SMMC-7721细胞和HepG2细胞，对于每种细胞分别设立对照组、FMHM实验组和PRS3干扰组，其中对照组采用正常细胞，用溶剂进行处理；FMHM实验组采用正常细胞，对SMMC-7721细胞用 32.42μM的FMHM处理，对HepG2细胞用15.8μM的FMHM处理；PRS3干扰组，采用过表达RPS3的细胞，对SMMC-7721细胞用32.42μM的FMHM处理，对 HepG2细胞用15.8μM的FMHM处理。处理48小时后，用培养基清洗掉FMHM，并更换培养基继续培养，按照前述方法，检测细胞中RPS3的表达水平、细胞增殖、克隆形成、细胞周期、伤口愈合、小孔迁移率。
与对照组相比，FMHM实验组中，RPS3的表达量降低，细胞增殖、克隆形成能力、伤口愈合能力均被抑制。与对照组和FMHM实验组相比，RPS3干扰组中，RPS3的表达量增加，细胞增殖、克隆形成能力、伤口愈合能力均增强(图 10)。说明RPS3过表达后，再用FMHM处理细胞，FMHM对肿瘤细胞RPS3表达的抑制作用、细胞增殖的抑制作用、伤口愈合能力的抑制作用、克隆形成的抑制作用，均出现降低。

Claims (14)

1.RPS3抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的用途，所述抑制剂是基因RPS3的mRNA的shRNA，其干扰的靶向序列为：GTGGAACCCAAAGATGAGAT，或，所述抑制剂是式I化合物
Figure FDA0003703099030000011
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物中含有药学上可接受的载体。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型选自口服剂，注射给药的剂型。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物中RPS3抑制剂占药物的质量百分比为10％-90％。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物中RPS3抑制剂占药物的质量百分比为20％-80％。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物中RPS3抑制剂占药物的质量百分比为30％-70％。
7.如权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于，所述药物可以和治疗肝癌的其他药物联合应用。
8.如权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于，所述药物可以和治疗肝癌的其他治疗手段联合应用。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述治疗肝癌的其他药物选自：三氧化二砷、5-FU、氟尿嘧啶脱氧核苷、去氧氟尿苷、替加氟、阿霉素、表柔比星、吡柔比星、顺铂、卡铂、草酸铂、奥沙利铂、贝伐单抗、西妥昔单抗、索拉菲尼、厄洛替尼、舒尼替尼和/或拉帕替尼。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述其他治疗手段选自放疗和/或手术切除。
11.如权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于，所述肝癌是块状型肝癌、结节型肝癌、或弥漫型肝癌。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述肝癌是肝细胞癌、肝内胆管细胞癌、或混合型肝癌。
13.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述肝癌是高分化、中分化、或低分化的肝癌。
14.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述肝癌是TNM分期为I期、II期、IIIa期、IIIb期、IIIc期或IV期的肝癌。
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