JP2022513375A - NAMPTi感受性のバイオマーカーとしてのPPM1D変異の同定法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の下で、2018年10月22日に出願された米国仮特許出願第62/748,911号に対する優先権を主張するものであり、その出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
プロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D (PPM1D) 遺伝子は、Wip1としても公知であり、主にDNA損傷応答 (DDR) および細胞チェックポイント経路に関与する多くのタンパク質を脱リン酸化するセリン/スレオニンホスファターゼをコードする。20年以上前に発見されて以来、PPM1Dは十分に確立されたがん遺伝子となっており、乳がん、卵巣がん、消化器がん、および脳がんを含む多様な範囲のがんで増幅または過剰発現されて見出される。その後、PPM1DのC末端における切断変異が、一部のがんにおいて、最も注目すべきはびまん性内在性橋膠腫 (DIPG) を含む小児神経膠腫において、同定された。これらの変異は、PPM1Dのタンパク質安定性を著しく強化し、これは同様にそのホスファターゼ活性を高める。PPM1Dの細胞機能の特徴付けにもかかわらず、腫瘍形成におけるその役割については、まだ理解されていないことが数多くある。さらに複雑なことに、PPM1D切断型変異を含む同質遺伝子的なグリア細胞株が存在せず、その発がん性の役割を調べる能力が限定される。最後に、いくつかのPPM1D阻害剤が実験ツールとして開発されてきたが、そのインビトロでの成功はまだ臨床に結びついていない。がんを処置するために使用できる新規の化合物および組成物が、当技術分野において必要である。本開示は、この必要性に対処するものである。
本発明は、一部には、PPM1D活性のレベルが上昇したがんをNAMPT阻害剤で効果的に処置することができるという予想外の発見に関する。理論によって制限されることは望まないが、本明細書で提示されるデータにより、これは、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAPRT) をサイレンシングすることにより、細胞においてNADを産生するための主要な経路の1つが遮断されることに起因し得ることが示される。このことから、NADを産生するためのNAMPT経路は細胞の生存に不可欠となり、そのため、この経路を阻害することで、NAPRTに関連したNAD産生に依存できる非がん性細胞を残しながら、依存できないがん細胞を選択的に死滅させることができる。
特に定義されない限り、本明細書で用いられる専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は記載されるものである。本明細書で用いられる場合、以下の用語はそれぞれ、この項でそれに関連付けられる意味を有する。
SEQ ID NO:15
を有するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子またはタンパク質を指す。
SEQ ID NO:16
を有するプロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D遺伝子またはタンパク質を意味する。
理論によって制限されることは望まないが、本発明は、一部には、実施例1および図1A~4Dに示されるように、プロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D (PPM1D) のレベルの上昇を示すがんが、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAMPT) 阻害剤による処置に感作されるという予想外の発見に基づく。したがって、1つの局面において、本発明は、少なくとも1種類のNAMPT阻害剤の有効量を対象に投与し、それによってがんを処置する段階を含む、対象のがんを処置する方法であって、対象のがんから採取された生検試料においてPPM1Dが上昇している、前記方法を提供する。
投与計画は、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。治療用製剤は、本発明において企図される疾患または障害が発症する前または後のいずれかに、対象に投与することができる。さらに、いくつかの分割投与量および時差投与量を毎日もしくは逐次的に投与してもよく、または用量は連続注入してもよいし、もしくはボーラス注射であってもよい。さらに、治療用製剤の投与量は、治療状況または予防状況の緊急性によって示されるように、比例して増減させることができる。
経口適用には、錠剤、糖衣錠剤、液剤、液滴剤、坐剤、またはカプセル剤、カプレット剤、およびゲルカプセル剤が特に適している。経口使用が意図される組成物は、当技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、錠剤の製造に適した不活性で非毒性の薬学的賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数の作用物質を含み得る。そのような賦形剤には、例えば、不活性希釈剤、例えばラクトースなど;造粒剤および崩壊剤、例えばトウモロコシデンプンなど;結合剤、例えばデンプンなど;ならびに滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムが含まれる。錠剤はコーティングしなくてもよいし、または外観を美しくするためもしくは活性成分の放出を遅延させるために公知の技法によってコーティングしてもよい。経口使用のための製剤はまた、活性成分が不活性希釈剤と混合された硬ゼラチンカプセルとして提示されてもよい。
本明細書で用いられる場合、薬学的組成物の「非経口投与」には、対象の組織の物理的突破および組織内の突破口を通した薬学的組成物の投与を特徴とする任意の投与経路が含まれる。したがって、非経口投与には、組成物の注射、外科的切開を通した組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷を通した組成物の適用等による薬学的組成物の投与が含まれるが、これらに限定されない。特に、非経口投与は、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉注射内、胸骨内注射、および腎臓透析注入技法を含むがそれらに限定されないことが企図される。
本発明の付加的な剤形には、米国特許第6,340,475号;第6,488,962号;第6,451,808号;第5,972,389号;第5,582,837号;および第5,007,790号に記載される剤形が含まれる。本発明の付加的な剤形には、米国特許出願第20030147952号;第20030104062号;第20030104053号;第20030044466号;第20030039688号;および第20020051820号に記載される剤形もまた含まれる。本発明の付加的な剤形には、PCT出願番号 WO 03/35041;WO 03/35040;WO 03/35029;WO 03/35177;WO 03/35039;WO 02/96404;WO 02/32416;WO 01/97783;WO 01/56544;WO 01/32217;WO 98/55107;WO 98/11879;WO 97/47285;WO 93/18755;およびWO 90/11757に記載される剤形もまた含まれる。
ある特定の態様において、本発明の製剤は、短期放出製剤、急速オフセット放出製剤、ならびに制御放出製剤、例えば、持続放出製剤、遅延放出製剤、およびパルス放出製剤であってよいが、それらに限定されない。
約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分、およびこれらのうちの任意または全てのものの、全体的または部分的増分までの、ならびに、
約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分、およびこれらのうちの任意または全てのものの、全体的または部分的増分を含む、
任意の期間を指す。
本発明の化合物の治療有効量または用量は、患者の年齢、性別、および体重、患者の現在の医学的状態、ならびに本発明において企図される疾患または障害の進行に依存する。当業者は、これらおよびその他の要因に応じて適切な投与量を決定することができる。
hTert/E6/E7不死化ヒトアストロサイトは、Dr. Timothy Chanの研究室から入手したものであり、以前に特性が明らかになっている。特に断りのない限り、アストロサイトは、DMEM、高グルコース (ThermoFisher Scientific/Gibco)+10% FBS (Gibco) 中で、接着性の単層として増殖させた。U2OS細胞はATCCから購入し、DMEM、高グルコース+10% FBS中で増殖させた。MCF7細胞は、10% FBSを添加したRPMI1640 (ThermoFisher Scientific/Gibco) 中で増殖させた。HSJD-DIPG-007、HSJD-DIPG-008、およびSU-DIPG株はすべて、増殖因子:B27サプリメント (Gibco/ThermoFisher))、ヒトEGF (Sigma)、ヒトFGF (Sigma)、ヒトPDGF (Sigma)、ヘパリン (Stemcell Technologies) を添加し、かつ表示の通りにニコチン酸 (Sigma) を添加したまたは添加していないTumor Stem Media Base(DMEM/F12およびNeurobasal培地)中で培養した。
CRISPR/Cas9ゲノム編集は、Cas9 (Addgene #43861) および改変ガイドRNA (gRNA) 構築物 (Addgene #43860) の両方の発現を用いてアストロサイトで行った。PPM1D gRNA配列は表1で入手可能であり、合成してアニーリングし、gRNAプラスミドにライゲーションした。次いで、両構築物をヌクレオフェクション (Lonza) によりアストロサイトに同時トランスフェクトし、細胞を72時間インキュベートした後、回収し単離した。単離されたクローンは、単一細胞希釈アプローチによってもたらされ、96ウェルプレートの個々のウェルから増殖させた。変異PPM1Dの配列および発現に関するクローンのスクリーニングは、以下に記載されるように、高解像度融解解析スクリーニング法を用いて、およびウェスタンブロットブロッティングによって行った。
hWIP1野生型プラスミド (Addgene # 28105)。次いで、PPM1DをhWIP1から改変phCMV1発現構築物にサブクローニングして、PPM1D OEFLを作製した。表1に記載されたプライマーと共に部位特異的変異誘発を用いてこの構築物を改変し、R458fs変異を導入してPPM1D OEtrnc.を作製した。すべての構築物を大腸菌 (E. coli) で増幅させ、MidiPrepキット (Qiagen) を用いて精製し、上記のように細胞株にヌクレオフェクトした。安定的な細胞株をG418 (Gibco/ThermoFisher) で選択し、単一細胞培養物からさらに単離した。hWIP1 D314Aホスファターゼデッド発現構築物 (Addgene # 28106) もまた、上記のように増幅させて精製し、実験前に親アストロサイトにヌクレオフェクトした。NAPRT発現構築物はGenScript (OHu28558D) から購入し、上記のように増幅させて精製した。プラスミドをPPM1Dtrnc.アストロサイトにヌクレオフェクトし、G418で選択し、単一細胞培養物からさらに単離した。
免疫ブロットをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写して解析した。ブロットはすべて、1×TBST (American Bio) 中の5% BSA (Gold Biotechnology) 中でブロッキングし、次いでPPM1D(SCBT F-10 sc-376257、1:1000)、GAPDH (Proteintech group HRP-60004、1:5000)、アクチン(ThermoFisher MA5-11869、1:2000)、γH2AX pS139(CST 2577、1:1000)、NAPRT(Proteintech group 66159-1-Ig、1:2000)、NAMPT(CST 86634、1:1000)、pCHK2 T68(CST 2197、1:1000)、H3K27M(CST 74829、1:1000)、またはp53(CST 9282、1:1000)に対する一次抗体で、4℃で一晩プロービングした。次いで、ブロットを1×TBSTで洗浄し、HRP結合抗マウス二次抗体(ThermoFisher 31432、1:10,000)または抗ウサギ二次抗体(ThermoFisher 31462、1:10,000)と共に室温 (RT) で1時間インキュベートした。免疫ブロットの露光は、Clarity Western ECL基質 (BioRad) を用いて行い、ChemiDoc (BioRad) イメージングシステムで画像化した。示したすべてのウェスタンブロットの、トリミングしていないかつ未処理のスキャンは、ソースデータファイルにおいて入手可能である。
PPM1Dtrnc.アストロサイトを50μg/mLシクロヘキシミドまたは10μM MG132(いずれもSigma)で表示の時間処理した。次いで、細胞を洗浄し、ペレット化し、および溶解して、続いて上記のように免疫ブロッティングアプローチを行った。免疫ブロット強度の定量化は、ImageJソフトウェアを用いて算出し、複数 (n=3) のブロットからなった。細胞の照射は、X-RAD KV照射器 (Precision X-ray) を用いて行い、処理は非分割の10Gy線量からなった。GSK2830371 (Selleckchem) によるPPM1D阻害剤処理は、IRの24時間前の50nM処理からなった。FK866 (Selleckchem)、GPP78 (Tocris Bioscience)、STF118804 (Tocris Bioscience)、STF31 (Tocris Bioscience)、5-アザシチジン (Selleckchem)、およびデシタビン (Selleckchem) は、DMSOに溶解し、表示の通りに処理に使用した。ニコチンアミドリボシド (ChromaDex Inc.) およびニコチンアミド (Sigma) は水に溶解し、一方ニコチン酸 (Sigma) はPBSに溶解した後、表示の通りに単独でまたはFK866と組み合わせて処理を行った。
アストロサイト細胞株を播種し、一晩インキュベートした後に放射線照射した。次いで、表示の時点でプレートを収集し、固定し、透過処理/ブロッキングし、蛍光イメージングのために一次抗体および二次抗体で染色した。固定は、固定用緩衝液(PBS中の4%パラホルムアルデヒドおよび0.02% TritonX100)中での20分間のRTインキュベーションで行った。続いて細胞を1×PBSで洗浄し、その後、インキュベーション緩衝液(PBS中の5% BSAおよび0.5% TritonX100)中で1時間、共有の透過処理およびブロッキング段階を行った。γH2AX pSl39に対する一次抗体 (Millipore 05-636) を、インキュベーション緩衝液で1:1000に希釈して添加し、4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、その後、二次緩衝液(PBS中の0.5% TritonX100)中のalexafluor結合二次抗体(ThermoFisher A21425またはA11029、1:10,000)および核色素である1μg/mL Hoechst 33342 (Sigma) と共に1時間のRTインキュベーションを行った。プレートを再度洗浄し、Cytation3イメージングシステム (BioTek) を用いてPBS中で画像化した。画像はGen5 v2.09ソフトウェア (BioTek) を用いてつなぎ合わせ、CellProfiler画像処理ソフトウェアを用いてフォーカス数および細胞数の両方をカウントした。
不死化ヒトアストロサイト、MCF7、およびU2OS細胞株のインビトロ細胞生存率の評価は、本発明者らのグループによって開発された、以前に記載されたハイコンテント顕微鏡プラットフォームを用いて行った。簡潔に説明すると、細胞を96ウェルプレートに細胞2000個/ウェルの密度でプレーティングし、一晩インキュベートした。薬物処理または媒体 (0.5% DMSO) 対照を施行し、細胞を表示の通り72~96時間インキュベートした。次いで、プレートをPBSで洗浄し、氷冷70%エタノールで4℃で2時間固定した。エタノールを除去した後、プレートを再度PBSで洗浄し、1μg/mL Hoechst 33342 (Sigma) でRTで30分間染色した。Cytation3イメージャー (BioTek) を用いて細胞を画像化し、上記のように画像をつなぎ合わせて解析した。薬物処理条件と媒体処理条件を比較して、生存率評価を行った。SU-DIPGおよびHSJD-DIPG-007スフェロイドの生存率は、製造業者のプロトコールに従ってCytoTox-Glo (Promega) を用いて評価した。スフェロイドはFK866で120時間処理した後、この方法を用いて解析した。IC50の算出は、GraphPad Prismを用いて、[阻害剤]対反応‐可変勾配4パラメータ非線形回帰にデータをフィットさせることにより行った(代表的な図に示される)。
個々のNAPRT標的化siRNAはDharmacon Inc. (Horizon Discovery) に発注し、その標的配列を表1に記載した。合成致死生存率スクリーニングに使用したsiRNAのパネルは、手動選択してDharmacon Inc. に発注し、それぞれが遺伝子当たり最大4つまでの特有なsiRNAを含むON-TARGET plus混合物中に提供した。製造業者のプロトコールに従ってLipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) を用いて、2×105個のアストロサイトに異なるsiRNA(200nM最終濃度)を逆トランスフェクトした。個々のsiRNAについて、細胞を72時間インキュベートし、ペレット化し、および溶解して、免疫ブロッティングを行った。siRNAスクリーニングについては、細胞を24時間インキュベートし、異なる条件のプレートに分割し、そこでさらに24時間インキュベートした。次いで、記載された用量のFK866で細胞を処理し、上記の画像ベースのパイプラインを用いて、薬物処理の72時間後に生存率を評価した。生存率の測定は、各siRNAについて行い、FK866未処理条件に対して正規化した。
NADメタボロームは、LC-MS/MSを用いて、Hypercarbおよび13C代謝物標準物質での2回の分離を用いて、定量的に解析した。その後のNADレベルの解析は、製造業者の仕様書に従ってNAD/NADH定量化キット (Sigma) を用いて行った。
ゲノムDNAをWizardゲノムDNA精製キット (Promega) を用いて精製し、続いて免疫沈降させるかまたはバイサルファイト変換した。免疫沈降アッセイは、推奨されたプロトコールに従ってMe-DIPおよびhMe-DIPキット (Active Motif) を用いて行った。免疫沈降させたDNAをフェノール/クロロホルムで抽出し、以下に記載されるように定量的PCR (qPCR) を用いて解析した。バイサルファイト変換は、EpiMarkバイサルファイト変換キット (NEB) により行った。次いで、修飾されたDNAを、EpiMark Hot Start Taq DNAポリメラーゼ (NEB) を用いて、表1に記載されたプライマーで増幅し、PCR精製キット (Qiagen) で精製した。次いで、NAPRTプロモーターのサンガー配列決定によりメチル化を評価した。全体的5-ヒドロキシメチルシトシンレベルは、製造業者のプロトコールに従って全体的5-hmC定量化キット (Active Motif) により評価した。
mRNA転写物をRNAeasyキット (Qiagen) を用いて細胞から精製し、続いてHigh Capacity cDNA逆転写キット (Applied Biosystems) を用いて逆転写した。PPM1D遺伝子およびNAPRT遺伝子発現レベルは、製造業者のプロトコールに従って、TaqMan蛍光プローブ(いずれもApplied Biosystemsによる):PPM1D (4331182)、NAPRT (4351372)、およびアクチン (4333762F) を用いたqPCRにより評価した。アクチンを参照遺伝子として用いてΔΔCt比較により、発現レベル変化倍率を算出した。NAPRTプロモーター領域は、Fast Start Universal SYBR Green Master with ROX (Roche) および表1に記載されたプライマーを用いるqPCRにより定量化した。qPCR反応はすべて、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム (Applied Biosystems) で実行した。
50~500ngのゲノムDNAをバイサルファイト変換し、製造業者の説明書に従ってIlluminaヒトEPICビーズアレイ (850k) プラットフォームを用いて、ゲノムワイドなメチル化パターンについて解析した。NAPRT特異的プローブについて、Genome Studio v1.9を用いてデータを処理して解析し、下流の解析用にすべてのプローブについてメチル化β値を作成した。全体的な過剰メチル化の評価は、偽発見補正 (FDR) および絶対β値閾値と共にLimma Rパッケージのt検定モデルを用いて行い、PPM1D変異体試料と野生型試料の間でメチル化の差が有意に達したプローブ(有意に可変的なプローブまたはSVPとしても公知である)を同定した。上記のように、データセットから差異に基づいて上位2%の最も可変的なプローブリストを選択して解析し、CpGアイランドプローブおよびΔβ 0.2でフィルターをかけ、同様に処理された公的に利用可能なデータとの比較に使用した。
ChIPアッセイは、ウサギIgG抗体 (CST 2729) を濃縮対照として、ChIP-IT Expressキット (Active Motif) を用いて行った。NAPRTプロモーターのqPCR解析は、上記の通りに行った。使用したChIP抗体:製造業者によって推奨されるChIP用の希釈での、H3K4me1 (Abcam ab8895)、H3K4me3 (CST 9751)、H3K27me3 (CST 9733)、およびH3K27ac(Abcam、ab4729)。
NOD scid γ(NSG、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ雌マウス 3~4週齢)マウスにおいて、アストロサイト異種移植片試験を行った。細胞株異種移植片のために、ホタルルシフェラーゼ(Cellomics Technologyのレンチウイルスプラスミド;PLV-10003)を安定的に発現する5×106個のWTまたはPPM1Dtrnc.アストロサイトを、0.2mLの総量でMatrigel(Corning、47743-722)と混合した。細胞-マトリゲル懸濁液を、剃毛したNSGマウスの右側腹部および左側腹部の両方に皮下注射した。マウスを処置群に無作為に振り分け、腫瘍の量および増殖を、以下に記載されるようにBLI強度により週に1回測定した。FK866は、80mg/mlの濃度でDMSOに可溶化した。次いで、マウスにこの薬物を、10%シクロデキストリン中に20mg/kgで1日2回、4日間腹腔内投与し、これを週1回、3週間繰り返した。処置は、1ヶ月の増殖後に開始した。処置の完了後に腫瘍を摘出し、各腫瘍の質量を測定した。連続移植された異種移植片は、NSGマウスにおいてPPM1Dtrnc.細胞株異種移植片を連続して移植することにより作製した。上記のように、Matrigelを用いて5×106個の細胞の皮下側腹部注射を行った。マウスを処置群に無作為に振り分け、標準的なノギスベースの技法を用いて腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は、長さ×幅2×0.52として算出した。U2OSの異種移植片試験は、胸腺欠損ヌードマウスで行った。5×106個の細胞を各動物の右側腹部に皮下注射し、18日間増殖させてから処置した。マウスを処置群に無作為に振り分け、ノギス測定および体積算出によって腫瘍量を評価した。FK866は上記のように調製して投与した。
生物発光イメージング (BLI) は、製造業者のプロトコールに従ってIVISスペクトラムインビボイメージングシステム (PerkinElmer) を用いて実施した。画像は週に1回撮影し、d-ルシフェリン(l50mg/kg動物体重)の腹腔内注射の15分後に取得した。BLIフラックス(光子/秒)の定量化は、各腫瘍について関心領域 (ROI) を同定し、次いでこれを取り囲み、バックグラウンド補正し、BLIシグナルを測定することによって行った。右側腹部および左側腹部の両方の腫瘍を各マウスについて全体で平均化し、その後、処置群の比較および解析に使用した。代表的な生物発光画像はすべて、標準的な発光スケールを用いて作成し、背景の物体を除去するためにトリミングした。
Pacific Pediatric Neuro-Oncology Consortium (PNOC) NCT02274987試験のデータは、29例の新たに診断されたDIPG症例からのPPM1DおよびNAPRTの発現レベルを含んでいた。RNA配列決定は、製造業者のプロトコールに従ってIllumina HiSeqを用いて行い、転写物の存在量を算出するために使用した。ピアソンの相関rは、GraphPad Prismを用いて算出した。HSJD-DIPG株および付加的なDIPGモデル細胞株のデータは、Affymetrix AgilentおよびIlluminaの発現アレイならびにRNASeqから照合された、以前に公表されたデータセットから取得した。
特に記載のない限り、データはMicrosoft ExcelおよびGraphPad Prismソフトウェアで解析した。2群間の比較には、有意性に関するスチューデントの両側T検定を使用し、*=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001、****=p<0.0001で有意であると記載した。腫瘍増殖曲線を評価するにはマン・ホイットニー検定を使用し、上記と同じ有意性の表記を用いた。カプラン・マイヤープロットによって測定された腫瘍遅延の有意性を評価するには、ログランク(マンテル・コックス)検定を使用した。示されたエラーバーはすべて、特に指示がない限り、平均値の標準偏差である。
PPM1D変異アストロサイトはNAMPT阻害剤に感受性がある
その後の生物学的研究用のPPM1D変異モデルを開発するために、CRISPR/Cas9ゲノム編集を用いて、内因性のPPM1D切断変異 (PPM1dtrncs.) を保有する同質遺伝子的不死化ヒトアストロサイトを作製した。ヘテロ接合性の切断型変異を、DIPGにおいて見られるものと同様のC末端位置において、PPM1D遺伝子座のエクソン6に導入した(図1A)。次いで、単一細胞PPM1dtrnc.クローンを単離し、切断型PPM1Dタンパク質をコードするフレームシフト変異の存在を確認した(図5A)。予測通り、切断型PPM1Dは変異細胞において高発現し(図1B)、野生型 (WT) の全長形態のタンパク質と比較して実質的により長い半減期を維持した(図1Cおよび1D)。PPM1Dタンパク質の安定性の向上は、電離放射線 (IR) への曝露後のウェスタンブロット(図5B)ならびにγH2AXフォーカス形成アッセイ(図1Eおよび図5C)によって測定された、重要なPPM1D標的であるγH2AXおよびpCHK2 (T68) の活発な脱リン酸化によって見られるように、ホスファターゼ活性の増強と相関していた。重要なことには、これらの違いは、PPM1Dの阻害剤として公知のGSK2830371による処理によって消失した(図1F)。
次に、変異PPM1D誘導性のNAMPT阻害剤 (NAMPTi) 合成致死の分子的基盤を調べようとした。NAMPTは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD) を形成するためのニコチンアミド (NAM) のサルベージにおける律速段階を触媒する(図2A)。したがって、この重要な代謝経路の潜在的変動をより良く理解するために、本発明者らのWTおよびPPM1Dtrnc.アストロサイトモデルにおいてNADメタボロームを定量化したいと考えた。PPM1D変異が、NADレベルおよびNADPレベルの顕著な低下を含む、多くのNAD関連代謝物の実質的な減少を誘導することが判明した(図2B、2C;図6A)。これら2つの補助因子の維持は、細胞の生体エネルギーおよび増殖に重要であるため、NAMPT阻害がNADおよびNADPの両方の量ならびに細胞生存率に及ぼす影響を調べた。FK866で処理したWTアストロサイトでは、NADおよびNADPの両方の細胞プールが著しく減少したのに対して、PPM1Dtrnc.細胞ではその減少が顕著により大きく(図2D;図6B)、このことから、変異PPM1Dの設定ではNAMPT活性への依存性が高まっていることが示された。次いで、ニコチンアミドリボシド (NR) がNAMPT阻害を回避し、結果としてPPM1Dtrnc.アストロサイトにおいてNADのレベルを救済できるかどうかを試験した。実際に、NR処理は基礎のNADレベルを十分に上昇させ(図6Cおよび図6D)、PPM1Dtrnc.細胞におけるFK866の細胞毒性効果を完全に軽減した(図2E;補足図6Eおよび図6F)。同様の結果は、NAMの外因的処理でも見られ、これはPPM1Dtrnc.細胞におけるFK866の細胞毒性に強く拮抗した(図6G~6I)。興味深いことに、NAによる外因的処理はFK866誘導性の細胞死を妨げず、このことから、Preiss Handlerサルベージ経路における潜在的代謝障害が示された(図6J~6L)。総合すると、これらのデータから、変異PPM1DはNADメタボロームおよび特にNADレベルの低下を誘導し、これはNAMPT阻害によってさらに増強され得、その結果PPM1D変異細胞の選択的な死滅が生じることが示唆される。
PPM1Dtrnc.細胞におけるNAD枯渇の根本的な原因を理解するために、本発明者らの同質遺伝子的アストロサイトにおいて、NAD合成経路および消費経路に関与する重要な酵素を標的とする集中的合成致死siRNAスクリーニングを行った。FK866感受性をエンドポイントとして用いて、その消失が、変異PPM1DとNAMPT阻害との間で以前に同定された合成致死的相互作用を表現型模写する遺伝子を同定することを目的とした。このスクリーニングから、siRNA媒介性のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAPRT) のノックダウンが、FK866処理に対する親アストロサイト細胞株の重度の感受性を誘導することが判明した(図2F;図7A)。さらなるNAPRT siRNAを用いてこれらの知見を確認し、NAPRTノックダウンの程度とFK866感受性との間の強い相関関係がさらに明らかになった(図7B、図7C)。NAPRTは、NADの産生においてNAMPTと相補的な役割を果たしており、以前の研究では、NAPRT発現とNAMPT阻害剤感受性が逆相関していた。驚くべきことに、NAPRTタンパク質の発現が、本発明者らのPPM1Dtrnc.細胞株ならびにPPM1D過剰発現(OEFLおよびはOE trnc.)細胞株において検出不可能であることが判明した(図2G)。この重大な欠損がNAMPT阻害剤感受性をもたらすかどうかを判定するために、PPM1Dtrnc.細胞にNAPRTを再導入した。NAPRTの安定的な異所性発現は、NAMPT阻害によって起こる細胞毒性を完全に救済し、WT細胞において一般的に見られる抵抗性を反映していた(図2H;図7D、7E)。まとめると、これらの知見から、変異PPM1DがNAPRT発現の消失を駆動し、これが最終的に重度のNAMPT阻害剤感受性を誘導することが示唆される。
次に、変異PPM1DがNAPRT発現を抑制する機構を同定しようとした。WT DIPG株(SU-DIPG-IV、XIII、およびXVII)ではNAPRT mRNAが高発現していたのに対して、試験したすべてのPPM1D変異アストロサイトおよびDIPGモデル(PPM1Dtrnc.、PPM1D0E、およびSU-DIPG-XXXV)では、NAPRT転写物レベルが有意に低下していることが判明し(図3A)、このことから、NAPRT遺伝子の保存された転写抑制の存在が示された。転写サイレンシングはエピジェネティック因子によって制御される場合が多いため、次に、WTおよびPPM1D変異アストロサイトにおいて、NAPRTプロモーターにおける異なるヒストンマークの占有率を調べた。クロマチン免疫沈降 (ChIP) を用いて、PPM1D変異細胞におけるNAPRTの転写抑制が、重要な活性化クロマチンマークであるH3K4me3およびH3K27acの実質的な減少と相関することが判明した(図3B)。H3K4me3およびH3K27acの占有率が低下すると、部位特異的なDNAメチル化が増加し得ることが、以前に示されている。加えて、NAPRTプロモーターは、新規のDNAメチル化を起こしやすいCpGアイランド内に存在する。そこで、変異PPM1Dが、NAPRT遺伝子のプロモーターにおけるDNAメチル化を調節することによりそのサイレンシングを誘導する可能性を考えた。この仮説を試験するため、それぞれMe-DIPアッセイおよびhMe-DIPアッセイを用いて、NAPRTプロモーター内からメチル化シトシン塩基およびヒドロキシメチル化シトシン塩基を免疫沈降させ、定量化した。この研究から、PPM1Dtrnc.アストロサイトのNAPRTプロモーターにおいて、ヒドロキシメチル化ではなくDNAメチル化の顕著な増加が検出された(図3C)。この知見は、本発明者らのアストロサイトおよびDIPGモデルのバイサルファイト変換および配列決定によってさらに確認され、これは、すべてのPPM1D変異細胞株における広範なNAPRTプロモーター過剰メチル化を明らかにした(図3D)。この効果がDIPGおよびアストロサイトモデルに特異的に限定されるかどうかを確かめるため、いずれも内因性のPPM1D変化を含む骨肉腫細胞株U2OS (R458fs) および乳がん細胞株MCF7(PPM1D増幅)において本発明者らの結果を検証した(図9Aおよび9B)。PPM1Dtrnc.アストロサイトと同様に、U2OS細胞およびMCF7細胞において、NAPRTプロモーターの広範な過剰メチル化と一致して、NAPRT転写の実質的な遺伝子サイレンシングが起こることが判明した。(図9Cおよび9D)。さらに、両細胞株は、FK866処理に対して強い感受性を示し、これはPPM1Dtrnc.アストロサイトおよび記載されたその他のPPM1D変異DIPGモデルに匹敵した(図9E)。
次に、変異PPM1D誘導性のNAPRT遺伝子サイレンシングが、局所的な事象であるのか、またはより全体的な現象の一部であるのかを調べた。WTおよびPPM1D変異細胞株の本発明者らのパネル全体において、ならびに3つの付加的なPPM1D変異DIPG株:HSJD-DIPG-007、HSJD-DIPG-008、およびHSJD-DIPG-14b;これらはすべて、NAPRT (27) の発現低下および/またはFK866処理に対する感受性を維持する(図10A~10D)、において、全ゲノムメチル化プロファイリングを行った。IlluminaヒトEPICビーズアレイ (850k) からのメチル化の結果により、試験したすべてのPPM1D変異細胞株にわたるCpGアイランド過剰メチル化の実質的な増加が明らかになった。390個の最も有意な可変プローブ (SVP) のうち、WT細胞株では103個 (26%) しか過剰メチル化されていなかったのに対して、PPM1D変異株(PPM1Dtrnc.、PPM1D0E、SU-DIPG-XXXV、HSJD-DIPG-007、HSJD-DIPG-008、およびHSJD-DIPG-14b)では287個 (74%) が過剰メチル化されていた(図3E)。加えて、その後このデータセットから、NAPRT遺伝子座内の個々のプローブを同定し、解析した。PPM1D変異アストロサイトおよびDIPG培養物では、NAPRTのCpGアイランドプロモーター領域内に存在する7つの部位すべてが重度にメチル化されており、二変量相関解析により、6つの変異細胞のうち5つが、試験したWT株とは別にクラスター化された(図3F)。興味深いことに、HSJD-DIPG-14bでは、NAPRTプロモーター内の全体的なメチル化の程度はより低いにもかかわらず、この株はそれでもなお、前述のSVPにわたって過剰メチル化を示し、全ゲノムメチル化解析ではその他のPPM1D変異株と同様にクラスター化された。注目すべきことには、試験したすべてのDIPG株が、腫瘍試料においてPPM1D切断型変異と共存する場合の多い内因性のヒストン3 K27M変異を保有していた(図10Aおよび10E)。H3.1またはH3.3 K27M変異を全体的なDNA低メチル化と関連づける以前の報告にもかかわらず、本発明者らの結果は、PPM1Dの切断変化が実際にこの効果を克服し、代わりにゲノムのCpGアイランドの過剰メチル化を駆動し得ることを示唆する。
次に、変異PPM1D誘導性のNAMPT阻害剤感受性がインビボで再現され得るかどうかを試験した。NOD scid γ (NSG) マウスに親細胞およびPPM1Dtrnc.細胞の両方を皮下注射し、生物発光イメージング (BLI) を用いて腫瘍増殖をモニターした。親アストロサイトは6ヶ月後に腫瘍を形成することができなかったが、PPM1Dtrnc.アストロサイトの側腹部注射は、30日以内に腫瘍形成をもたらした。著しくは、これらのマウスをFK866で処置すると、3週間後に腫瘍量の急速な減少(変化倍率=4.93、マン・ホイットニーのU検定によりp=0.0003)が誘導された(図12Aおよび12B)。これらのデータは、FK866による処置後の最終的な腫瘍質量が媒体単独に対して実質的により少ないこと(変化倍率=3.1、マン・ホイットニーのU検定によりp<0.0001)と相関した(図12C)。PPM1Dtrnc.異種移植片のサイズおよび増殖速度により、代替の測定技法の使用が制限されるため、連続移植されたPPM1D変異アストロサイト異種移植片モデルを作製した。これらのPPM1D変異異種移植片は、側腹部注射の12日以内に測定可能な腫瘍を形成し(図12D)、急速に増殖し、よって直接的な腫瘍体積を評価することが可能になる。これらのマウスをFK866で処置すると、媒体対照と比較して、ノギスおよびBLIの両方により測定して、全体の腫瘍サイズが大幅に減少し(変化倍率=17.1、マン・ホイットニーのU検定によりp<0.0002)(図4A;図12E)、腫瘍増殖が有意に遅延した(ログランク(マンテル・コックス)検定によりp<0.0001)(図4B)。U2OS細胞株の異種移植でも同様の結果が得られ、この場合もやはりFK866処置に対する有意な感受性を示した(変化倍率=5.86、マン・ホイットニーのU検定によりp<0.000l)(図13A)。重要なことには、NAMPT阻害剤は用量関連性の毒性と関連づけられているため、投薬スケジュール全体を通して、試験におけるすべてのマウスの健康状態および体重を追跡したところ、その期間中に治療群間で体重に有意差は検出されなかった(図13B)。全体として、本発明者らのデータは、インビトロでFK866を用いて見られた合成致死を強く支持し、PPM1D変異腫瘍の処置のためのNAMPT阻害剤の潜在的有効性を実証する。
Claims (12)
- 少なくとも1種類のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAMPT) 阻害剤を対象に投与し、それによってがんを処置する段階
を含む、対象のがんを処置する方法であって、
対象のがんから採取された生検試料において、プロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D (PPM1D)が上昇している、前記方法。 - 対象から採取されたがん細胞試料において、参照レベルと比較して上昇したレベルのPPM1Dを検出する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- がんが、PPM1D遺伝子における1つまたは複数の変異を含む、請求項1または2に記載の方法。
- PPM1DがC末端切断変異を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1種類のNAMPT阻害剤が、OT-82、KPT-9274、FK866、GNE-618、LSN-3154567、FK866、STF31、GPP78、およびSTF118804からなる群より選択される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- がんが、乳がん、卵巣がん、消化器がん、脳がん、髄芽腫、または小児神経膠腫である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1種類の付加的なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD) 枯渇処置を対象に施す段階をさらに含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 付加的なNAD枯渇処置が、テモゾロミド、エトポシド、イリノテカン、および放射線療法からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 補足的なニコチンアミドを対象に投与する段階をさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 有効量のNAMPT阻害剤が、少なくとも1種類の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物の状態で対象に投与される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が哺乳動物である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
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